CH668081A5

CH668081A5 - Verfahren zur herstellung von riboflavin.

Info

Publication number: CH668081A5
Application number: CH253084A
Authority: CH
Inventors: Anatoly Ivanovich Stepanov; Viktor Grigorievich Zhdanov; Anna Yakovlevna Kukanova; Mikhail Yakovlevich Khaikinson; Peter Mikhailovich Rabinovich; Jurgis Antanas Vladov Iomantas; Zoya Mikhailovna Galushkina
Original assignee: Vnii Genetiki Selek
Priority date: 1983-06-02
Filing date: 1984-05-23
Publication date: 1988-11-30
Also published as: HUT34776A; FR2546907B1; YU94784A; HU191129B; DE3420310A1; FR2546907A1

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Industrie und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, das als Zuschlag zum Viehfutter, in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie Verwendung findet.

Es ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Riboflavin durch Verwendung der Kultur des Pilzes Ere-mothecium ashbyii auf einem Sojafermentationsmedium bekannt, das Hydrol und Maisquellwasser enthält (SU-PS Nr. 389132, Kl. C12D 5/04,1969). Für 96 Stunden Fermentation werden 2000 bis 2500 mg/1 Riboflavin angereichert. Das genannte Verfahren wird durch eine längere Periode des Kulturwachstums, was die Fermentationsdauer erhöht, und eine erhöhte Empfindlichkeit der Kultur gegen die Verunreinigungen mit einer fremden Mikroflora gekennzeichnet.

Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Kultivierung dessen Produzenten - der Mikroorganismen der Gattung Bacillus subtilis - auf einem Nährmedium bekannt, das 8% Glukose als Kohlenstoffquelle, Mineralsalze und Wachstumsstimulatoren: Hefeextrakt, Pepton, Glutaminsäure, Präparate der Ribonukleinsäure, Purine und Purinana-loga enthält (US-PS Nr. 3900368, Kl. 195-196,1976). Für 44 Stunden Fermentation werden bis 560 mg/1 Riboflavin angereichert.

Das gegebene Verfahren zur Herstellung von Riboflavin wird durch eine hohe Geschwindigkeit des Bacillus-Wachstum und folglich durch die Verminderung der Fermentationsdauer gekennzeichnet. Die Nachteile des genannten Verfahrens bestehen jedoch in einem verhältnismässig niedrigen Niveau der Aktivität, das die Kultur Bacillus subtilis erreicht, und in der Notwendigkeit, der Zusammensetzung nach komplizierte Fermentations- und Wachstumsnährmedien zu verwenden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch die Verwendung eines neuen, Riboflavin produzierenden Stammes die Ausbeute an Endprodukt zu erhöhen und dessen Herstellungstechnologie zu vereinfachen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass im Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Submerskultivierung unter Belüftung des Riboflavin produzierenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus subtilis auf einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralsalze, Wachstumsstimulatoren enthält, und darauffolgende Isolierung des Endproduktes erfindungsgemäss als der Riboflavin produzierende Mikroorganismus der Stamm Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 verwendet wird, der im Vseso-juzny nauchnoissledovatelsky institut Antibiotikov, USSR, Moskva, Nagatinskaya ulitsa 3a, am 13. April 1983 hinterlegt 5 worden ist.

Zwecks der Erhöhung der Ausbeute an Riboflavin wird die Kohlenwasserstoffquelle in das Nährmedium anfänglich in einer Menge von 5 bis 7 Gew.-% vom Mediumsgewicht eingetragen und nach 12 bis 18 Stunden Kultivierung in einer io Menge von 3 bis 5 Gew.-% zugegeben. Um die Ausbeute an Riboflavin zu erhöhen, ist es zweckmässig, die Kultivierung bei einer Temperatur von 39 bis 41 °C durchzuführen.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, die Ausbeute an Riboflavin im Vergleich zur bekannten Methode um das 15 4-8fache dank der Verwendung eines hochaktiven Produzentenstammes zu erhöhen. Ausserdem gestattet das Verfahren, einfache, leicht zugängliche Nährmedien zu verwenden. Der im erfindungsgemässen Verfahren verwendbare neue Stamm Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45, der Riboflavin-20 Produzent, wurde nach der Methode der genetischen Inge-nieurie erhalten.

