DE69713596T2

DE69713596T2 - Antipsoriatische zusammensetzungen enthaltend einen extrakt von asphodelus, verfahren zur herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69713596T2
Application number: DE69713596T
Authority: DE
Inventors: Marzook Moady
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: IL126097A0; US5852060A; AU721199B2; AU2334997A; CA2249458A1; CA2249458C; WO1997034568A2; IL126097A; US5955081A; BR9708239A; WO1997034568A3; EP1166791A2; ATE219682T1; USRE39199E1; EP1166791A3; DE69713596D1; EP0906114B1; EP0906114A2

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Hautbehandlungszusammensetzungen, ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen und eine Methode zur Anwendung der Zusammensetzungen bei der Hautbehandlung. Nach einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antipsoriasiszusammensetzungen, ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen und eine Methode zur Anwendung der Zusammensetzungen zur Psoriasisbehandlung. Nach noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Hautbehandlungszusammensetzungen pflanzlichen Ursprungs, ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen und eine Methode zur Anwendung der Zusammensetzungen zur Hautbehandlung.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Psoriasis ist ein chronischer Hautzustand, der durch juckende, schuppige Haut gekennzeichnet ist. Es wird angenommen, dass zwei Prozent der Bevölkerung der Vereinigten Staaten, mehr als vier Millionen Menschen, während ihres Lebens an Psoriasis leiden. Der Psoriasiszustand kann von schwach bis heftig variieren.
In den Vereinigten Staaten treten jedes Jahr zwischen etwa 150 000 und 250 000 neue Fälle von Psoriasis auf, wobei etwa 40 000 dieser Fälle als heftig eingeordnet werden. Personen, die an Psoriasis leiden, müssen nicht nur die reizende Erkrankung selbst ertragen, sondern auch die Verlegenheit infolge Hautentstellung.
Die gesamten jährlichen Kosten für die Behandlung von Psoriasis auf ambulanter Basis werden mit mehr als 1,5 Billionen Dollar geschätzt. Es wird angenommen, dass Psoriasispatienten im Durchschnitt $ 500,00 je Jahr für Psoriasisbehandlung ausgeben, um nur einen temporäre Erleichterung zu erzielen. Ernsthafte Fälle, die Krankenhauseinweisung erfordern, können Kosten von bis zu $ 10.000,00 ergeben.
Die Verbindung 3-Methylanthralin wird seit langem bei der Behandlung von Psoriasis benutzt und ist in dem Merck-Index als ein antipsoriatisches Mittel aufgeführt. Chrysarabin ist ein Gemisch von Verbindungen, die sich von Goa-Pulver herleiten, und enthält 3- Methylanthralin. Goa-Pulver selbst stammt aus dem Holz und der Rinde von Andria Araroba aguiar (Familie der Leguminosen). Literatur, die die Isolierung und die Struktur von Chrysarobin beschreiben, gehen zurück bis zu den frühen 1800-Jahren. Ein Verfahren zur Reduzierung von Chrysarobin, um 3-Methylanthralin zu erhalten, ist seit 1931 bekannt.
Bekannte Psoriasisbehandlungen schließen folgende ein: Antimetaboliten, wie Methotrexat, Corticosteroide, wie Triamcinoloncreme oder -injektion, Clobeasolpropinatcreme und Hydrocortison, keratolytische/abbauende Mittel, wie Anthralin oder Salicylsäure, Schmiermittel, wie hydrierte Pflanzenöle und weißes Rohöl, orale Retinoide, wie Etretinat- oder Isotretinoin- Tabletten, Photochemotherapie, wie Methoxsalen- oder Trioxsalen-Kapseln und Kohleteer sowie örtliche Cholecalciferolanaloge, wie Calcipotrien-Salbe, ein örtliches Vitamin D3, im Handel bekannt als Dovonex® (Squib, Buffalo, NY).
Zahlreiche pflanzliche Vorschriften für die Behandlung von Psoriasis sind bekannt, einschließlich der Verwendung von Extrakten verschiedener Pflanzen, Wurzeln, Samen, Blüten, Beeren und Zweige. Siehe Therapeutisches pflanzliches Protokoll für Psoriasis, Protocol Journal of Botanical Medicines, August 1994, Seiten 1 bis 38.
Eine Zusammensetzung für die Behandlung von Verbrennungen und Erythem wurde in der CH-A-671 336 beschrieben, wobei die Zusammensetzung Asphodelus verus albus- Wurzelextrakt und vier andere Pflanzenarten einschließt.
Die bekannten Psoriasisbehandlungen leiden jedoch an ein oder mehreren Nachteilen einschließlich möglicher toxischer Nebenwirkungen und der Erzielung nur temporärer Erleichterung. So besteht ein Bedarf an verbesserter Psoriasisbehandlung.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung und Methode zur Behandlung von Psoriasis zu liefern.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 3- Methylanthralin zu bekommen.
Es ist noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Chrysophanol zu erhalten.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von Aloe-Emodin zu bekommen.
Es ist ein weiteres Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von Aloe-Emodinmonoacetat zu bekommen.
Ein weiteres Ziel ist es, eine Zusammensetzung zu erhalten, die aus einer botanischen Probe extrahiert wurde, welche bei der Behandlung von Psoriasis Wirksamkeit besitzt.
Ein anderes Ziel ist es, eine solche Zusammensetzung mit mehreren Polyphenolen darin zu erhalten.
Es ist ein weiteres Ziel, ein Verfahren zur Behandlung von Psoriasis mit einer solchen Zusammensetzung zu bekommen.
Noch ein anderes Ziel ist es, ein Verfahren zum Extrahieren einer solchen Zusammensetzung aus der botanischen Probe zu erhalten.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch die Zusammensetzung und Methoden der vorliegenden Erfindung erreicht.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes umfasst, welches wenigstens eine der Verbindungen 3- Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe-Emodinmonoacetat enthält, und Wurzeln der Pflanze Asphodelus microcarpus mit Essigsäure unter Bildung des Produktes behandelt. Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens schließt die Gewinnung von 3-Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin oder Aloe-Emodinmonoacetat aus dem Produkt ein. Irgendwelche der Produkte könne weiter derivatisiert werden.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren, in dem jede der Verbindungen 3-Methylanthralin, Chrysophanol oder Aloe- Emodin durch Gewinnung der erwünschten Verbindung aus der Wurzel der Pflanze Asphodulus microcarpus erhalten wird. Die Polyphenole können weiter derivatisiert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Wiedergabe des analytischen Fraktionierungsschemas, das in Beispiel 4 benutzt wird.
Fig. 2 zeigt die Spitzenanwendungen, die benutzt werden, um die Daten der Tabelle 3 für die XAD-2-Harz-DCM-Eluatfraktion 23 zu erzeugen.
Fig. 3 bzw. Fig. 4 zeigen die Massenspektrometriedaten mit direkter Sonde (DP) und die Massenspektrometriedaten (LSIMS) mit Flüssigkeit und Sekundärionen, wobei diese Daten zu der XAD-2-Harz-DCM-Eluatfraktion 23 in Fig. 1 gehören.
Fig. 5 Fig. 6 bzw. Fig. 7 zeigen ein GC-MS-Chromatogramm, DP-Daten und LSIMS-Daten für die chemische Zusammensetzung von DCM-unlöslicher Fraktion 26 von XAD-2-Harz- MeOH-Eluat von Fig. 1.
