DE2154278A1

DE2154278A1 - Verfahren zur Extraktion von Alkalisalzen von Desoxyribonucleinsäure aus tierischen Organen

Info

Publication number: DE2154278A1
Application number: DE19712154278
Authority: DE
Inventors: Adriano Como; Prino Giuseppe Mailand; Bertellini Gianfranco Maslianico; Butti (Italien)
Original assignee: Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A., Villa Guardia (Italien)
Priority date: 1970-11-03
Filing date: 1971-10-30
Publication date: 1972-05-25
Also published as: IT1043823B; SE385902B; FR2131249A5; JPS5229320B1; DE2154277C2; FR2131248A5; GB1366647A; DE2154277A1; GB1367656A; SE385376B; US3770720A

Description

PATENTANWÄLTE .

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPt.-CHEM. ALEK VON KREISLER

DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH,Dipl.-Ing.Selting

KÖLN T, DEtCHMANNHAUS

Köln, den 27.10.1971 AvK/Ax

C R I N O 8 S.p.A.,

Piazza XX Settembre, 2, Villa Guardia (Italien).

Verfahren zur Extraktion von Alkalisalzen von Desoxyribonuoleinsäure aus tierischen Organen

Die Erfindung betrifft die Extraktion von Nucleinsäuren aus tierischen Organen, insbesondere ein Verfahren zur Extraktion von Alkalisalzen von Desoxyribonucleinsäure (DNA).

Für die Extraktion von Nucleinsäuren aus tierischen Organen und Geweben und pflanzlichem Material sind mehrere Verfahren bekannt. Alle bisher beschriebenen Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie umständlich und für die aroßherstellung schwierig durchführbar sind. Die Er- λ findung ist daher auf die Extraktion von Desoxyribonucleinsäure aus leicht verfügbaren tierischen Organen wie lunge, Plazenta, Darm, Duodenum, Pankreas usw. nach einem Verfahren gerichtet, das aus Stufen besteht, die leicht im großtechnischen Maßstab durchführbar sind.

Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt im wesentlichen die Abtrennung von Desoxyrlbonucleinsäure aus anderen Substanzen, die tierische Gewebe und Organe bilden (Proteine, Fette, Polysaccharide usw.), 'durch Bildung ihres Zinksalzes zu Grunde, das anschließend in das Alkalisalz um-' gewandelt wird.

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Zink ist nicht nur verhältnismäßig billig, sondern hat auch den großen Vorteil, daß seine Salze mit den Begleitstoffen von DNA in tierischen Organen eine wesentlich höhere Wasaerlöslichkeit haben, während seine Salze mit DHA. In Wasser praktisch unlöslich sind.

Die Bildung des Zinksalzes von Deaoxyribonuoleinsäure gemäß der Erfindung erfolgt durch Behandlung des extrahierten rohen Materials mit einer Lösung eines wasserlöslichen Zinksalzes· Zu diesem Zweck sind mehrere organische und anorganische Zinksalze geeignet. Beispielsweise können Zinkchlorid und Zinkacetat verwendet werden.

Die tierischen Organe, aus denen die Desoxyribonueleinsäure nach dem Verfahren gemäß der Erfindung gewonnen werden soll, werden vorzugsweise einer Vorbehandlung unterworfen, durch die die Masse der protetinhaltigen Ballaststoffe schnell entfernt wird. Eine solche Vorbehandlung kann naoh bekannten Verfahren, z.B. durch Extraktion mit alkalischen Verbindungen und Froteolyse, durchgeführt werden. Es ist zweckmäßig, jedoch für die Zwecke der Erfindung nicht unbedingt notwendig, das Ausgangsmaterial vor der Behandlung mit dem Zinksalz mit einem basischen Komplexbildner zu behandeln, um jede Spur von nicht-sauren,'. insbesondere proteinhaltigen Substanzen mit Sicherheit zu entfernen. Als Komplexbildner werden für diesen Zweck vorzugsweise quaternäre Basen verwendet, z.B. Benzyldimethyl-{ 2-/2- (p-1,1,3, 3-t etrame thyl-butylphenoxy )äthoxv7äthyljammoniumchlorid, das allgemein als Benzethoniumchlorid bekannt ist.

Die Behandlung mit dem basischen Komplexbildner wird vorzugsweise in wässriger Lösung durchgeführt, die mit dem System Natriumacetat-Essigsäure gepuffert wird. Der erhaltene Komplex wird dann durch Behandlung mit Natriumchlorid in wässriger Lösung unter Erhitzen zersetzt. Die hierbei erhaltene Lösung wird dann mit einem Zinksalz zur Ausfällung des Zinksalzes von DNA behandelt.

