NL7904180A

NL7904180A - Werkwijze voor het zuiveren van riboflavine.

Info

Publication number: NL7904180A
Application number: NL7904180A
Authority: NL
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1975-08-29
Filing date: 1979-05-28
Publication date: 1980-12-02
Also published as: GB2048889A; BE876426A; US4165250A; DE2920592C2; GB2048889B; CH643261A5; SE432444B; SE7904349L; FR2457292B1; FR2457292A1; DE2920592A1

Description

- e.; *3 IT.O. 27.817 MERCK & CO.., INC., te Rahway, New Jersey,

Yer.St.v.Amerika

Werkwijze voor het zuiveren van rihoflavine.

RESUME VAN DE INHOUD

Rihoflavine wordt uit een fermentatle-bouillon gewonnen door de bouillon met een te voren bepaalde hoeveelheid water te verdunnen, de verdunde boaillong te centrifugeren onder vorming van een bezinksel, het bezinksel weer met een te voren bepaalde hoeveelheid water te sus- 5 penderen en het weer gesuspendeerde bezinksel te centrifugeren onder vorming van een produkt, dat direkt bruikbaar is als een aanvulling voor diervoeder of geschikt is voor verdere zuivering voor farmaceutisch gebruik. Eventueel wordt de bouillon of het weer gesuspendeerde bezink- 10 sel vóór het centrifugeren met een enzym behandeld.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

Het uitgangsmateriaal voor de uitvinding is een riboflavine-fermentatie-bouillon. De bereiding van ribo- . flavine uit een fermentatie-bouillon is bekend. In het . 15 kort gesteld wordt een voedingsmedium gesteriliseerd en geënt met een organisme, dat in staat is rihoflavine te produceren. Wanneer de fermentatie-opbrengst het maximum benadért of vrijwel maximaal is, wordt de bouillon gedurende ongeveer 15 tot ongeveer 45 minuten, bij voorkeur gedu- 20 rende ongeveer 25 tot ongeveer 55 minuten op een temperatuur van ongeveer 50°C tot ongeveer 65°C verwarmd en wordt met de winning van rihoflavine aangevangen. Dit verwarmen dient om een lyse van de cellen teweeg te brengen en de viscositeit van de bouillon te verminderen om zo de doel- 25 treffendheid van de hierna volgende winnings- en zuiverimgs-trappen te verhogen. Een verwarming van meer dan ongeveer 7S04180 -9- .

2 45 minuten is ongewenst omdat daardoor de viscositeit van de bouillon niet wordt verlaagd maar eerder verhoogd.

De bouillon wordt daarna afgekoeld en met een tevoren bepaalde hoeveelheid water verdund. De gekozen hoeveelheid water is onvoldoende om het gesuspendeerde vaste 5 materiaal in de bouillon op te doen lossen, maar voldoende om de scheiding door centrifugeren te optimeren door enerzijds de te voren opgeloste vaste stoffen in de bouillon te verdunnen en anderzijds het afscheiden van vaste gesuspendeerde deeltjes met een kleiner soortelijk gewicht dan 10 \ het soortelijk gewicht van riboflavine te begunstigen. Deze toegevoegde hoeveelheid water bedraagt meestal ongeveer 25 tot ongeveer 100 vol.% van het volume van de fermenta-tie-bouillon en bij voorkeur ongeveer 1/3 tot ongeveer 1/2 van het volume van de fermentatie-bouillon. 15

Een proteolytisch enzym kan tijdens de verwarming aanwezig zijn of kan na de verwarming worden toegevoegd.

Aan het enzym wordt gedurende verscheidene uren, in het algemeen ongeveer 1 tot ongeveer 5 uren, bij voorkeur ongeveer 3 tot ongeveer 4 uren, de gelegenheid gegeven eiwit- 20 achtig materiaal af te breken. Tijdens deze enzymbehande-ling wordt de pH ingesteld op een waarde, waarbij het enzym op de meest doeltreffende wijze fungeert, in het algemeen een pH van ongeveer 6,0 tot ongeveer 9*0·. De bouillon wordt daarna afgekoeld en de pH wordt, indien alkalisch, 25 ingesteld op ongeveer 7,0.

De verdunde bouillon, die al dan niet de enzym-behandeling heeft ondergaan, wordt vervolgens door centrifugeren in de vorm van een bezinksel gebracht. Het bezinksel wordt dan weer met een te voren bepaalde hoeveelheid 30 water gesuspendeerd. De gekozen hoeveelheid water is daarbij onvoldoende om de gesuspendeerde vaste bestanddelen in het weer gesuspendeerde bezinksel op te lossen maar voldoende óm de afscheiding van vaste deeltjes met een kleiner soortelijk gewicht dan het soortelijk gewicht van 35 kristallijn riboflavine te optimeren. Deze hoeveelheid wa- 7904180 . V . s? 3 ter bedraagt meestal ongeveer 1 vol.dl tot ongeveer 3 vol.dln per volumedeel bezinksel, en bij voorkeur ongeveer tweemaal het volume van het bezinksel. Betrokken op het vaste materiaal bevat het weer gesuspendeerde bezinksel ongeveer 15 tot ongeveer 30 gew.% vaste stof. Het weer 5 gesuspendeerde bezinksel wordt dan gecentrifugeerd voor het verkrijgen van een centrifugeringsprodukt, dat bruikbaar is als aanvulling voor diervoeders.