Fig. 8 Fig. 9 bzw. Fig. 10 zeigen ein GC-MS-Chromatogramm, DP-Daten und LSIMS-Daten für die XAD-2- Harz-MeOH-Eluat-DCM-unlösliche Fraktion 29 von Fig. 1.
Fig. 11 Fig. 12 bzw. Fig. 13 zeigen ein GC-MS-Chromatogramm, DP-Daten und LSIMS-Daten für die Carbonsäurefraktion 28.
Fig. 14 zeigt GC-MS-Chromatogrammdaten der methylierten Carbonsäuren von Beispiel 5.
Fig. 15 Fig. 16 bzw. Fig. 17 zeigen ein GC-MS-Chromatogramm, DP-Daten und LSIMS-Daten für die neutrale/Phenolfraktion 36 von Fig. 1
Fig. 18 bis Fig. 23 zeigen jeweils GC-MS-Chromatogramme, DP-Daten und LSIMS-Daten für das neutrale/Phenolfraktions-DCM-Kieselgeleluat und das neutrale/Phenolfraktions- MeOH-Kieselgeleluat.
Fig. 24 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen der Behandlungslösung des Beispiels 2 auf HNF in Fibroblasten zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In der Praxis der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung aus der Pflanze Asphodelus microcarpus gewonnen, die Verbindungen umfasst, welche bei der Behandlung von Säugetierhauterkrankungen, besonders Psoriasis, brauchbar sind. Asphodelus microcarpus ist eine Pflanze, die im mittleren Osten vorkommt. Speziell kann sie leicht in den nördlichen Bereichen von Israel gefunden werden wie auch in Regionen von den kanarischen Inseln bis Kleinasien
In der Praxis der vorliegenden Erfindung wird die Wurzel von Asphodelus microcarpus benutzt. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Wurzeln oder Teile davon verabreicht werden, um solche Tierhauterkrankungen zu behandeln. Vorzugsweise wird bei einer solchen Behandlung die Außenhaut der Wurzel zunächst entfernt, und dann wird der innere Bereich der Wurzel auf den angegriffenen Hautbereich gelegt. Zusätzlich kann Rohextrakt aus den Wurzeln auch auf den angegriffenen Hautbereich aufgebracht werden.
Es ist in der Praxis der vorliegenden Erfindung verständlich, dass die Wurzeln von Asphodelus microcarpus zu irgendeiner Zeit geerntet werden können. Es ist jedoch bevorzugt, dass die Wurzeln zu einem Zeitpunkt geerntet werden, an dem sie voll von Flüssigkeit sind, was für in Israel wachsenden Asphodelus microcarpus allgemein von Februar bis Mai ist.
Die Präparierung der Wurzeln von Asphodelus microcarpus ist allgemein die folgende. Überschüssiger Schmutz und andere Fremdstoffe sollten von den Wurzeln, allgemein durch Schütteln und Waschen mit Wasser, entfernt werden. Dies kann durch Verwendung eines Kratzers, Messers, einer Schälvorrichtung, wie eines Kartoffelschälers, oder dergleichen erfolgen.
Die nächste Stufe ist die, Flüssigkeit aus den Wurzeln zu extrahieren. Verfahren zum Erhalten von Flüssigkeit aus einem komprimierbaren flüssigkeitshaltigen Feststoff sind dem Fachmann bekannt, und es kann irgendeine Methode angewendet werden. Einfache Methoden schließen ein Anmaischen, Abquetschen, Pulverisieren, Verflüssigen oder Komprimieren der Wurzeln ein. Die Wurzeln werden vorzugsweise in einem handelsüblichen "Entsafter" verflüssigt.
Die so erhaltene Flüssigkeit wird mit Essigsäure vermischt. Allgemein liegt für diese Stufe das Volumenverhältnis von Asphodelus microcarpus-Wurzelsaft zu Essigsäure im Bereich von etwa 1 : 20 bis etwa 20 : 1. Vorzugsweise liegt das Volumenverhältnis im Bereich von etwa 1 : 10 bis etwa 10 : 1, stärker bevorzugt im Bereich von etwa 1 : 5 bis etwa 5 : 1, noch stärker bevorzugt bei etwa 4 : 1.
Die Wurzelflüssigkeit von Asphodelus microcarpus wird als nächstes mit Essigsäure bei einer Temperatur vermischt, die zur Erzeugung eines Gemisches von 3-Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe-Emodinmonoacetat geeignet ist. Es ist bevorzugt, dass das Mischen mit beiden, der Wurzelflüssigkeit von Asphodelus microcarpus und Essigsäure im flüssigen Zustand, erfolgt. So liegt die Kontakttemperatur oberhalb des Gefrierpunktes, aber unterhalb des Siedepunktes für das Gemisch.
Gegebenenfalls kann in der Praxis der vorliegenden Erfindung Schwefel mit der Wurzel von Asphodelus microcarpus und Essigsäure zugemischt werden. Der Schwefel kann in irgendeiner geeigneten Form vorliegen, wird jedoch vorzugsweise vermahlen und noch stärker bevorzugt zu einer mehlartigen Konsistenz vermahlen.
Das Gemisch von Asphodelus microcarpus-Wurzel/Essigsäure umfasst 3- Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe-Emodinmonoacetat und wurde bei der Behandlung von Psoriasis als brauchbar gezeigt. Obwohl dieses Gemisch hier als von der Asphodelus microcarpus-Wurzel herleitbar gezeigt wird, wird dies so verstanden, dass das 3- Methylanthralin, Chrysophanol und Aloe-Emodin nach den Methoden erhalten werden können, die in der Technik bekannt sind. Aloe-Emodinmonoacetat kann durch Behandlung von Aloe- Emodin mit Essigsäure hergestellt werden.
3-Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe-Emodinmonoacetat können einzeln aus dem Gemisch unter Verwendung von Trenntechniken gewonnen werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Behandlungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann einen weiten Bereich der Polyphenolkomponenten und/oder ihrer Derivate einschließen. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Psoriasis kann die Zusammensetzung einem Säugetierorganismus auf irgendeinem bekannten Weg verabreicht werden. Nichtbeschränkende Beispiele geeigneter Verabreichungswege sind oral, parenteral, örtlich usw. Spezielle, nichtbeschränkende Beispiele zur Durchführung solcher Verabreichungswege schließen Injektion, iv- Verabreichung, Pillen, Tabletten, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Cremes, Salben, Shampoos, Hautpflaster, inhalierte Aerosole, Sprühflüssigkeiten, Suppositorien und dergleichen. ein. Örtliche Verabreichung ist für menschliche Psoriasis bevorzugt.
Die Verabreichungshäufigkeit variiert mit der Stärke der Zusammensetzung, doch umfasst eine beispielhafte Behandlung eine örtliche Aufbringung je Tag, bis die Symptome verschwunden sind. Der Verlauf der Behandlung hängt natürlich von der Stärke des Befalls ab und kann 14 Tage bis zu 56 Tagen dauern, obwohl dies nicht als Begrenzung angesehen werden soll.
Die vorliegende Erfindung ist als geeignet für die Behandlung von Menschen wegen Psoriasis beschrieben, was so verstanden werden soll, dass es exfoliative psoriatische Dermatitis, Pusteln verursachende Psoriasis und Tröpfchen bildende veränderliche Psoriasis einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sein soll.
Es wird auch angenommen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung anderer Hauterkrankungen und -zustände einschließlich Ekzemen brauchbar sind.
Zusätzlich zur Verwendung bei der Behandlung von Hauterkrankungen dürften die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch bei der Behandlung von psoriatischer Arthritis brauchbar sein.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung der Erfindung und sollen nicht den Erfindungsumfang in irgendeiner Weise beschränken.