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Sas Zinkeais der Deaoxyribonucleinsäure läßt sich dann leicht In daa entsprechende Hatriumeale oder Kaliumaals durch Behandlung «it Hatrlua- oder Kaliumcarbonat umwandeln. Bevorzugt für diese Behandlung wird Natriumcarbonat· Bas Hatriuasals der Desoxyribonucleineäure kann in bekannter Veise durch Behandlung seiner wässrigen Lösung alt einem geeigneten anlonisohen Harz und anschließende Heutrallsa» tion sdt Alkali und anschließende Ausfällung des gereinigten Salses weiter gereinigt werden.

Bas In der oben beschriebenen Welse hergestellte Natrium« sals der Desoxyribonukleinsäure ist ein elfenbeinfarbiges ( Pulrer, dessen Analyse die folgenden Hauptbestandteile ergibt»

Gesamtbasen 34*

Guanin 9,4*

Thyiflln 5,4*

Adenin 9,2*

Cytosin ©*

üraeil ienlt.

Die vorstehendan Än«lys#nwerte₉ insbesondere das vollständige Fehlen von Üxa^II_} sslgen, daß die JSndproäukte des 7erfahreae geii:^:ie der Er. .tiütlang ein« SusammeiiSetzung haben, | dls ait der Euoeajoanaetsim» des ifatriaasalizee τοπ Desoxyribcnucleinsäure ic. /-tisch ;tat.

.-■Diel 1

Phosphor	8,5*
Va	9,0*
I	Ujt
8	fehlt
Desoxyribose	23.2*

100 Gew.-Teile des ^c-■■·?■-.'·■·:^an uric ^ Schweine- oder jR.i.nitχ..;.·;■-,·■'. -.auaa werfer,

ver^eher Ist, ;ri s_ti ei.lern Homogen L;:^7or ii -'OC jli;!".·'--"· ^:ser disperc .eri, Ler t--Wert de.. :■-■■ Γ_;:·ί1-<--ι;:·5£ΐ -S u~ _■;$;,.·. ?:.·.:

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ORIGINAL INSPECTED

0,2 Gew.-Teile Papain der Masse zugesetzt, die dann 16 Std. bei 60 bis 65⁰C gerührt wird. Nach Zusatz von 5 Gew.-Teilen eines Filterhilfsmittels (Celite FN 20 o.dgl.) wird die Masse in einer Filterpresse filtriert und mit heißem Wasser gewaschen. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck auf 100 Raumteile eingeengt und dann mit 100 bis 120 Raumteilen Aceton gewaschen. Die Fällung wird durch Dekantieren mit wässrigem Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen. Die Ausbeute beträgt 0,3 bis 0,4 g.

100 Gew.-Teile des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Pulvers werden in 9500 Teilen Wasser bei 40⁰C gelöst. Zur Lösung werden unter Rühren zunächst 500 Raumteile 2n-Natriumhydroxyd, dann 2000 Raumteile einer 10bigen Benzethoniumchloridlösung und schließlich 100 Raumteile 3n-Essigsäure gegeben. Die Fällung wird durch Dekantieren abgetrennt und dann mehrmals mit Wasser in einer Zentrifuge gewaschen.

1 Gew.-Teil der feuchten Fällung wird unter Rühren in 5 Raumteilen einer 2n-Natriumchloridlösung bei 40⁰C dispergiert. Zur Dispersion werden 7,5 Raumteile Aceton gegeben. Die Fällung wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und gemahlen.

1 Gew.-Teil des hierbei erhaltenen Pulvers wird in 10 Raumteilen Wasser bei normaler Temperatur gelöst. Zur Lösungwerden unter kräftigem Rühren 10 Raumteile einer 3-molaren Zinkchloridlösung gegeben. Die Fällung wird durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Fällung wird unter vermindertem Druck getrocknet und gemahlen. Hierbei werden 0,75 Gew.-Teile wasserfreies Zinksalz erhalten.

1 Gew.-Teil des erhaltenen Zinkcalzes wird in 10 Raumteiler* Wasser bei 60⁰C suspendiert und dann der Suspension zugesetzt, die 12 Stunden bei 10⁰C gehalten und dann zur Entfernung dec ausgefällten Zinkcarbonats zentrifugiert wird.

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Die Flüssigkeit wird bis zur vollständigen Klärung erneut filtriert und anschließend mit 3n-Essigsäure bei 60⁰O unter Rühren bis zu Pg 5 angesäuert. Nach dem Aufhören der Entwicklung von Kohlendioxyd wird die Lösung mit 2n-Natriumhydroxyd neutralisiert. Der gelöste Stoff wird durch Zusatz von 30 Raumteilen Aceton ausgefällt. Nach 3- bis 5-stündigem Stehen wird die Fällung durch Dekantieren abgetrennt, mit einem Gemisch von Aceton und Wasser (2:1) gewaschen, mit trockenem Aceton dehydratisiert, unter vermindertem Druck getrocknet und gemahlen. Eine Lösung von 1 Gew.-Teil ä des erhaltenen Pulvers in 40 Raumteilen entionisiertem Wasser wird hergestellt. Die Lösung läßt man durch eine Säule eines Anionenaustauscherharzes, z.B. des Produkts der Handelsbezeichnung Amberlite IR 120, perkolieren. Die Säule wird anschließend mit 20 Raumteilen entionisiertem Wasser gewaschen. Die aufgefangenen Flüssigkeiten werden gemischt, mit 2n-Natriumhydroxyd neutralisiert, mit 0,005 Gew.-Teilen Natriumiodid behandelt und mit 150 Raumteilen Aceton versetzt.