Die Arbeit zum Konstruieren des Stammes VNIIGenetika 304/pMX45 schliesst einige Stufen ein:

1. Das Konstruieren nach der Methode der genetischen 25 Ingenieurie der Hybridplasmide, die das Riboflavin-Operon

B. subtilis trägt.

2. Die Einführung der erhaltenen Plasmide in den Rezi-pientenstamm.

3. Die Sicherung der Expression des Riboflavin-Operons 30 im Bestand der Plasmide in der Wirtszelle.

Zum Vektor pMX33, der die Beständigkeit der Bazillen gegen Erythromyzin bestimmt und ein Molekulargewicht von 12 MDalton hat, wurde das Bruchstück der Desoxyribonukleinsäure angegliedert, das die Gene des Riboflavin-Operons 35 Bacillus subtilis enthält. Im Ergebnis wurde die Hybridplasmide erhalten, der die Benennung pMX45 verliehen wurde, die die Beständigkeit gegen 20 jxg/ml Erythromyzin bedingt (Molekulargewicht beträgt 18 MDalton).

Als Rezipientenstamm, in den die Plasmide pMX45 einge-40 führt wurde, diente der Stamm B. subtilis VNIIGenetika 304. Dieser Rezipientenstamm ist nach genetischen Methoden aus unabhängig erhaltenen Mutationen konstruiert worden, von denen jede zur Hypersynthese des Vitamins führt: rosr - ribc - AGR (Beständigkeit gegen Roseoflavin rosr, Mutation im t5 regulierenden Gen ribc, Beständigkeit gegen 8 Azaguanin AGR). Nachher wurde die mutagene Bearbeitung mit Nitro-soguanidin, Nitrosomethylharnstoff, Ultraviolettbestrahlung und die Selektion der aktiven Varianten auf dem Fermentationsnährmedium durchgeführt.

so Die Plasmide pMX45 wurde in den Rezipientenstamm nach der Methode der genetischen Transformation eingeführt. Die Transformanten wurden nach den Merkmalen der Beständigkeit gegen 20 ug/ml Erythromyzin und nach der Erhöhung des Niveaus der Riboflavin-Biosynthese gewählt. 55 In den Transformanten, die gleichzeitig die Hybridplasmide und im Chromosom Gene tragen, die die Konstitutionssynthese von Riboflavin sichern, wird eine effektive Expression des Riboflavin-Operons im Bestände der Hybridplasmide festgestellt.

60 Der Stamm Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 ist fähig, bis 4500 mg/1 Riboflavin (Vitamin B2) zu synthetisieren. Der Stamm Bazillus subtilis VNIIGenetika 304/ pMX45 hat mit dem Rezipientenstamm B. subtilis VNIIGenetika 304 ähnliche morphologiche und Kulturcharakteristi-65 ken.

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Tabelle

Morphologische und Kulturcharakteristiken des Stammes VNIIGenetika 304/pMX45

Nr. Morphologie unter Sporenbildender grampositiver Bacillus dem Mikroskop von 2 bis 3 jx Länge 1 2 3

Morphologie auf verschiedenen

Nährmedien

1 Fleisch-Pepton- Am 1. bis 2. Wachstumstag bei einer Agar Temperatur von 28 bis 37 ° C ; bildet sternartige Kolonien mit einem unglatten Rand von 3 bis 4 mm Durchmesser, die Oberfläche ist glatt, glänzend, von gelber Farbe.

2 Fleisch-Pepton- Das Wachstum nach dem Stich ist Bouillon mässig, hauptsächlich auf der

Oberfläche des Nährmediums. Beim Wachstum ohne Schütteln wird auf der Oberfläche ein Film gebildet.

3 Minimalmedium Am 2. Wachstumstag; bildet nach Spicizen mit hellgelbe Kolonien von 2 bis 3 mm Glukose Durchmesser, die in den

UV-Strahlen mit einem gelben Licht fluoreszieren; die Kolonien sind rund, glänzend.

4 Physiologische Es wächst bei einer Temperatur von und biochemische 28 bis 42°C; das Optimum liegt bei Merkmale 37 ° C und einem pH-Wert von 5,0

bis 9,0. Kohlenstoffquellen: assimiliert gut Glukose, Saccharose, Stärke. Stickstoffquellen: assimiliert gut Ammonium, Harnstoff, Nitrate. Verflüssigt Gelatine.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Riboflavin wird folgenderweise verwirklicht.

