DE2920592C2

DE2920592C2 -

Info

Publication number: DE2920592C2
Application number: DE2920592A
Authority: DE
Inventors: Albert Edison N.J. Us Epstein; Glen Stockton N.J. Us Graham; William Arthur Edison N.J. Us Sklarz
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1975-08-29
Filing date: 1979-05-21
Publication date: 1987-10-22
Also published as: SE7904349L; DE2920592A1; CH643261A5; FR2457292A1; US4165250A; GB2048889B; SE432444B; NL7904180A; GB2048889A; BE876426A; FR2457292B1

Description

Aus der GB-PS 6 21 469 ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Riboflavin-Vorläufers aus Riboflavin enthaltenden Fermenta tionsbrühen unter Anwendung eines Zentrifugationsschritts bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein spezielles Verfahren anzuge ben, das eine besonders effektive Riboflavingewinnung ermög licht.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen defi niert.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt eignet sich direkt als Tierfutterzusatz oder kann für pharma zeutische Zwecke weiter gereinigt werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Ausgangsmaterial ist eine Riboflavin-Fermentationsbrühe. Die Herstellung von Ribo flavin aus einer Fermentations- bzw. Gärbrühe ist bekannt. Kurz gesagt, wird bei dieser Methode ein Nährmedium steri lisiert und mit einem zur Bildung von Riboflavin befähig ten Mikroorganismus, wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii, beimpft. Wenn die Fermentations ausbeute an den Maximalwert herankommt oder diesen Wert et wa erreicht, wird die Brühe 15 bis 45 Minuten (vorzugsweise 25 bis 35 Minuten) auf 50 bis 65°C erwärmt, wonach man mit der Riboflavingewinnung beginnt. Das Erwärmen dient zur Lyse der Zellen und Vermin derung der Viskosität der Brühe, wodurch die Wirksamkeit der anschließenden Gewinnungs- und Reinigungsstufen erhöht wird. Ein längeres als 45minütiges Erwärmen ist nach teilig, da es die Viskosität der Brühe eher erhöht als herab setzt.

Die Brühe wird dann abgekühlt und mit einer vorbestimmten Wassermenge verdünnt. Die gewählte Wassermenge reicht nicht zur Auflösung suspendierter Feststoffe in der Brühe aus, genügt jedoch für die Erzielung einer optimalen Zentrifu gentrennung, indem sie sowohl die zuvor aufgelösten Fest stoffe in der Brühe verdünnt als auch die Abtrennung fester, suspendierter Teilchen, die eine geringere Dichte als kristallines Riboflavin haben, fördert. Typischerweise be trägt diese zugesetzte Wassermenge 25 bis 100 Vol.-% des Volumens der Fermentationsbrühe, vorzugsweise ¹/₃ bis etwa die Hälfte des Fermentationsbrühenvolu mens.

Ein proteolytisches Enzym kann während des Erwärmens vor handen sein oder nach dem Erwärmen zugesetzt werden. Man läßt das Enzym proteinartige bzw. -haltige Materialien mehrere Stunden (im allgemeinen 1 bis 5 Stunden, vorzugsweise 3 bis 4 Stunden) digerieren. Wäh rend der Enzymbehandlung wird der pH auf einen Wert ein gestellt, bei dem das Enzym die größte Wirkung entfaltet; im allgemeinen liegt dieser pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0. Anschließend kühlt man die Brühe ab und stellt den pH-Wert (falls er alkalisch ist) auf etwa 7,0 ein.

Die verdünnte Brühe wird dann entweder mit oder ohne Enzym behandlung durch Zentrifugieren in einen Schlamm umgewan delt. Der Schlamm wird hierauf mit einer vorbestimmten Was sermenge resuspendiert. Die gewählte Wassermenge reicht nicht zur Auflösung suspendierter Feststoffe im resuspen dierten Schlamm aus, genügt jedoch zur Optimierung der Ab trennung fester Teilchen mit einer geringeren Dichte als jener von kristallinem Riboflavin. Typischerweise beträgt diese Wassermenge 1 Volumen bis 3 Volumina, vor zugsweise 2 Volumina, pro Volumen des Schlammes. Auf Feststoffbasis ausgedrückt, enthält der resuspendierte Schlamm 15 bis 30 Gew.-% Feststoffe. Der re suspendierte Schlamm wird dann zentrifugiert, wobei man ein Zentrifugat erhält, das als solches als Tierfutterzu satz geeignet ist.

Beispiele für Enzyme, welche sich für das erfindungsgemä ße Verfahren eignen, sind alkalische Proteasen, wie B.subtilis-Protease, B.ligninoformis-Protease oder B.amylofaciens-Protease, und neutrale Proteasen, wie neutrale B.subtilis-Proteasen. Solche Enzyme sind im Handel erhältlich.

Beispiel 1

Ein Liter einer Riboflavin-Fermentationsbrühe wird nach Beendigung der Fermentation 30 Minuten auf 60°C erhitzt. Anschließend wird die Brühe auf 25°C abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 1,4 Ltr. verdünnt. Die verdünnte Brühe wird zentrifugiert und das Zentrifugat in 2 Volumina Wasser resuspendiert. Dann wird nochmals zentrifugiert. Die Reinheit des erhaltenen Zentrifugats ist dreimal so groß wie jene der unbehandelten getrockneten Fermenta tionsbrühe und reicht dafür aus, daß das Zentrifugat ohne weitere Behandlung als Tierfutterzusatz verwendet wird.

