JP2979767B2 - 発酵法によるリボフラビンの製造法 - Google Patents
発酵法によるリボフラビンの製造法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるリボフラビ
ンの製造法に関する。リボフラビンは医薬、飼料添加
剤、食品用の着色剤等として有用な物質である。
ンの製造法に関する。リボフラビンは医薬、飼料添加
剤、食品用の着色剤等として有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】従来、発酵法によるリボフラビンの製造
法としては、エレモテシウム・アシュビイ、アシュビア
・ゴシッビイ、キャンディダ・フラレリイあるいはバチ
ルス・ズブチリス等を糖質含有培地中で培養して、培養
液中にリボフラビンを生成蓄積せしめる方法が知られて
いる（プログレス・インダストリアル・ミクロバイオロ
ジー、第１巻、１３９頁、１９５９年、ベルギー国特許
第８９０９１７号、特公昭５３−１０１５５号公報）。
しかし、これらの方法で使用される微生物はリボフラビ
ンの蓄積濃度あるいは生産速度が低く、リボフラビンの
工業生産において満足できるものではなかった。
法としては、エレモテシウム・アシュビイ、アシュビア
・ゴシッビイ、キャンディダ・フラレリイあるいはバチ
ルス・ズブチリス等を糖質含有培地中で培養して、培養
液中にリボフラビンを生成蓄積せしめる方法が知られて
いる（プログレス・インダストリアル・ミクロバイオロ
ジー、第１巻、１３９頁、１９５９年、ベルギー国特許
第８９０９１７号、特公昭５３−１０１５５号公報）。
しかし、これらの方法で使用される微生物はリボフラビ
ンの蓄積濃度あるいは生産速度が低く、リボフラビンの
工業生産において満足できるものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リボ
フラビンの生産能の向上した菌株を得ることにより、安
価かつ効率的な発酵法によるリボフラビンの製造法を提
供することである。
フラビンの生産能の向上した菌株を得ることにより、安
価かつ効率的な発酵法によるリボフラビンの製造法を提
供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リボフラ
ビンを効率よく発酵生産する方法を開発するために鋭意
研究を重ねた結果、バチルス属に属し、５′−グアニル
酸（以下、５′−ＧＭＰと記す）より燐酸を遊離する活
性が低下し、リボフラビン生産能を有する変異株の使用
がその目的に適合し得ることを見いだし、この知見に基
づいて本発明を完成させるに至った。
ビンを効率よく発酵生産する方法を開発するために鋭意
研究を重ねた結果、バチルス属に属し、５′−グアニル
酸（以下、５′−ＧＭＰと記す）より燐酸を遊離する活
性が低下し、リボフラビン生産能を有する変異株の使用
がその目的に適合し得ることを見いだし、この知見に基
づいて本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、バチルス属に属し、
５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性が低下し、リボフ
ラビン生産能を有する変異株を液体培地中で培養し、培
養液中にリボフラビンを生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする発酵法によるリボフラビンの製造法
を提供するものである。
５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性が低下し、リボフ
ラビン生産能を有する変異株を液体培地中で培養し、培
養液中にリボフラビンを生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする発酵法によるリボフラビンの製造法
を提供するものである。
【０００６】本発明で使用する変異株は、バチルス属に
属し、５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性が低下し、
リボフラビン生産能を有する変異株である。また、これ
らの性質に加えて、核酸塩基アナログ耐性等、リボフラ
ビンの生産能を高めることが従来知られている他の性質
（特公昭５３−１０１５５号公報参照）を付与すること
により、更に生産能の高い変異株を得ることもできる。
属し、５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性が低下し、
リボフラビン生産能を有する変異株である。また、これ
らの性質に加えて、核酸塩基アナログ耐性等、リボフラ
ビンの生産能を高めることが従来知られている他の性質
（特公昭５３−１０１５５号公報参照）を付与すること
により、更に生産能の高い変異株を得ることもできる。
【０００７】本発明で使用する変異株を具体的に例示す