Beispiel 1

Gewinnung von Rohextrakt

Rohextrakt wurde aus der Asphodelus microcarpus-Pflanze folgendermaßen erhalten. Etwa 0,453 kg (1 lb) Wurzeln der Pflanze wurden von einer Stelle in Israel erhalten. Schmutz und andere Fremdstoffe wurden durch Schütteln und dann durch Waschen mit Wasser von den Wurzeln entfernt, wonach die Außenhaut derselben entfernt wurde. Flüssigkeit wurde aus den geschälten Wurzeln unter Verwendung eines handelsüblichen "Entsafters" extrahiert. Die 0,453 kg (1 lb) Wurzeln ergaben etwa 300 ml Rohextrakt.

Beispiel 2

Herstellung von Behandlungslösung

Etwa 650 ml (etwa 400 bis 800 ml sind üblich in Abhängigkeit von der Stärke des Befalls) des Rohextraktes, der nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhalten wurde, etwa 350 ml (obwohl 200 bis 600 ml üblich Sind) Essigsäure und etwa ein Teelöffel Schwefel auf mehlartige Textur vermahlen, wurden miteinander vermischt. Dieses Gemisch erfordert keine Kühlung, obwohl der Rohextrakt gekühlt werden sollte, bis die Essigsäure eingeführt ist, wenn er in ungemischtem Zustand gehalten wird.

Beispiel 3

Analyse der Behandlungslösung

Die Behandlungslösung des Beispiels 2 wurde verschiedenen Arten von chemischen und physikalischen Analysen unterzogen, deren Ergebnisse in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.

Tabelle 1

Näherungsweise Analysendaten*

Physikalische Probenbeschreibung Dunkelbräune Flüssigkeit, die Sediment und suspendierte feine Teilchen enthielt, essigsäureartiger Geruch

pH (wie erhalten) 1,95
Essigsäuregehalt (durch Titration) 5,05% Gew./Gew.
unlösliche Stoffe 2,14% Gew./Gew.
Aschegewicht (Mineralgehalt) 0,746% Gew./Gew.
spezifisches Gewicht (Filtrat) 1,103 g/ml
gelöste Gesamtfeststoffe (Filtrat) 12,94% Gew./Gew.
mit Chloroform extrahierbares (Filtrat) (organische lösliche Komponenten) 0,84% Gew./Gew.
Analyse durchgeführt von Stillwell & Gladding Testing Laboratories, Inc., New York, NY Tabelle 2 Elementen-/Schwermetallzusammensetzung*
* Die Elementen/Schwermetallanalyse wurde von Umpire and Control Services, Inc., West Babylon, NY durchgeführt.