'Voorbeelden van enzymen, die geschikt zijn voor het gebruik bij de uitvoering van de werkwijze volgens de 10 uitvinding zijn alkalische proteasen, zoals B. subtilis-protease, B« lieninoformis-nrotease en B. amvlofaciens-protease, of neutrale proteasen, zoals neutraal B. subtilis-proteases. Deze enzymen zijn in de handel verkrijgbaar en zo is bijvoorbeeld een geschikt alkalisch protease-enzym 15 het Ehozyme P-62, geleverd door fiohm and Haas Co., en een geschikt neutraal protease-enzym het Enzeco Bacterial Protease, dat geleverd wordt door Enzyme Development Corp.

De uitvinding wordt nader beschreven aan de hand van de volgende voorbeelden, die alleen ter -toelichting 20 dienen en geen beperking van de uitvinding inhouden.

Voorbeeld I

Ha afloop van de fermentatie wordt 1 liter ribo-flavine-fermentatie-bouillon gedurende 30 minuten op een temperatuur van 60°C verwarmd. De bouillon wordt daarna tot 25 een temperatuur van 25°C afgekoeld en met gedestilleerd water tot een volume van 1,4 liter verdund. De verdunde bouillon wordt gecentrifugeerd, waarna het bij het centrifugeren verkregen bezinksel weer in tweemaal het volume aan water wordt gesuspendeerd en opnieuw gecentrifugeerd. 30 De zuiverheid van het bij het centrifugeren verkregen pro-dukt is driemaal groter dan de zuiverheid van de niet-be-handelde gedroogde fermentutie-bouillon en is van voldoende zuiverheid om het gebruik daarvan zonder verdere behandeling als aanvulling voor diervoerders mogelijk te maken. 35 7904180 4

Voorbeeld II

Na afloop van de fermentatie wordt 1 liter ribo-flavine-fermentatie-bouillon op een temperatuur van 60°C verwarmd, waarna een hoeveelheid van 0,068 g B, subtilis alkalisch protease met een caseïne-activiteit van 3,65 5 eenheden wordt toegevoegd, dat men gedurende 3 uren laat reageren. Eén caseine-eenheid wordt gedefinieerd als het vermogen van 1 g enzym om 270 g azo-caseïne in verloop van één uur bij 40°C en een pH van 8,0 te solubiliseren. Na het verwarmen wordt de bouillon afgekoeld tot een tempera- 10 tuur van 25°C, tot een pH van 7*0 geneutraliseerd en met gedestilleerd water verdund tot een volume van 1,4 liter.

De verdunde bouillon wordt gecentrifugeerd, waarna het bij het centrifugeren verkregen bezinksel weer in twee volumina water wordt gesuspendeerd en opnieuw gecentrifu- 15 geerd. De zuiverheid van het verkregen centrifugeringspro-dukt is 20 % hoger dan bij voorbeeld I.

Voorbeeld III

Een monster van riboflavine-fermentatie-bouillon . . wordt op precies dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld 20 II verwerkt, waarbij evenwel 0,48 g B. lierninoformis alkalisch protease met een Anson-activiteit van 3»0 eenheden in plaats van het B. subtilis alkalische protease wordt gebruikt. Eén Anson-eenheid wordt gedefinieerd als het aantal grammen hemoglobine dat in verloop van 10 minuten 25 bij 25°C en een pH van 10,1 door 1 g enzym wordt afgebroken en bij toevoeging van trichloorazijnzuur geen neerslag vormt. De zuiverheid van het metbenzym behandelde bezinksel is 27 % hoger dan van het niet met enzym behandelde bezinksel. Het met enzym behandelde bezinksel is 3»4 malen 30 zuiverder dan niet-behandelde gedroogde fermentatie-bouil-lon.

De enzymbehandeling van de fermentatie-bouillon kan gelijktijdig met de thermische sterilisering in het fermentatievat worden uitgevoerd, waarbij soortgelijke re- 35 sultaten worden verkregen.

