CH643261A5

CH643261A5 - Verfahren zur gewinnung von riboflavin.

Info

Publication number: CH643261A5
Application number: CH468479A
Authority: CH
Inventors: Albert Epstein; Glen Graham; William Arthur Sklarz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1975-08-29
Filing date: 1979-05-18
Publication date: 1984-05-30
Also published as: BE876426A; GB2048889B; DE2920592C2; US4165250A; FR2457292A1; FR2457292B1; GB2048889A; SE432444B; SE7904349L; DE2920592A1; NL7904180A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von als Zusatzmittel für Tiernahrung geeignetem Riboflavin aus einer Riboflavin enthaltenden Fermentationsbrühe, das im Patentanspruch 1 definiert ist.

Die Herstellung von Riboflavin aus einer Fermentationsbrühe ist literaturbekannt. Hierbei wird ein Nährmedium sterilisiert und mit einem zur Bildung von Rivoflavin befähigten Organismus geimpft.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, das auf einfache Art ausführbar ist und die Gewinnung von Riboflavin wesentlich höherer Reinheit ermöglicht.

Im nachstehenden wird eine praxisgerechte Ausführungsform dieses Verfahrens beschrieben.

Wenn die Fermentationsausbeute der Riboflavin enthaltenden1 Fermentationsbrühe etwa das Maximum erreicht hat, wird die Brühe während 15-45 min, vorzugsweise 25-35 min, auf 50-65°C erwärmt, wonach die Gewinnung des Riboflavins beginnt. Diese Wärmebehandlung dient zur Lysis der Zellen und Herabsetzung der Viskosität der

Brühe, wodurch die Wirksamkeit anschliessender Gewin-nungs- und Reinigungsstufen erhöht wird. Eine Wärmebehandlung von weniger als 45 min ist unerwünscht, da sich die Viskosität der Brühe eher erhöht als herabsetzt. 5 Die Brühe wird dann gekühlt und mit einem vorbestimmten! Mengenanteil Wasser verdünnt. Der Mengenanteil Wasser wird dabei so gewählt, dass er ungenügend ist, um in der Fermentationsbrühe suspendierte Festkörper zu lösen, jedoch genügt, um durch Verdünnung vorgängig io in der Fermentationsbrühe gelöster Festkörper und Erhöhung der Abscheidbarkeit von suspendierten Festkörperteilchen einer geringeren Dichte als derjenigen von kristallinem Riboflavin die Abscheidbarkeit durch Zentrifugieren zu optimieren. Der hierbei zugesetzte Mengenanteil 15 Wasser beträgt vorzugsweise 25-100 VoI.-% bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Fermentationsbrühe, insbesondere Y, bis Yl des ursprünglichen Volumens der Fer-mentationsbrühe.

Ein proteolytisches Enzym kann während der Wärme-20 behandlung vorhanden sein oder nach der Wärmebehandlung zugesetzt werden. Diesem Enzym wird die Verdauung von proteinhaltigem Material während mehreren Stunden ermöglicht, im allgemeinen während 1-5 h, vorzugsweise während 3-4 h. Während der Enzymbehandlung wird die 25 Brühe zweckmässig auf einen pH-Wert gestellt, bei welchem das Enzym am wirksamsten ist, im allgemeinen auf einen Bereich von 6,0-9,0. Danach wird die Brühe gekühlt und, falls sie alkalisch ist, auf einen pH-Wert von etwa 7,0 gestellt.