Beispiel 4

Fraktionierung von Behandlungslösung

Die Lösung des Beispiels 2 wurde auch einer Analyse unterzogen. Da die Lösung des Beispiels 2 zu komplex für direkte Analyse war, wurde sie gemäß dem in Fig. 1 angegebenen Schema unter Verwendung einer Kombination von nassanalytischer Chemie, Säulenchromatographie und Lösungsmittelextraktion fraktioniert. Bei der gesamten analytischen Fraktionierung wurden Isolate einem Zellkultur-Bioassay unterzogen, wie in Beispiel 6 beschrieben. Fraktionen, deren Test positiv in dem Zellkultur-Bioassay war, wurden dann zu einer weiteren Trennung und/oder chemischen Charakterisierung zugeführt, bis nahezu reine Isolate erhalten wurden.
Eine 500 g-Probe 10 der Behandlungslösung von Beispiel 2 wurde durch einen Buchner-Trichter filtriert, der Filterpapier Whatman Nr. 1 und ein Bett in einem 1 cm-Volumen von analytischer Filterhilfe Celite* enthielt. Das Filtrat 12 (485 g, 97% der Ursprungsprobe) war in dem Test positiv in dem Zellkultur-Bioassay und in der Stärke äquivalent der unfiltrierten Behandlungslösung von Beispiel 2. Das Filterretentat 14 (14,6 g, 2,92%) war ein dunkles rotbraun gefärbte Material mit einer tonartigen Konsistenz. Diese Substanz war in dem Zellkultur- Bioassay negativ. Analyse dieses Sediments zeigte, dass es großenteils aus Rohrzucker, komplexen Kohlehydraten, Cellulosebruchstücken, Lignin, anorganischen Mineralien und Ton bestand.
Das Filtrat wurde dann durch eine vorkonditionierte chromatographische Säule geschickt, die mit einem Bettvolumen von 20 · 350 mm von XAD-2-Harz gepackt war. (Supelcopak-2®-Absorbens) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min. XAD-2-Harz ist ein hydrophobes poröses Polymerabsorbens auf der Grundlage von Styrol-Divinylbenzol-Copolymer. Dieses Harz hat eine hohe Affinität für Absorbieren nichtpolarer, organisch löslicher Komponenten aus wässrigen Lösungen. Die Säule wurde durch Waschen mit 1,0 l Dichlormethan (DCM), gefolgt von 1,0 l Methanol (MeOH) und schließlich 1,0 l destilliertem, entionisiertem Wasser vorkonditioniert. Alle Lösungsmittel hatten ultrahohe Reinheit mit einer "kapilfaranalysierten" Qualität, geeignet für chemische Analysen mit Spurenkonzentrationen. Das in der gesamten Analyse erhaltene destillierte Wasser wurde aus einem Milli-Q®-Reinigungssystem erhalten. Es war doppelt destilliert in Glas und dann weiter gereinigt, indem es durch Ionenaustausch- und aktivierte Kohlefilter geschickt wurde. Nachdem das Filtrat durch das XAD-2-Harz gegangen war, wurde die Säule mit 2 l destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser 15 aus der XAD-2-Harzsäurle ergaben einen negativen Text im Zellkultur-Bioassay und wurden verworfen. Diese dunkelbraun gefärbte Fraktion enthält die wasserlöslichen Verbindungen der Behandlungslösung, wie Essigsäure, Zucker, niedermolekulare polare organische Säuren, Tannine und andere biologisch inerte Komponenten.
Die XAD-2-Harzsäule, die das Retentat 18 der Behandlungssäule enthielt, wurde trockengeblasen, um so viel des Restwaschwasser wie möglich zu entfernen. Die organisch löslichen Komponenten der Behandlungslösung wurden dann aus der Säule mit 2,0 l MeOH und anschließend 2,0 l DCM eluiert. MeOH und DCM XAD-2-Harzeluate wurden getrennt aufgefangen. XAD-2-Harz-MeOH-Eluat 21 der Behandlungslösung ergab 4,6 g, was 0,92% der ursprünglichen Behandlungslösung auf Gewichtsbasis entspricht. Das Eluat war bernsteinfarbig. Das XAD-2-Harz-DCM-Eluat 23 der Behandlungslösung enthielt 0,51 g oder 0,1% der Ursprungsprobe. Dieses Eluat war hellgelb gefärbt. Beide dieser Fraktionen ergaben einen positiven Test in dem Zellkultur-Bioassay. Höhere Aktivität wurde jedoch in dem XAD-2-Harz-MeOH- Eluat der Behandlungslösung beobachtet. Daher wurde dieses Isolat weiterer Fraktionierung unterzogen.
Das XAD-2-Harz-MeOH-Eluat 21 der Behandlungslösung wurde zur Trockene in einem Rundbodenkolben unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei reduzierter Temperatur und reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand war eine dunkelrote kristalline Substanz. Der Rückstand wurde in 200 ml DCM aufgelöst, wobei man eine bernsteinfarbige Lösung erzeugte. Es war jedoch nicht der gesamte Rückstand in DCM löslich. Die DCM-unlöslichen Materialien wurden dann in 100 ml MeOH aufgelöst. Die methanollöslichen Komponenten hatten eine dunkelrote Farbe. So wurden zwei zusätzliche Fraktionen hergestellt. Die XAD-2-Harz- MeOH-Eluat-DCM-lösliche Fraktion 25 der Behandlungslösung enthielt 1,7 g (0,34%), und die XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-unlösliche Fraktion der Behandlungslösung ergab 2,9 g (0,58 %). Beide Fraktionen ergaben einen positiven Test in dem Zellkultur-Bioassay.
Die XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-lösliche Fraktion 40 der Behandlungslösung enthält organisch lösliche, neutrale phenolische und saure Komponenten. Sie wurde sechsmal mit Anteilen von 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert, um die Carbonsäurefraktion zu entfernen. Der gesättigte Natriumbicarbonatextrakt 28 wurde auf pH 2,0 unter Verwendung von 1 N HCl angesäuert und dann sechsmal mit Anteilen von 50 ml DCM extrahiert, um die Carbonsäuren in die organische Phase zu trennen. Die Carbonsäurefraktion 33 der Behandlungslösung enthielt 166 mg (0,03%) und war schwach positiv in dem Zellkultur-Bioassay. Der Anteil hatte ein bernsteinfarbiges Aussehen.
Die XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-lösliche Fraktion in der Behandlungslösung enthielt nach der Extraktion der Carbonsäuren 1,52 g oder 0,30% der ursprünglichen Probe. Dieses Isolat 31 wurde als "neutrale/Phenolfraktion" der Behandlungslösung auf der Grundlage ihrer chemischen Zusammensetzung bezeichnet. Sie ergab ein stark positives Ansprechen in dem Zellkultur-Bioassay. Nach dem Kühlen wurde bei dieser Fraktion beobachtet, dass sie eine gelborangefarbige kristalline Ausfällung bildet. Die Ausfällung wurde durch Filtration durch einen Gooch-Schmelztiegel vom Sinterglastyp filtriert. Die Ausfällung 36 wurde aus der neutralen/Phenolfraktion nach dem Extrahieren von Säuren isoliert und ergab 186 mg (0,04%) hellgelborangefarbige Kristalle. Dieses Isolat erwies sich als die Fraktion mit höchster Aktivität in dem Zellkultur-Bioassay. Die neutrale/Phenolfraktion 38 enthielt nach dem Ernten der kristallinen Ausfällung 1,33 g (0,27%). Diese Probe war auch im Test in dem Zellkultur-Bioassy stark positiv.
Einige weitere Unterfraktionen wurden aus den obenbeschriebenen Isolaten hergestellt. Ein Teil der Behandlungslösung-Carbonsäurefraktion wurde mit Diazomethanreagens methyliert, um die entsprechenden Methylester der Probe zu erzeugen. Dies erfolgte, um die Flüchtigkeit der Säuren zu erhöhen, um die gaschromatische Trennung zu verbessern. Die XAD-2- Harz-MeOH-Eluat-DGM-unlösliche Fraktion der Behandlungslösung wurde mit 1 N HCl während 4 h bei 100ºC hydrolysiert, um konjugierte Verbindungen glycosidisch auseinanderzubrechen. Die neutrale/Phenolfraktion 29 der Behandlungslösung wurde nach der Ausfällungsgewinnung zusätzlicher Minisäulenfraktionierung unter Verwendung einer Kieselgel- Festphasenextraktionssäule unterzogen. Diese Verfahren sind in weiteren Einzelheiten in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 5