Beispiel 2

Ein Liter einer Riboflavin-Fermentationsbrühe wird nach Be endigung der Fermentation auf 60°C erhitzt. Dann fügt man 0,068 g alkalische B.subtilis-Protease mit einer Aktivität von 3,65 Caseineinheiten hinzu und läßt 3 Stunden reagie ren. Eine Caseineinheit ist definiert als die Fähigkeit von 1 g Enzym zur Solubilisierung von 270 g Azocasein in1 Std. bei 40°C und einem pH-Wert von 8,0. Nach dem Erhitzen wird die Brühe auf 25°C abgekühlt, bis zum pH 7,0 neutralisiert und mit destilliertem Wasser auf 1,4 Ltr. verdünnt. Die verdünnte Brühe wird zentrifugiert und das Zentrifugat in 2 Volumina Wasser resuspendiert und neuerlich zentrifugiert. Die Reinheit des erhaltenen Zentrifugats ist um 20% grö ßer als in Beispiel 1.

Beispiel 3

Eine Probe einer Riboflavin-Fermentationsbrühe wird exakt wie in Beispiel 2 aufgearbeitet, außer daß man 0,48 g einer alkalischen B.ligninoformis-Protease mit einer Akti vität von 3 Ansoneinheiten anstelle der alkalischen B.subtilis-Protease verwendet. Eine Ansoneinheit ist de finiert als die durch 1 g des Enzyms innerhalb von 10 Mi nuten bei 25°C und einem pH-Wert von 10,1 digerierte Grammanzahl von Hämoglobin, welche durch Trichloressig säurezugabe nicht ausgefällt werden. Die Reinheit des enzymbehandelten Schlammes ist um 27% größer als jene des nicht-enzymbehandelten Schlammes. Die Reinheit des enzymbehandelten Schlammes ist 3,4mal so groß wie jene der unbehandelten getrockneten Fermentationsbrühe.

Die Enzymbehandlung der Fermentationsbrühe kann gleichzei tig mit einem Hitzesterilisierungszyklus im Fermentations gefäß durchgeführt werden, wobei ähnliche Resultate er zielt werden.

Beispiel 4

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wie derholt, daß das resuspendierte Zentrifugat vor der Zentri fugierung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und auf 60°C erhitzt wird. 0,049 g alkalisches B.subtilis-Proteaseenzym mit einer Aktivität von 3,65 Caseineinheiten werden zuge setzt und während 3 Stunden reagieren gelassen. Dann wird die Aufschlämmung abgekühlt, neutralisiert und zentrifugiert. Die Reinheit des Zentrifugats ist um 41% größer als jene einer Vergleichsprobe, die keiner Enzymbehandlung unterwor fen wird. Eine an derselben Brühe derselben Fermentations charge durchgeführte, äquivalente Enzymbehandlung ergibt einen um nur 20% gegenüber den Vergleichsproben erhöhten Reinheitsgrad.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Riboflavin aus einer Riboflavin enthaltenden Fermentationsbrühe durch Zentrifugieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Brühe, wenn die Fermentationsausbeute sich am Maximum befindet, 15 bis 45 Minuten auf 50 bis 65°C erwärmt,
b) der Fermentationsbrühe ein Wasservolumen zusetzt, welches nicht zur Auflösung suspendierter Feststoffe in der Brühe ausreicht, jedoch für die Optimierung der Trennung ausreicht, indem es sowohl zuvor aufge löste Feststoffe verdünnt als auch eine Zentrifugen trennung fester, suspendierter Teilchen, die eine geringere Dichte als kristallines Riboflavin aufwei sen, gestattet,
c) die die zugesetzte Wassermenge enthaltende Fermenta tionsbrühe zur Bildung eines Schlammes zentrifugiert,
d) den Schlamm mit einer Wassermenge resuspendiert, wel che nicht zur Auflösung suspendierter Feststoffe aus reicht, jedoch zur Optimierung der Abtrennung fester Teilchen, welche eine geringere Dichte als kristalli nes Riboflavin haben, ausreicht, und
e) den resuspendierten Schlamm zentrifugiert, um ein ge reinigtes Riboflavin enthaltendes Zentrifugat, wel ches als solches als Tierfutterzusatz geeignet ist, zu gewinnen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die der Fermentationsbrühe zugesetzte Wassermenge 25 bis 100 Vol.-% der Ausgangsmenge der Fermenta tionsbrühe beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das der Fermentationsbrühe zugesetzte Wasservolumen ¹/₃ bis die Hälfte des Ausgangsvolumens der Fermentationsbrühe beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Resuspendierung des Schlammes verwendete Wasservolumen das 1- bis 3fache des Schlamm volumens beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Brühe mit einem proteolytischen Enzym be handelt, bevor man sie zur Bildung eines Schlammes zentri fugiert, wobei das Enzym Riboflavin nicht beeinflußt, jedoch eine solche Wirkung besitzt, daß es entweder proteinhaltiges bzw. proteinartiges Material solubili siert oder dieses Material zu einem durch Zentrifugie ren abtrennbaren Material verminderter Dichte umwandelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich net, daß man den resuspendierten Schlamm vor seiner Zentrifugierung mit einem proteolytischen Enzym be handelt.