れば以下のものがある。 バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２４５５） （アデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠損、（プリン
＋８−アザキサンチン）耐性、５′−ＧＭＰより燐酸を
遊離する活性低下）
れば以下のものがある。 バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２４５５） （アデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠損、（プリン
＋８−アザキサンチン）耐性、５′−ＧＭＰより燐酸を
遊離する活性低下）
【０００８】このような変異株を得る際に使用される親
株としては、バチルス属に属する菌株を使用することが
できる。具体的に例示すると次のようなリボフラビン生
産菌が用いられる。 バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２４５６） （アデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠損、（プリン
＋８−アザキサンチン）耐性）
株としては、バチルス属に属する菌株を使用することが
できる。具体的に例示すると次のようなリボフラビン生
産菌が用いられる。 バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２４５６） （アデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠損、（プリン
＋８−アザキサンチン）耐性）
【０００９】親株を変異処理する方法は、例えばＸ線や
紫外線の照射あるいはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン等の変異誘導剤に接触せしめる等の
通常の変異処理法が適用できる。
紫外線の照射あるいはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン等の変異誘導剤に接触せしめる等の
通常の変異処理法が適用できる。
【００１０】本発明の変異株の取得のより具体的な実験
例を以下に示す。
例を以下に示す。
【００１１】バチルス・ズブチリス ＡＴＣＣ１３９５
２より誘導したアデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠
損、（プリン＋８−アザキサンチン）耐性のリボフラビ
ン生産菌バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２４５６）を、可溶性でんぷん２．５％、
酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．３％、塩化ナト
リウム０．１％（ｐＨ７．０）を含む液体栄養培地に接
種し、３４℃で１６時間振とう培養して得た培養液１ｍ
ｌを同様の栄養培地４ｍｌに接種し、３４℃で振とう培
養を行った。培養液の５６２ｎｍにおける濁度が０．８
になった時点で遠心集菌し、得られた菌体を５０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。次いで洗浄菌体を
同緩衝液５ｍｌに懸濁し、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン５００μｇ／５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）５ｍｌを添加して氷冷下で４０分静置
した。処理後の菌体を同緩衝液で洗浄した後５ｍｌの同
緩衝液に懸濁し、上記組成の栄養培地の寒天平板培地に
塗抹した。３４℃で２日間培養してコロニーの生育を確
認した後、４−ニトロフェニル燐酸二ナトリウム溶液／
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）に浸した濾紙をプ
レートにのせ、室温で５分間放置した。５′−ＧＭＰよ
り燐酸を遊離する活性が強い菌株のコロニーは生成した
４−ニトロフェノールにより黄色く発色するため、黄色
の発色が弱いコロニーを５′−ＧＭＰより燐酸を遊離す
る活性が低下した菌株として選択した。
２より誘導したアデニン要求性、ＧＭＰレダクターゼ欠
損、（プリン＋８−アザキサンチン）耐性のリボフラビ
ン生産菌バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２４５６）を、可溶性でんぷん２．５％、
酵母エキス０．３％、ポリペプトン０．３％、塩化ナト
リウム０．１％（ｐＨ７．０）を含む液体栄養培地に接
種し、３４℃で１６時間振とう培養して得た培養液１ｍ
ｌを同様の栄養培地４ｍｌに接種し、３４℃で振とう培
養を行った。培養液の５６２ｎｍにおける濁度が０．８