Chemische Charakterisierung der Fraktionen von Beispiel 4

Die nichtflüchtigen Komponenten dieser Fraktionen wurden durch eine Kombination von Elektronionisierung, direkte Sondenmassenspektrometrie (DP-Daten) und durch eine Technik mit hoher Masse, flüssige Sekundärionenmassenspektrometrie (LSIMS-Daten) analysiert.
Die chemische Zusammensetzung der XAD-2-Harz-DCM-Eluatfranktion 23 ist in Tabelle 2 mit Peakeingliederung entsprechend dem GC-MS-Chromatogramm, das in Fig. 2 gezeigt ist, wiedergegeben. Die DP- und LSIMS-Spektren, die zu der XAD-2-Harz-DCM-Eluatfraktion 23 gehören, sind in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt. Eine homologe Reihe von nichtflüchtigen Verbindungen mit Molekulargewichten 474, 490, 506 und 508 wurden in den DP-Daten festgestellt. Genaue Massenmessungen wurden bei diesen Peaks unter Verwendung von Massenspektroskopie hoher Auflösung (R = 10 000) durchgeführt, um ihre Elementenformeln zu bestimmen. Die empirischen Formeln für diese Verbindungen fand man mit C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub2;O&sub1;&sub1; (474 Mol.Gew.), C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub2;O&sub1;&sub2; (490 Mol.Gew.), C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub2;O&sub1;&sub3; (506 Mol.Gew.) Und C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub4;O&sub1;&sub3; (508 Mol.Gew.) In anderen verwandten Fraktionen wurden auch Homologe mit Molekulargewichten von 478 und 492 beobachtet. Genaue chemische Strukturen für diese Verbindungen sind unbekannt. Ihre Elementenformeln jedoch und ihre Massenspektralfragmentierungsbilder zeigen an, dass sie eine Klasse von chemischen Polyphenolverbindungen sind, die Bisflavanoide genannt werden.
Die chemische Zusammensetzung von XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-unlöslicher Fraktion 26 ist in Tabelle 4 zusammengestellt. Das GC-MS-Chromatogramm, die DP-Daten und LSIMS-Daten, die zu dieser Fraktion gehören, sind in den Fig. 5, 6 und 7 wiedergegeben. Das meiste dieser Fraktion war nicht flüchtig, und so machen die beschriebenen GC-MS-Peaks nur einen kleinen Anteil dieser Probe aus. Der Hauptteil der Masse in dieser Fraktion besteht aus hochmolekularen nichtflüchtigen Verbindungen. Die DP-Daten zeigen relativ spurenmäßige Gehalte von verschiedenen Bisflavanoiden. Die LSIMS-Daten zeigen ein komplexes Gemisch von Verbindungen hoher Masse im Bereich von 300 bis 1000, die in dieser Fraktion vorliegen. Diese Fraktion besteht hauptsächlich aus "gebundenen" Verbindungen, wie Glycosiden (an Zuckermoleküle gebundene phenolische Verbindungen) und anderen polaren, hochmolekularen Konjugaten. Diese Fraktion wurde mit HCl und Hitze aufgeschlossen, um die Konjugate zu kleinen Molekülen zu hydrolysieren, die dann identifiziert werden konnten.
Die Daten bei der hydrolysierten XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-unlöslichen Fraktion 29 sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Das GC-MS-Chromatogramm, die DP-Daten und LSIMS- Daten für diese Fraktion sind in den Fig. 8, 9 bzw. 10 gezeigt. Merke, dass die Verbindungen in der Tabelle 3, die nach der Hydrolyse auftreten, alle als gebundene Komponenten in der ursprünglichen Fraktion vorliegen. Tabelle 3 Chemische Zusammensetzung der XAD-2-Harz-DCM-Eluatfraktion 23 von Fig. 1
DP = Daten aus Elektronenionisierungsdirekteinsetzsonde
LSIMS = Flüssigkeitssekundärionenmassenspektrometrie Tabelle 4 Chemische Zusammensetzung der XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM-unlöslichen Fraktion (Fraktion 26 von Fig. 1)
DP = Daten aus Elektronenionisierungsdirekteinsetzsonde, Rohdaten Akte FM 10647
LSIMS = Flüssigkeitssekundärionenmassenspektrometriedaten, Akte VG2268 Tabelle 5 Chemische Zusammensetzung der hydrolysierten XAD-2-Harz-MeOH-Eluat-DCM- unlöslichen Fraktion (Fraktion 29 von Fig. 1)
DP = Daten aus Elektronenionisierungsdirekteinsetzsonde, Rohdaten Akte FM10827
Die Daten der Carbonsäurefraktion 28 sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Das GC-MS- Chromatogramm, die DP-Daten und LSIMS-Daten, die zu dieser Fraktion 28 gehören, sind in den Fig. 11, 12 und 13 wiedergegeben. Carbonsäurefraktionen enthalten oftmals nichtflüchtige Verbindungen, die nicht leicht durch die Gaschromatographie gehen. Diese Verbindungen können zu flüchtigeren Formen unter Verwendung von Methylierungs- und Silylierungsreagentien chemisch derivatisiert werden. Daher wurde die Carbonsäurefraktion 28 unter Verwendung von frisch bereitetem Diazomethanreagens methyliert. Dieses Verfahren wandelt die Carbonsäuren in ihre entsprechenden Methylester um. Phenole werden in Methylether umgewandelt. Die Methylester und Methylether sind flüchtiger und geeigneter für die Chromatographie als die freien Säuren.