30 Die verdünnte, gegebenenfalls enzymbehandelte Fermentationsbrühe wird nun- durch Zentrifugieren zu einem Schlamm umgesetzt. Der erhaltene Schlamm wird dann mit einem vorbestimmten Mengenanteil Wasser resuspendiert. Der Mengenanteil des hierfür verwendeten Wassers 35 wird so gewählt, dass er ungenügend ist, um im resuspendierten Schlamm suspendierte Festkörper zu lösen, jedoch genügt, um die Abscheidbarkeit von Festkörperteilchen einer Dichte von weniger als derjenigen von kristallinem Riboflavin zu optimieren. Vorzugsweise beträgt dieser Mèn-40 genanteil Wasser das 1- bis 3fache Volumen, insbesondere das 2fache Volumen des urpsrünglichen Volumens des Schlamms. Der resuspendierte Schlamm enthält beispielsweise 15-30 Gew.-% Festkörper. Danach wird der resuspendierte Schlamm zentrifugiert, um ein Zentrifugat zu er-45 halten, das als solches als Zusatzmittel für Tiernahrung verwendbar ist.

Im beschriebenen Verfahren verwendbare proteolytische Enzyme sind beispielsweise alkalische Proteasen, wie B. subtilis, B. ligninoformis und B. amylofaciens Protease; 50 neutrale Proteasen, wie neutrale B. subtilis Proteasen. Derartige Enzyme sind im Handel' erhältlich, beispielsweise als alkalisches Protease-Enzym «Rhozyme P-62» vom Rohm and Haas Co. und als neutrales Protease-Enzym «Enzeco Bacterial Protease» von Enzyme Development Corp.

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Beispiel 1

1 L'iter Riboflavin-Fermentationsbrühe wird nach Ab-schluss der Fementation während 30 min auf 60oC erwärmt, 60 danach auf 25°C gekühlt und mit dest. Wasser auf 1,4 Liter verdünnt. Die verdünnte Brühe wird zentrifugiert und das Zentrifugat mit dem zweifachen Volumen Wasser re-suspendiert und erneut zentrifugiert. Die Reinheit des erhaltenen Zentrifugats ist dreifach höher als diejenige von 65 vergleichsweise unbehandelter getrockneter Fermentationsbrühe und ist von genügender Reinheit, um dessen Verwendbarkeit als Zusatzmittel zu Tiernahrung ohne weitere Behandlung zu ermöglichen.

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Beispiel 2

1 Liter Riboflavin-Fermentationsbrühe wird nach Äb-schluss der Fermentation auf 60°C erhitzt, mit einem aliquoten Teil von 0,068 g alkalischer B. subtilis Protease mit einer Aktivität von 3,65 Caseineinheiten versetzt und während 3 h reagieren gelassen. Eine Caseineinheit wird als Befähigung von 1 g Enzym zur Verflüssigung von 270 g Azocasein in 1 h bei 40°C und einem pH-Wert von 8,0 definiert. Danach wird die Brühe auf 25°C gekühlt, auf pH-Wert 7,0 neutralisiert und mit dest. Wasser auf 1,4 Liter verdünnt. Die verdünnte Brühe wird zentrifugiert und das Zentrifugat im zweifachen Volumen Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die Reinheit des erhaltenen Zentrifugats ist um 20% höher als diejenige des Endproduktes von Beispiel 1.

Beispiel 3

Ein Ansatz Riboflavin-Fermentationsbrühe wird nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehen mit der Ausnahme behandelt, dass anstelle der alkalischen B. subtilis Protease 0,48 g alkalische B. ligninoformis Protease einer Aktivität von 3,0 Ansoneinheiten verwendet wird. Eine An-soneinheit ist als die Anzahl Gramm Hämoglobin, die durch 1 g Enzym bei 25°C und pH-Wert 10,1 in 10 min verdaut und durch Trichloressigsäureaddition nicht ausgefällt werden, definiert. Die Reinheit des erhaltenen, enzymbehandelten Schlamms ist 27% höher als diejenige von nicht enzymbehandeltem Schlamm. Der erhaltene enzymbehandelte Schlamm ist 3,4fach reiner als vergleichsweise unbehandelte, getrocknete Fermentationsbrühe.

Die Enzymbehandlung der Fermentationsbrühe kann gleichzeitig mit einem Hitzesterilisationszyklus im Fermen-tationsgefäss ausgeführt werden, wobei ähnliche Resultate erhalten werden.