になった時点で遠心集菌し、得られた菌体を５０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。次いで洗浄菌体を
同緩衝液５ｍｌに懸濁し、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン５００μｇ／５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）５ｍｌを添加して氷冷下で４０分静置
した。処理後の菌体を同緩衝液で洗浄した後５ｍｌの同
緩衝液に懸濁し、上記組成の栄養培地の寒天平板培地に
塗抹した。３４℃で２日間培養してコロニーの生育を確
認した後、４−ニトロフェニル燐酸二ナトリウム溶液／
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）に浸した濾紙をプ
レートにのせ、室温で５分間放置した。５′−ＧＭＰよ
り燐酸を遊離する活性が強い菌株のコロニーは生成した
４−ニトロフェノールにより黄色く発色するため、黄色
の発色が弱いコロニーを５′−ＧＭＰより燐酸を遊離す
る活性が低下した菌株として選択した。
【００１２】次に親株であるバチルス・ズブチリス Ａ
Ｊ１２６４３と得られた変異株のそれぞれを上記組成の
液体栄養培地に接種し、３４℃で１６時間振とう培養し
た。生育した菌体を遠心集菌し生理食塩水で洗浄した
後、菌体懸濁液を２００Ｗ、７分の条件で超音波破砕し
た。この菌体破砕液を４０ｍＭ（最終濃度）５′−ＧＭ
Ｐ溶液／２００ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に加
えて３４℃で２時間反応させ、生成したグアノシンをＨ
ＰＬＣ（カラム：三菱化成工業社製ＣＰＫ−０８、溶離
液：３％ギ酸リチウム（ｐＨ４．７５）、検出法：ＵＶ
２６０ｎｍ）で定量することにより５′−ＧＭＰより燐
酸を遊離する活性を測定した。また、これらの菌株を上
述の液体栄養培地４ｍｌに接種し３４℃で１６時間培養
して得た培養液を、表１に示す組成のリボフラビン生産
培地に５％の植菌量で接種して３４℃で３日間培養を行
い、各菌株のリボフラビンの生産能を測定した。
Ｊ１２６４３と得られた変異株のそれぞれを上記組成の
液体栄養培地に接種し、３４℃で１６時間振とう培養し
た。生育した菌体を遠心集菌し生理食塩水で洗浄した
後、菌体懸濁液を２００Ｗ、７分の条件で超音波破砕し
た。この菌体破砕液を４０ｍＭ（最終濃度）５′−ＧＭ
Ｐ溶液／２００ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に加
えて３４℃で２時間反応させ、生成したグアノシンをＨ
ＰＬＣ（カラム：三菱化成工業社製ＣＰＫ−０８、溶離
液：３％ギ酸リチウム（ｐＨ４．７５）、検出法：ＵＶ
２６０ｎｍ）で定量することにより５′−ＧＭＰより燐
酸を遊離する活性を測定した。また、これらの菌株を上
述の液体栄養培地４ｍｌに接種し３４℃で１６時間培養
して得た培養液を、表１に示す組成のリボフラビン生産
培地に５％の植菌量で接種して３４℃で３日間培養を行
い、各菌株のリボフラビンの生産能を測定した。
【００１３】
【表１】
【００１４】その結果、表２に示すように、親株である
バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３に比べて、得ら
れた変異株ではいずれも５′−ＧＭＰより燐酸を遊離す
る活性が低下している一方、培養液中に蓄積したリボフ
ラビンの量は変異株の方が明らかに向上していた。
バチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４３に比べて、得ら
れた変異株ではいずれも５′−ＧＭＰより燐酸を遊離す
る活性が低下している一方、培養液中に蓄積したリボフ
ラビンの量は変異株の方が明らかに向上していた。
【００１５】
【表２】
【００１６】次いで上記の操作により得られた５′−Ｇ
ＭＰより燐酸を遊離する活性が低下した変異株の一つで
あるバチルス・ズブチリスＮｏ．１８９に同様の方法で
変異処理を行い、５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性
がさらに低下した変異株バチルス・ズブチリス ＡＪ１
２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４５５）を取得した。バ
チルス・ズブチリス ＡＪ１２６４４とその親株である
Ｎｏ．１８９の５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性と
培養液中に蓄積したリボフラビンの量は表３の通りであ
る。
ＭＰより燐酸を遊離する活性が低下した変異株の一つで
あるバチルス・ズブチリスＮｏ．１８９に同様の方法で
変異処理を行い、５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性