Das GC-MS-Chromatogramm der methylierten Carbonsäuren ist in Fig. 14 gezeigt. In der methylierten Probe wurden keine zusätzlichen Verbindungen gefunden. Sämtliche Verbindungen, die in der underivatisierten Carbonsäurefraktion beobachtet wurden, wurden als ihre methylierten Gegenstücke gefunden.
Tabelle 7 stellt die chemische Zusammensetzung des gelben Niederschlages zusammen, welcher aus der neutralen/Phenolfraktion 36 nach Extraktion der Carbonsäuren isoliert wurde. Diese Fraktion, die relativ wenige Komponenten enthält, besitzt den höchsten Aktivitätsgrad in dem Zellkulturbioassay. Das GC-MS-Chromatogramm, die DP-Daten und LSIMS-Daten; die zu dieser Fraktion gehören, sind in den Fig. 15 bis 17 gezeigt. Tabelle 6 Chemische Zusammensetzung der Carbonsäurefraktion (Fraktion 28 in Fig. 1)
DP = Daten aus Elektronenionisierungs-Direkteinsätzesonde, Rohdaten Akte FM10648
LSIMS = Flüssigkeitssekundärionenmassenspektrometrie, Datenakte VI32267 Tabelle 7 Chemische Zusammensetzung der Ausfällung der neutralen/Phenolfraktion nach Extraktion von Säuren (Fraktion 36 von Fig. 1)
DP = Daten aus Elektronenionisierungs-Direkteinführungssonde, Rohdaten Akte FM 10644
LSIMS = Flüssigkeitssekundärionenmassenspektrometrie, Datenakte VG2270
Die neutrale/Phenolfraktion war nach der Extraktion von Carbonsäuren und Ernte des gelben Niederschlages noch zu komplex für direkte Analyse. Daher wurde sie zusätzlicher Fraktionierung unter Verwendung eines Kieselgel-Festphasenextraktions-Minisäulenverfahrens unterzogen. Die Fraktion wurde durch die Kieselgelsäule geführt und mit DCM gewaschen. Eine zweite polare Fraktion wurde dann unter Verwendung von Methanol aus der Säule eluiert. Aus den ursprünglichen 1,32 g der neutralen/Phenolfraktion wurden 0,73 g (0,15% des ursprünglichen Rohextraktes) in dem DCM-Eluat und 0,59 g (0,12%) in dem MeOH-Eluat gewonnen. Daher wurde die neutrale/Phenolfraktion nach Extraktion von Carbonsäuren und Ernten von gelbem Niederschlag in zwei weitere Unterfraktionen für die Analyse aufgespalten. Diese wurden als neutrale/Phenolfraktions-DCM-Kieselgeleluat bezeichnet, und die neutrale/Phenolfraktion MeOH wurde als Kieselgeleluat bezeichnet. Die chemischen Zusammensetzungen dieser beiden Fraktionen sind in den Tabellen 8 und 9 zusammengestellt. Die GC-MS- Chromatogramme, DP-Daten und LSIMS-Daten, die zu diesen beiden Fraktionen gehören, sind in den Fig. 17 bis 22 gezeigt. Tabelle 8 Chemische Zusammensetzung des neutralen/Phenolfraktions-Kieselgel-MeOH-Eluats
DP = Daten aus Elektronenionisierungs-Direkteinführungssonde, Rohdatenakte FM10650
LSIMS = Flüssigkeitssekundärionenmassenspektrometrie, Datenakte VG2265 Tabelle 9 Chemische Zusammensetzung des neutralen/Phenolfraktions-Kieselgel-DCM-Eluats
DP = Daten aus Elektronenionisations-Direkteinführungssonde, Rohdatan Akte FM 10649
LSIMS = Flüssigkeitssekundärioenmasssenspektrometrie, Daktenakte VG2266
Die aus allen Fraktionen des Beispiels 4 erhaltenen Daten wurden zusammengeworfen und normalisiert, um eine übersichtliche Zusammenstellung zu bekommen. Diese Daten sind in den Tabellen 10A bis 10F zusammengefasst, welche die chemische Zusammensetzung der organisch löslichen Fraktion beschreiben, die ungefähr 1% der Behandlungslösung auf Basis Gewicht/Gewicht ausmacht, aber 100% der biologischen Aktivität enthält. Die Verbindungen in dieser Tabelle sind durch die chemische Klasse miteinander in Gruppen eingeteilt. Es sollte bemerkt werden, dass die quantitativen Daten (Gew./Gew.-%) in dieser und den anderen Tabellen nicht exakt, sondern eher halbquantitativ sind. Die Daten wurden aus einer Kombination von GC-Flächenprozentintegrierungen und aus gravimetrischen Bestimmungen hergeleitet, die während der gesamten Fraktionierung gemacht wurden. Höher genaue Quantifizierungsdaten wären nur möglich, wenn analytische Bezugsstandards für alle ermittelten Verbindungen verfügbar wären, so dass Detektoransprechfaktoren bestimmt und die Daten eingestellt werden könnten. Tabelle 10A Datenzusammenstellung: Zusammensetzung der organisch löslichen Fraktion, durch chemische Klasse gruppiert Tabelle 10B Tabelle 10C Tabelle 10D Tabelle 10E Tabelle 10F