Die Fällung wird durch Dekantieren abgetrennt, mit einem Gemisch von Aceton und Wasser (3:1) gewaschen, mit v/asser- , freiem Aceton dehydratisiert, unter vermindertem Druck ge- { trocknet und gemahlen. Etwa 0,8 Gew.-Teile eines Produkts mit folgenden Analysenwerten werden erhalten:

34$

Viskosität	1,7792 cP	Gesamtbasen
P	8,65#	Guanin
N	14,47^	Thymin
Na	8,95^6	Adenin
S	fehlt	Cytosin
Desoxyribose	23,2/*	Uracil

9,

fehlt

Die Viskosität der in diesem und in dem folgenden Beispiel beschriebenen Substanzen wurde in 0,5-molarer Natriumchloridlösung gemessen, in der das Produkt in einer Konzentration von 1^ gelöst war. Die Mesaungen wurden bei 20 C in einem Höppler-Viakosimeter (Innendurchmesser des Rohrs

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15t95 mm» Fallhöhe 100 mm) unter Verwendung der Kugel Nr. 1 (Durchmesser 15,805 mm, Gewicht 4_S9848 g) vorgenommen.Unter diesen Bedingungen ergibt die 0,5-molare Natriumchloridlösung eine Fallzeit der Kugel von 70,8 Sekunden entsprechend einer Viskosität von 0,9841 cP.

Beispiel 2

100 Gew.-Teile einer gut konservierten und entfetteten Schweine- oder Rinderplazenta werden auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weise gemahlen und der alkalischen Hydrolyse und Proteolyse unterworfen.'Auf diese Weise werden 0,8 bis 1 Gew.-!Dell eines trockenen gemahlenen Materials erhalten.

1 Teil des erhaltenen Pulvers wird in 16 Gew.-Teilen Wasser gelöst und mit 1 Raumteil einer 40^igen wässrigen Zinkchloridlösung behandelt· Die gebildete Fällung wird durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und mehrmals mit Wasser gewaschen.

Eine Suspension von 1 Gew.-Teil dieser Substanz in 10 Gew·- Teilen Wasser wird hergestellt. Dann werden 0,2 Raumteile Salzsäure (d=1,19) der Suspension zugesetzt, die dann 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wird. Eine gummiartige Fällung wird abgeschieden und In 8 Gew.-Teilen Wasser suspendiert. Der Suspension werden 3 Raumteile einer 10bigen wässrigen Katriumcarbonatlösung unter Rühren zugesetzt. Die Hasse wird 12 Stunden stehen gelassen, worauf das Zinkcarbonat entfernt und öae mit Essigsäure auf P₁₁ 5,5 angesäuerte Filtrat unter Rühren auf 60⁰C erhitzt wird, bis die Entwicklung von Kohlendioxyd aufhört· Die Lösung wird mit 2n-Natriumhydroxyd neutralisiert und dann mit 15 Raumteilen Aceton gemischt. Nach 3- bis 5-sttindigem Stehen wird die Fällung durch Dekantieren abgetrennt, mit einem Gemisch von Aceton und Wasser (2:1) gewaschen, mit trockenem Aceton dehydratisiert, unter vermindertem Druck getrocknet und gemahlen. Als Produkt werden etwa 0,1 Gew,-Teile einer Substanz mit folgenden Analysenwerten erhalten:

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Viskosität nicht bestimmbar

P 7,9*

N 14,4556 Ha 8,55*

S fehlt

Gesaatbasen 32,5* Desoxyribose 23,5*

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Extraktion von Alkalisalzen von Desoxyribonucleinsäure aus tierischen Organen, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte tierische Organ nach einer Vorbehandlung mit einer wässrigen Lösung eines Zinksalzes umsetzt und hierdurch das Zinksalz der JDesoxyribonucleinsäure bildet, das hierbei ausgefällte Zinksalz der Desoxyribonucleinsäure abtrennt und in das entsprechende Alkalisalz umwandelt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vorbehandlung eine Entfernung von Fett und proteinhaltigen Substanzen in bekannter Weise vorgenommen wird.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte tierische Organ nach der Entfernung von Fetten und Proteinen mit einem basischen Komplexbildner behandelt, der einen schwerlöslichen Komplex mit der Desoxyribonucleinaäure bildet, den Komplex abtrennt und vor der Umsetzung mit der wässrigen Zinksalzlösung zersetzt.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Benzethoniumchlorid als Komplexbildner verwendet und den Komplex in einer gepufferten wässrigen Lösung bildet.

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