がさらに低下した変異株バチルス・ズブチリス ＡＪ１
２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４５５）を取得した。バ
チルス・ズブチリス ＡＪ１２６４４とその親株である
Ｎｏ．１８９の５′−ＧＭＰより燐酸を遊離する活性と
培養液中に蓄積したリボフラビンの量は表３の通りであ
る。
【００１７】
【表３】
【００１８】リボフラビンは５′−ＩＭＰ、５′−ＧＭ
Ｐ、５′−ＧＴＰ等のヌクレオチドを経由して生合成さ
れるが、５′−ヌクレオチドより燐酸を遊離する活性が
高いと脱燐酸してヌクレオシドに変換され菌体外に放出
されてしまうのに対し、本発明で使用される変異株では
５′−ヌクレオチドより燐酸を遊離する活性が低下した
結果、より多くのリボフラビン生合成の前駆体が供給さ
れ、リボフラビンの蓄積量の向上につながったものと考
えられる。
Ｐ、５′−ＧＴＰ等のヌクレオチドを経由して生合成さ
れるが、５′−ヌクレオチドより燐酸を遊離する活性が
高いと脱燐酸してヌクレオシドに変換され菌体外に放出
されてしまうのに対し、本発明で使用される変異株では
５′−ヌクレオチドより燐酸を遊離する活性が低下した
結果、より多くのリボフラビン生合成の前駆体が供給さ
れ、リボフラビンの蓄積量の向上につながったものと考
えられる。
【００１９】本発明の変異株を用いてリボフラビンを生
産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必
要に応じて有機微量栄養素及び使用する微生物が要求す
る栄養物質を含有する通常の液体培地が使用される。炭
素源としては、使用する変異株が利用可能なものであれ
ばよく、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、デン
プン加水分解液等が使用される。また窒素源としては、
硫安、尿素、アンモニア等が使用できる。有機微量栄養
素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さら
にこれらのものを含有する酵母エキス、ペプトン、カザ
ミノ酸、大豆蛋白加水分解物等が使用される。
産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必
要に応じて有機微量栄養素及び使用する微生物が要求す
る栄養物質を含有する通常の液体培地が使用される。炭
素源としては、使用する変異株が利用可能なものであれ
ばよく、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、デン
プン加水分解液等が使用される。また窒素源としては、
硫安、尿素、アンモニア等が使用できる。有機微量栄養
素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さら
にこれらのものを含有する酵母エキス、ペプトン、カザ
ミノ酸、大豆蛋白加水分解物等が使用される。
【００２０】培養方法は、発酵温度３０〜４０℃、好ま
しくは３４〜３７℃に制御しつつ通気培養を行う。培養
開始時及び培養中のｐＨは６．０〜７．５、好ましくは
６．５〜７．０に保つのがよく、ｐＨの調整には無機あ
るいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用すること
ができる。かくして１ないし５日間培養を行うことによ
り、培養液中に著量のリボフラビンが生成蓄積される。
しくは３４〜３７℃に制御しつつ通気培養を行う。培養
開始時及び培養中のｐＨは６．０〜７．５、好ましくは
６．５〜７．０に保つのがよく、ｐＨの調整には無機あ
るいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用すること
ができる。かくして１ないし５日間培養を行うことによ
り、培養液中に著量のリボフラビンが生成蓄積される。
【００２１】培養終了後の培養液からのリボフラビンを
採取する方法は公知の方法に従って行えばよい。例え
ば、培養液より菌体を除去した後、ハイドロサルファイ
トを適当量添加し、軽く撹拌して２０℃にて遠心分離し
てリボフラビンの還元型粗結晶を採取する。この粗結晶
を１Ｎ酢酸溶液に懸濁し加熱溶解した後、濾過により不
溶物を除去し冷却することにより結晶を析出させる。こ
の結晶を濾別し、乾燥させることによりリボフラビン結
晶を得ることができる。
採取する方法は公知の方法に従って行えばよい。例え
ば、培養液より菌体を除去した後、ハイドロサルファイ
トを適当量添加し、軽く撹拌して２０℃にて遠心分離し
てリボフラビンの還元型粗結晶を採取する。この粗結晶
を１Ｎ酢酸溶液に懸濁し加熱溶解した後、濾過により不
溶物を除去し冷却することにより結晶を析出させる。こ
の結晶を濾別し、乾燥させることによりリボフラビン結
晶を得ることができる。
【００２２】