Beispiel 6

In vivo-Studie, Anwendung der Behandlungslösung auf schuppige Haut der Maus

Die Maus mit schuppiger Haut (fsn) ist eine genetisch konstruierte Maus mit einer autosomen rezessiven Mutation, die bewirkt, dass die Haut dem ähnelt, was bei menschlicher Psoriasis auftritt (siehe Sundberg et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4, Seiten 312 bis 317, 1992)
Bei der homozygot beeinflussten Maus mit schuppiger Haut (fsn/fsn), bei der die Mutation an beiden Chromosomen ist, sind histologische Merkmale, wie starke Akanthose, Hyperkeratose mit fokaler Parakeratose, Pusteln unter der Cornea, Kapillargefäßerweiterung im Dermalbereich und Infiltration entzündlicher Zellen durch die Haut.
Zehn befallene Mäuse (fsn/fns) und zehn normale paarweise dazu passende Kontrolltiere (fsn/-) wurden von dem Jackson-Laboratorium in Bar Harbor, ME, erhalten. Die Tiere wurden unter Verwendung von Standarddiät und Standardgehäusen gehalten
Die Rückenoberfläche eines jeden Tieres wurde rasiert. Eine Hälfte der Rückenoberfläche erhielt wöchentlich örtliche Behandlungen mit der Lösung des Beispiels 2, während die andere Hälfte als eine unbehandelte Kontrolle diente. Die Lösung von Beispiel 2 wurde auf der Haut unter Verwendung eines sterilen Wattebausches aufgebracht. Die Behandlungen wurden sieben Wochen durchgeführt. Wöchentliche Biopsien behandelter und unbehandelter Flächen wurden auch für histologische Prüfung abgenommen. Nach der siebenten Behandlungswoche wurden die Tiere zur Ermittlung starker pathologischer Veränderungen getötet.
Es wurde gefunden, dass die Lösung des Beispiels 2 dramatische starke und mikroskopische Veränderungen nur bei der hyperproliferativen Haut der befallenen Mäuse (fsn/fsn) mit nur minimalen bis fehlenden Effekten, die bei den Kontrollmäusen (fsn/-) festgestellt wurden, einleitete. Beobachtungen durch einen Veterinärdermatopathologen beschrieben die Hautreaktion der befallenen Tiere als ähnlich einer "chemischen Verbrennung". Histologische Befunde zeigten, dass das Keratinozytwachstum der befallenen Mäusehaut stark reduziert war und die behandelte Haut begann, sich ein wenig abzulösen, aber vollständig als eine biologische Bandage voll befestigt blieb, was eine Heilung der darunter liegenden Haut erlaubte. Diese Wirkung wurde bei den Kontrolltieren oder bei der unbehandelten Haut der befallenen Tiere nicht beobachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 wiedergegeben. Tabelle 11 Zusammenfassung der Untersuchung der Maus mit schuppiger Haut

Beispiel 7

Bioassay - Bioassaystudie in vivo

Die in vivo-Studie des Beispiels 6 unter Verwendung des Mausemodells mit schuppiger Haut war ein Zeichen von Keratinozytzellen-Spezifität in bezug auf die Aktivität der Verbindung der Behandlungslösung.
Ein Zellentest in vitro ist erforderlich, um die Aktivität in bezug auf die Zellenart zum Zwecke der Entwicklung eines Bioassays für die Aktivität der Behandlungslösung zu entdecken und zweitens weiter die Ergebnisse zu studieren, die man bei Verwendung der Maus mit schuppiger Haut des Beispiels 6 erhält. Da menschliche Haut sowohl Keratinozyten als auch Fibroplaste enthält, von denen jeder in die Psoriasiserkrankung einbezogen ist, wurden reine Kulturen von menschlichen Fibroblasten aus normaler Haut von erwachsenen Menschen, Keloidnarben (hyperproliferative Fibroblaste) und handelsüblichen beglaubigten reinen Kulturen normaler Epidermiskeratinozyten erwachsener Menschen gezüchtet. Diese Zelltypen wurden hinsichtlich ihrer Wachstumsreaktion auf Behandlung mit der Behandlungslösung von Beispiel 2 getrennt getestet.

Versuchsprotokoll

Zellwachstum wird durch Prüfung der Mengen von DNA-Synthese gemessen; denn während Zellen wachsen und sich teilen, wird mehr DNA produziert. Radioaktives Thymidin wird zu den Zellkulturmedien zugegeben. Der Assay wird folgendermaßen durchgeführt: Fibroblaste aus Kulturen werden in vollständigem minimalem, essentiellem Medium (CMEM) gezüchtet, das 10% Rinderfetusserum als Wachstumsfaktorquelle enthält. Epidermiskeratinozyten wurden in Gegenwart von vollständigem Keratinozytwachstumsmedium (CKGM) gezüchtet, das durch Rinderhypophysenextrakt, Hydrocortison und Epidermiswachstumsfaktor (EGF) als Wachstumsfaktorquelle ergänzt war.
Gesunde wachsende Zellen wurden als Impfung in Corning - 24- Gewebeschachtkulturplatten mit einer Dichte von 1,0 · 10&sup4; Zellen je Schacht in 1,0 ml entweder von CMEM oder CKGM, je nach der Zelltype, eingebracht. Die Zellen wurden 24 bis 36 h oder, bis sie 60 bis 70% Zusammenfluß bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; erreichten, inkubiert. Das Medium wurde dann entweder auf MEM ohne die 10% Serum oder auf KGM ohne Hydrocortison oder ECF gewechselt, doch wurde das BPE in den Medien gelassen. Dies gestattet ein Aushungern der Zellen oder ihre Regression zu einer Nichtwachstumsphase, in der sie, obwohl sie sich nicht teilen, biochemisch aktiv bleiben. Die Zellen ließ man unter diesen Bedingungen 24 h inkubieren. Die verarmten Medien wurden dann entfernt und durch 1,0 ml/Schacht an vollständigen Wachstumsmedien CMEM oder CKGM ohne Gehalt der Behandlungslösung von Beispiel 2 oder einer Unterfraktion von Beispiel 4 bei einer Verdünnung von 1 : 5000 oder Lösungsmittel allein, wie Essigsäure oder DMSO, ersetzt. Für jede Behandlung erfolgte die statistisch signifikante Anzahl von Wiederholungen. Außerdem wurde auch je Schacht 1 uCl lithiumhaltiges Thymidin (³H) zugegeben. Nach diesen Behandlungen ließ man die Zellen 24 h bei identischen Bedingungen wie oben inkubieren. Nach dem Ende der Inkubationsperiode wurden die Schächte dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 12,5%iger Trichloressigsäure (TCA) während 10 min und anschließend mit Ethanol während 10 min fixiert. Die Platten wurden an Luft getrocknet und die Zellen in 1,0 ml von 0,2 N NaOH bei 37ºC während 1 h löslich gemacht. Das Wachstum wurde durch Messung des Gehaltes an Radioaktivität bestimmt. Dies wurde durch Auszählen von 0,9 ml der löslichgemachten Zellen in einem Szintillationszähler durchgeführt.

Ergebnisse

Fibroblaste

Fibproblaste aus normaler Erwachsenenhaut und Keloidnarben wurden gezüchtet und hinsichtlich der Effekte der Behandlungslösung auf das Wachstum, wie oben beschrieben, untersucht. Weder normale noch Keloidfibroblaste wurden durch die Behandlungslösung gehemmt. Eine typische graphische Darstellung dieser Experimente ist in Fig. 24 gezeigt.