5 Beispiel 4

553 ml einer pasteurisierten Riboflavin-Fermentationsbrühe werden mit 10 ml B. subtilis (NCTC Nr. 3610)-Nähr-brühe-Saatkultur geimpft und bei 37°C während 48 h fermentieren gelassen. Während der Fermentation nehmen io suspendierte Festkörper um 72% ab. Die B. subtilis fermentierte Brühe wird erwärmt, mit Wasser auf 750 ml verdünnt und zentrifugiert. Das erhaltene Zentrifugat wird mit 200 ml Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Zentrifugat ist 53 % reiner als dasjenige eines 15 nicht B. subtilis fermentierten Vergleichsversuchs und 4,4fach reiner als vergleichsweise getrocknete Fermentationsbrühe.

Beispiel 5

20 Das Vorgehen gemäss Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, dass der resuspendierte Schlamm vor dem Zentrifugieren auf pH-Wert 8,0 gestellt und auf 60°C erwärmt wird. Dann' wird 0,049 g alkalisches B. subtilis Pro-teaseenzym einer Aktivität von 3,65 Caseineinheiten zu-25 gesetzt und während 3 h reagieren gelassen. Die Auf-schlämmung wird gekühlt, neutralisiert und zentrifugiert. Die Reinheit des erhaltenen Zentrifugats ist 41 % höher als diejenige eines Vergleichsversuchs ohne Enzymbehandlung. Eine äquivalente auf die gleiche Fermentationsbrühe des 30 gleichen Fermentationsansatzes ausgeführte Enzymbehandlung ergibt gegenüber einem nicht enzymbehandelten Vergleichsversuch eine nur um 20% erhöhte Reinheit.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gewinnung von als Zusatzmittel für Tiernahrung geeignetem Riboflavin aus einer Riboflavin enthaltenden Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Brühe, nachdem die Fermentationsausbeute etwa das Maximum erreicht hat, während 15-45 min auf 50-65°C erwärmt, danach mit einem Mengenanteil Wasser versetzt, der ungenügend ist, um in der Brühe suspendierte Festkörper zu lösen, jedoch genügt, um die Abschei-dung sowohl durch Verdünnung vorgängig gelöster Festkörper wie auch die Abscheidbarkeit von suspendierten Festkörperteilchen einer geringeren Dichte als derjenigen von kristallinem Riboflavin durch Zentrifugieren zu optimieren, wonach man die das zusätzliche Wasser enthaltende Fermentationsbrühe zur Bildung eines Schlamms zentrifugiert, den erhaltenen Schlamm mit einem Mengen-anteil Wasser versetzt, der ungenügend ist, um suspendierte Festkörper zu lösen, jedoch genügt, um die Abscheidbarkeit von Festkörperteilchen einer geringeren Dichte als diejenige von kristallinem Riboflavin durch Zentrifugieren zu optimieren, wonach man den resuspendierten Schlamm zentrifugiert, um ein gereinigtes Riboflavin enthaltendes Zentrifugat zu erhalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mengenanteil des der Fermentationsbrühe zugesetzten Wassers 25-100 Vol.-%, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Fermentationsbrühe, beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mengenanteil des der Fermentationsbrühe zugesetzten Wassers % bis Yl des ursprünglichen Volumens der Fermentationsbrühe beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mengenanteil des für die Resuspendierung des zentrifugierten Schlamms verwendeten Wassers das 1- bis 3fache Volumen des Schlamms beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsbrühe vor dem Zentrifugieren zur Bildung eines Schlamms mit einem proteolytischen Enzym behandelt, welches das Riboflavin nicht beeinflusst, jedoch proteinhaltiges Material entweder verflüssigt oder zu einem durch Zentrifugieren abscheidbaren Material verminderter Dichte umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den resuspendierten Schlamm vor dem Zentrifugieren mit einem proteolytischen Enzym bëhandelt.