【実施例】次に実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。
る。
【００２３】
【実施例１】表４に示す組成のリボフラビン生産培地を
５ｌ容発酵槽に２ｌ分注し、１２１℃、１５分加熱殺菌
した。この培地に、あらかじめ液体栄養培地で３４℃、
１６時間培養したバチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４
４の種培養液１００ｍｌを接種し、発酵温度３４℃、通
気量０．５ｖｖｍ、撹拌数７００ｒｐｍの条件で、アン
モニアによりｐＨを６．５に制御しつつ３日間培養を行
った。その結果、リボフラビン１．０５ｇ／ｌを含む培
養液１．８ｌを得た。培養液より遠心分離により菌体を
除去した後、ハイドロサルファイトを２０ｇ添加し軽く
撹拌して遠心分離を行い、リボフラビン粗結晶１．８ｇ
を得た。この粗結晶を１Ｎ酢酸溶液５００ｍｌに懸濁
し、少量の飽和過マンガン酸溶液を加えて酸化した。次
いで煮沸溶解し熱時濾過し、放冷後析出してきた結晶を
濾過してリボフラビン結晶７５０ｍｇを採取した。これ
を更に再結することによりリボフラビンの純結晶５６０
ｍｇが得られた。
５ｌ容発酵槽に２ｌ分注し、１２１℃、１５分加熱殺菌
した。この培地に、あらかじめ液体栄養培地で３４℃、
１６時間培養したバチルス・ズブチリス ＡＪ１２６４
４の種培養液１００ｍｌを接種し、発酵温度３４℃、通
気量０．５ｖｖｍ、撹拌数７００ｒｐｍの条件で、アン
モニアによりｐＨを６．５に制御しつつ３日間培養を行
った。その結果、リボフラビン１．０５ｇ／ｌを含む培
養液１．８ｌを得た。培養液より遠心分離により菌体を
除去した後、ハイドロサルファイトを２０ｇ添加し軽く
撹拌して遠心分離を行い、リボフラビン粗結晶１．８ｇ
を得た。この粗結晶を１Ｎ酢酸溶液５００ｍｌに懸濁
し、少量の飽和過マンガン酸溶液を加えて酸化した。次
いで煮沸溶解し熱時濾過し、放冷後析出してきた結晶を
濾過してリボフラビン結晶７５０ｍｇを採取した。これ
を更に再結することによりリボフラビンの純結晶５６０
ｍｇが得られた。
【００２４】
【表４】
【００２５】
【発明の効果】本発明で使用する変異株は、親株に比べ
てリボフラビンの生産能が向上しており、著量のリボフ
ラビンを培養液中に生成蓄積させることができるため、
本発明の方法は、安価かつ効率的な発酵法によるリボフ
ラビンの製造法として好適である。
てリボフラビンの生産能が向上しており、著量のリボフ
ラビンを培養液中に生成蓄積させることができるため、
本発明の方法は、安価かつ効率的な発酵法によるリボフ
ラビンの製造法として好適である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 25/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 バチルス属に属し、５′−グアニル酸よ
り燐酸を遊離する活性が低下し、リボフラビン生産能を
有する変異株を液体培地中で培養し、培養液中にリボフ
ラビンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する発酵法によるリボフラビンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3227864A JP2979767B2 (ja) | 1991-09-09 | 1991-09-09 | 発酵法によるリボフラビンの製造法 |
| EP92113274A EP0531708B1 (en) | 1991-09-09 | 1992-08-04 | Process for producing riboflavin by fermentation |
| DE69218700T DE69218700T2 (de) | 1991-09-09 | 1992-08-04 | Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation |
| US07/942,191 US5334510A (en) | 1991-09-09 | 1992-09-09 | Process for producing riboflavin by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3227864A JP2979767B2 (ja) | 1991-09-09 | 1991-09-09 | 発酵法によるリボフラビンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564597A JPH0564597A (ja) | 1993-03-19 |
| JP2979767B2 true JP2979767B2 (ja) | 1999-11-15 |
Family
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