Keratinozyten

Die Behandlungslösung von Beispiel 2 wurde wie in Beispiel 4 fraktioniert, wobei die chemischen Zusammensetzungen jener Fraktionen in Beispiel 5 analysiert wurden und die Ergebnisse oben in den Tabellen 3 bis 9 gezeigt sind.
Die Tabellen 12 bis 14 fassen die Prozentsätze vier hauptaktiven Bestandteile in jeder dieser Fraktionen zusammen und zeigen mittlere Prozentsätze der Hemmung in dem Keratinozytbioassay für jede Fraktion. Schließlich werden die mittleren Prozentsätze der Hemmung auf die Prozentsätze eines jeden aktiven Bestandteils in den obererwähnten Fraktionen normalisiert. Tabelle 12 Prozentsätze von vier hauptaktiven Bestandteilen in der Behandlungslösung des Beispiels 2, zusammengetragen aus den Tabellen 3 bis 10 Tabelle 13 Zusammengefasste Ergebnisse der Fraktionsanalyse Prozentsatz Wachstumshemmung von Keratinozyten durch Fraktion Tabelle 14 Prozentsatz Hemmung je Prozentsatz Bestandteil in der Fraktion für vier hauptaktive Bestandteile in der Behandlungslösung von Beispiel 2 (berechnet als mittlerer Prozentsatz Hemmung von Tabelle 13)

Beispiel 8

Neutralisierungsstudie

Da der pH-Wert der Behandlungslösung des Beispiels 2 sehr sauer ist, wurden Untersuchungen vorgenommen, den pH-Wert auf 7,0 zu neutralisieren, um die Hemmeigenschaften in dem neutralen Zustand zu prüfen. Rohe Behandlungslösung wurde auf pH 7,0 mit 1,0 N NaOH eingestellt. Keratinozyten für das Wachstum wurden in Gegenwart des neutralisierten Extraktes unter Verwendung der Bioassaymethodologie, wie oben beschrieben, untersucht, ausgenommen die neutralisierte Behandlungslösung als die Testverbindung in einer Verdünnung von 1 : 5000.
Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass Neutralisierung die Aktivität der Behandlungslösung entfernt. Obwohl keine Bindung an eine Theorie erfolgen soll, wird doch hypothetisiert, dass die Zugabe von Essigsäure während der Herstellungssequenz für die Behandlungslösung reaktive Moleküle acetylieren kann, was zusätzliche biologische Aktivität verleiht. Dies kann erhöhte Fähigkeiten ergeben, in Zellen einzudringen usw. Die Neutralisierung solcher Medien durch Erhöhung des pH-Wertes auf 7,0 kann die aktiven Reste inaktiv machen, wie durch die dramatisch gesenkte Aktivität reflektiert wird, die man bei diesen Studien beobachtet.

Beispiel 9

Proteinstudie

Dieses Beispiel prüft, ob Proteine in der Behandlungslösung des Beispiels 2 vorhanden sind oder nicht. Hierzu wurde Behandlungslösung bei 65ºC in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert und einer Elektroforese auf Gelen mit 12% Polyacrylamid (PAGE) in Gegenwart von SDS unerzogen.
Nach der elektroforetischen Analyse und dem Anfärben mit Coomassieblau waren keine Proteine bei visueller Betrachtung des Gels ersichtlich.
Während die erläuternden Ausführungsformen der Erfindung besonders beschrieben wurden, wird verständlich sein, dass verschiedene andere Modifikationen ersichtlich sind und leicht vom Fachmann ohne Verlassen des Erfindungsgedankens realisiert werden können. Demnach ist nicht beabsichtigt, dass der Umfang der beigefügten Ansprüche auf die Beispiele und Beschreibungen beschränkt sein soll, die hier aufgeführt sind, sondern dass die Ansprüche aufgestellt sind, um alle neuen patentfähigen Merkmale einzuschließen, die bei der vorliegenden Erfindung auftreten, einschließlich aller Merkmale, die als Äquivalente dem Fachmann in Verbindung mit dieser Erfindung auf der Hand liegen.

Claims

1. Zusammensetzung für die Behandlung von Psoriasis, einen Extrakt einer Pflanze Asphodelus Microcarpus umfassend, worin der Extrakt einen Extrakt aus einem Wurzelbereich der Pflanze Asphodelus Microcarpus und Essigsäure umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Extrakt und die Essigsäure in einem Volumenverhältnis im Bereich von 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin der Extrakt und die Essigsäure in einem Volumenverhältnis von 4 : 1 vorliegen.

4. Zusammensetzung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, die zusätzlich Schwefel umfaßt.

5. Zusammensetzung zur Behandlung von Psoriasis, die wenigstens die vier Verbindungen 3-Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe-Emodinmonoacetat umfaßt.

6. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die bei der Behandlung von Psoriasis wirksam ist, mit den Stufen, in denen man eine Flüssigkeit aus einer Wurzel einer Pflanze Asphodelus Microcarpus extrahiert und die Flüssigkeit mit Essigsäure vermischt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Mischstufe ein Vermischen der Flüssigkeit mit Essigsäure in einem Volumenverhältnis im Bereich von 20 : 1 bis 1 : 20 umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Mischstufe ein Vermischen der Flüssigkeit mit Essigsäure in einem Volumenverhältnis von etwa 4 : 1 umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, zusätzlich mit einem Vermischen des Gemisches von Flüssigkeit und Essigsäure mit Schwefel.

10. Verwendung einer Zusammensetzung, die einen flüssigen Extrakt einer Wurzel einer Pflanze Asphodelus Microcarpus, vermischt mit Essigsäure umfaßt, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Psoriasis.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der Flüssigkeit mit Essigsäure in einem Volumenverhältnis im Bereich von 20 : 1 bis 1 : 20 vermischt ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, bei der die Flüssigkeit mit Essigsäure in einem Volumenverhältnis von etwa 4 : 1 vermischt ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei der die Zusammensetzung zusätzlich Schwefel umfaßt.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei der der flüssige Extrakt wenigstens die vier Verbindungen 3-Methylanthralin, Chrysophanol, Aloe-Emodin und Aloe- Emodinmonoacetat umfaßt.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, bei der die Zusammensetzung einmal pro Tag während einer ausreichenden Dauer, um die Symptome von Psoriasis zu lindern, auf dem befallenen Hautbereich aufgebracht wird.