790 4 1 80 V . £ 5

Voorbeeld XV

Een hoeveelkeid van 553 ml gepasteuriseerde ribo-flavine-fermentatie-bouillon wordt met 10 ml van een voe-dingsbouillon entcultuur van B. subtilis (National Collection ïype Culture No. 3610) geënt. De bebroeding wordt ge- 5 durende 48 uren bij een temperatuur van 37°c voortgezet, ïijdens de bebroeding neemt het gesuspendeerde vaste materiaal met 72 % af. De met B. subtilis bebroede bouillon wordt verwarmd, met water tot 750 ml verdund en gecentrifugeerd. Het bij het centrifugeren verkregen bezinksel 10 wordt met 200 ml water gesuspendeerd en opnieuw gecentrifugeerd. Het bij het centrifugeren verkregen produkt is 53 % zuiverder dan een niet met B. subtilis behandeld control e-mat er iaal en 4,4 malen zuiverder dan gedroogde fer-mentatie-bouillon. 15

Voorbeeld V

Het voorschrift van voorbeeld I wordt herhaald afgezien van het feit, dat vóór het centrifugeren het weer gesuspendeerde centrifuge-produkt op een pH van 8,0 wordt ingesteld en tot een temperatuur van 60°C verwarmd. Daarna 20 wordt 0,049 g B« subtilis alkalisch protease-enzym met een activiteit van 3»65 caseïne-eenheden toegevoegd, dat men gedurende een periode van 3 uren laat reageren. De suspensie wordt afgekoeld, geneutraliseerd en gecentrifugeerd.

De zuiverheid van het bij het centrifugeren verkregen pro- 25 dukt is 41 % hoger dan van een vergelijkend monster, dat niet aan de enzym-behandeling is onderworpen. Equivalente enzym-behandelingen, die aan dezelfde bouillon van dezelfde fermentatie-gang werden uitgevoerd, leverden slechts een verhoging van de zuiverheid met 20 % ten opzichte van de 30 controles.

7904180

Claims

1. Werkwijze voor het winnen van een gezuiverd rihoflavine uit een rihoflavine bevattende fermentatieboui11on, met het kenmerk, dat men de bouillon, wanneer de fermen- tatie-opbrengst ongeveer maximaal is, gedurende ongeveer 15 tot 5 ongeveer 45 minuten op een temperatuur van ongeveer 50 tot ongeveer 65°C verwarmt, aan de fermentatie-bouillon water toevoegt in een onvoldoende hoeveelheid om gesuspendeerde vaste stoffen in de bouillon op te lossen maar voldoende om de scheiding te optimeren door ener- 10 zijds een verdunning van de te voren opgeloste vaste stoffen en anderzijds een afscheiding door centrifugeren van gesuspendeerde deeltjes met een kleiner soortelijk gewicht dan het soortelijk gewicht van kristallijn rihoflavine mogelijk te maken, 15 de fermentatie-bouillon, die de toegevoegde hoeveelheid water bevat, centrifugeert voor het verkrijgen van een bezinksel, het bezinksel opnieuw met een onvoldoende hoeveelheid water suspendeert om gesuspendeerde vaste stoffen op te lossen, maar evenwel voldoende om de afscheiding van vaste deeltjes 20 met een kleiner soortelijk gewicht dan het soortelijk gewicht van kristallijn rihoflavine te optimeren, en het--weer gesuspendeerde bezinksel centrifugeert voor het verkrijgen van een gezuiverd rihoflavine bevattend centrifugeringsprodukt, dat als zodanig bruikbaar is als aanvulling voor diervoeders, 25

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de aan de fermentatie-bouillon toegevoegde hoeveelheid water ongeveer 25 vol.96 tot ongeveer 100 vol.% van het aanvankelijke volume van de fermentatiebouillon bedraagt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, dat het aan de 30 fermentatiebouillon toegevoegde volume water gelijk is aan ongeveer 1 /3 tot ongeveer 1 /2 van het aanvankelijke vokume van de fermentatie-bouillon.

4· Werkwijze volgens een of meer der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat de toegepaste vo- 35 lume-hoeveelheid water voor het opnieuw suspenderen van het 7904180 bezinksel ongeveer 1 tot 3 malen het volume van het bezinksel bedraagt.

5. Werkwijze volgens een of meer der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat men de bouillon voor het centrifugeren onder vorming van een bezinksel met een 5 proteolytisch enzym behandelt, dat het riboflavine niet beïnvloedt maar effectief is hetzij voor het solubiliseren van eïwit-aohtig materiaal hetzij het omzetten daarvan in een materiaal met een lager soortelijk gewicht, dat door centrifugeren kan worden afgescheiden. 10

6. Werkwijze volgens een of meer der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat men het weer gesuspendeerde bezinksel alvorens het te centrifugeren met een proteolytisch enzym behandelt.

7- Diervoeder, gekenmerkt door een ribo- 15 flavineaanvulling te verkrijgen volgens de werkwijze van één of meer der voorafgaande conclusies. 790 4 1 80