Die 24 Stunden alte auf dem Fleisch-Pepton-Schrägagar oder Fleisch-Pepton-Agar mit 20 y/ml Erythromyzin gezüchtete Kultur wird in Kolben mit einem Saatkulturmedium überimpft, das Melasse oder Saccharose, die getrocknete Biomasse der Futterhefe und Mineralsalze enthält. Das Inoku-lum wird während 17 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 37 ° C unter Belüftung gezüchtet und in einer Menge von 10 Gew.-% in das Hauptfermentationsmedium eingetragen. Die Fermentation wird bei 37 bis 41 °C im Fermenter unter intensivem Rühren und Belüftung verwirklicht. Das Fermentationsmedium enthält als Kohlenstoffquelle Glukose oder Saccharose oder Melasse oder Stärke, die Quellen des Mineralstickstoffes, beispielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze oder Nitrate sowie Mineralsalze. Als Quellen der Wachstumsfaktoren im Nährmedium können die getrocknete Biomasse der Futter- oder Nährhefe oder Hefeextrakt, Pepton, Kaseinhydrolysat, Maisquellwasser verwendet werden. Die Fermentation kann nach 2 Verfahren durchgeführt werden. Beim 1. Verfahren werden alle notwendigen Kohlenstoffquellen ins Nährmedium auf einmal eingetragen, beim 2. Verfahren enthält das Fermentationsmedium zunächst 5 bis 7 Gew.-% Kohlenstoffquelle, und die anderen 3 bis 5 Gew.-% werden nach 12 bis 18 Stunden zugegeben, wenn die Kultur die stationäre Wachstumsphase erreicht hat. Nach 40 bis 48 Stunden Kultivierung des Stammes B.subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 werden in der Kulturflüssigkeit 1600 bis 4500 mg/1 Riboflavin angereichert.

Das Endprodukt wird in an sich bekannter Weise durch Eindampfen der erhaltenen Kulturflüssigkeit zusammen mit der Biomasse isoliert. Dabei wird Riboflavin-Konzentrat erhalten. Riboflavin kann auch in reiner Form, in Form eines kristallinen Stoffes nach der bekannten Technologie isoliert werden. Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, die Ausbeute an Riboflavin um das 4-8fache im Vergleich zum bekannten Verfahren zu erhöhen und die Herstellungstechnologie dank der Verwendung von einfachen leicht zugänglichen Nährmedien zu vereinfachen.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden folgende Beispiele zur Herstellung von Riboflavin angeführt.

Beispiel 1

Eine 24 Stunden alte Kultur von Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45, die auf dem Fleisch-Pepton-Schräg-agar gezüchtet wurde, wird mit der Öse auf ein flüssiges Inokulationsmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% überimpft:

Melasse 6,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 1,0

(NH4)2S04 0,1

KH2P04 0,3

K2HP04 0,7

MgS04 0,01

Wasser alles übrige der pH-Wert 6,5

Das Inokulum wird in Erlenmeyerkolben von 750 ml Inhalt (das Volumen des Nährmediums beträgt 25 ml) auf einem Schütteltisch bei 200 U/min und einer Temperatur von 37 °C innerhalb von 20 Stunden gezüchtet und in einer Menge von 10 Gew.-% ins Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% eingetragen:

Melasse 12,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 2,0

(NH4)2S04 0,4

KH2P04 0,1

k2hpo4 0,1

MgS04 0,2

Wasser alles übrige der pH-Wert 7,0

Die Fermentation wird in Koben von 750 ml Inhalt (das Volumen des Nährmediums beträgt 25 ml) auf einem Schütteltisch bei 200 U/min und einer Temperatur von 37 ° C verwirklicht. Nach 48 Stunden Fermentation enthält die Kulturflüssigkeit 1600 mg/1 Riboflavin.

Beispiel 2

Das Inokulum wird ähnlich mit dem Beispiel 1 gezüchtet. Als Fermentationsmedium wird ein Medium folgender Zusammensetzung in Gew.-% verwendet:

Saccharose 10,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 2,0

Harnstoff 0,6

KH2P04 0,1

K2HP04 0,1

MgS04 0,2

Wasser alles übrige der pH-Wert 6,5

Die Fermentation wird in einem Fermenter von 0,51 Inhalt unter intensiver Belüftung (1,5 Luftvolumina zu 1 Nährmediumvolumen) und Rühren (die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührwerks beträgt 700 bis 1000 U/min) bei einer Temperatur von 37 °C vewirklicht.

5

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15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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Nach 48 Stunden Fermentation enthält die Kulturflüssigkeit 2100 mg/1 Riboflavin.

Beispiel 3

Eine 24 Stunden alte Kultur von Bacillus subtilis VNII304/pMX45, die auf dem Fleisch-Pepton-Schrägagar gezüchtet wurde, wird mit der Öse auf ein Saatkulturmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% überimpft:

Saccharose 3,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 2,0 Harnstoff 0,6

KH2P04 0,1

K2HP04 0,1

MgS04 0,2

Wasser alles übrige ser pH-Wert 6,5

Das Inokulum wird in Erlenmeyerkolben von 750 ml Inhalt (das Volumen des Nährmediums beträgt 30 ml) auf einem Schütteltisch bei 200 U/min und einer Temperatur von 37 °C innerhalb von 20 Stunden gezüchtet und in einer Menge von 5 Gew.-% in ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% eingetragen:

Saccharose 7,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 2,0 Harnstoff 0,6

KH2P04 0,1

K2HP04 0,1

MgS04 0,2

Wasser alles übrige der pH-Wert 6,5

Die Fermentation wird in einem Fermenter von 0,51 Inhalt unter intensiver Belüftung (1,5 Luftvolumina zu 1 Nährmediumvolumen) und Rühren (die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührwerkes beträgt 1000 U/min) bei einer Temperatur von 40 ° C verwirklicht.

Nach 16 Stunden werden 3 Gew.-% Zucker steril eingetragen.

Nach 40 Stunden Fermentation enthält die Kulturflüssigkeit 3500 mg/1 Riboflavin.

Beispiel 4

5 Eine 24 Stunden alte Kultur von Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45, die auf einem Nährmedium gezüchtet wurde, das Fleisch-Pepton-Agar mit Erythromyzin enthielt, wird wärend 12 Stunden im Impfapparat auf einem Nährmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% inkubiert:

10

Speisezucker 5,0

getrocknete Biomasse der Futterhefe 1,0 Harnstoff 0,6

KH2P04 0,1

15 K2HP04 0,1

MgS04 0,1

Wasser alles übrige der pH-Wert 6,5

Die Fermentation wird in einem Fermenter von 6301 Inhalt 20 (das Arbeitsvolumen des Nährmediums beträgt 3001) unter Rühren (140 U/min) und Belüftung (die Geschwindigkeit der Belüftung beträgt 18 m3/min in den ersten 18 Wachstumsstunden und 24 bis 27 m3/min in den folgenden Wachstumsstunden) bei einer Temperatur von 39 bis 41 °C verwirklicht. 25 Das Inokulum wird in einer Menge von 1 Gew.-% in das Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung in Gew.-% eingetragen:

Speisezucker 5,0

30 getrocknete Biomasse der Futterhefe 2,0 Harnstoff 0,6

MgS04 0,2

KH2P04 0,1

K2HP04 0,1

35 Wasser alles übrige der pH-Wert 6,5

Nach 12 Stunden Fermentation werden noch 5 Gew.-% Zuk-ker zugegeben.

Nach 25 Stunden Fermentation enthält die Kulturflüssig-40 keit 4500 mg/1 Riboflavin.

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Claims

668 081 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Sub-merskultivierung unter Belüftung eines Riboflavin produzierenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus subtilis auf einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralsalze, Wachstumsstimulatoren enthält, und darauffolgende Isolierung des Endproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass als Riboflavin produzierender Mikroorganismus der Stamm Bacillus subtilis des VNIIGenetika304/ pMX45 verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle in das Nährmedium anfänglich in einer Menge von 5 bis 7 Gew.-% bezogen auf das Mediumgewicht, eingetragen wird und nach 12 bis 18 Stunden Kultivierung in einer Menge von 3 bis 5 Gew.-% zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwecks der Erhöhung der Ausbeute an Endprodukt die Kultivierung bei einer Temperatur von 39 bis 41 ° C durchgeführt wird.