RU2196822C1 - Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы - Google Patents
Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2196822C1 RU2196822C1 RU2001120750/13A RU2001120750A RU2196822C1 RU 2196822 C1 RU2196822 C1 RU 2196822C1 RU 2001120750/13 A RU2001120750/13 A RU 2001120750/13A RU 2001120750 A RU2001120750 A RU 2001120750A RU 2196822 C1 RU2196822 C1 RU 2196822C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- nitrile hydratase
- rhodococcus erythropolis
- activity
- producer
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Штамм бактерий, относящийся к виду Rhodococcus erythropolis, обладает высокой нитрилгидратазной активностью. Депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под 84. Данный микроорганизм отличается быстрым ростом на простых органоминеральных средах при высокой активности нитрилгидратазы. Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в биотехнологических процессах получения амидов, в частности акриламида и никотинамида. 3 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью. Нитрилгидратаза - фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.
Известны штаммы бактерий, продуцирующие фермент - нитрилгидратазу и способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Pseudomonas chlororophis B23 (патент US 4,555,487), Rhodococcus rhodochrous J-1 (патент EP 0362829), Brevibacterium R312 (патент US 4,001,081), Rhodococcus rhodochrous M8 (патент SU 1731814), Rhodococcus rhodochrous М33 (патент RU 2053300), Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 (патент US 5,395,758).
Известен также штамм Bacillus cereus В5-продуцент нитрилгидратазы (Патент RU 2160778, выдан 20.12.2000 г).
Целью изобретения является получение ряда новых легко культивируемых штаммов с высокой активностью нитрилгидратазы.
Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нитрилгидратазы, с использованием в качестве селективного агента ацетонитрила.
Штамм Rhodococcus erythropolis E84 обладает следующими признаками: грамположительный, неспорообразующий, некислотоустойчив, аэроб, имеет цикл развития. Клетки палочковидные или кокковидные.
Штамм Rhodococcus erythropolis E84 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 240 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила и 190 ммоль/мг/мин в отношении 3-цианопиридина. Штамм Rhodococcus erythropolis E84 может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот.
Штамм Rhodococcus erythropolis E84 отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы.
Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культуральные свойства:
При росте на агаризованной среде штамм образует круглые колонии с блестящей или матовой поверхностью, от молочно-белого, сероватого до бежевого или розоватого цвета.
При росте на агаризованной среде штамм образует круглые колонии с блестящей или матовой поверхностью, от молочно-белого, сероватого до бежевого или розоватого цвета.
Морфологические признаки:
Клетки грамположительные, подвижные, неспорообразующие, аэробные, имеют цикл развития, палочковидные (размеры 0,6-1,1 х 4,0-10 мкм) или кокковидные.
Клетки грамположительные, подвижные, неспорообразующие, аэробные, имеют цикл развития, палочковидные (размеры 0,6-1,1 х 4,0-10 мкм) или кокковидные.
Физиологические свойства:
Температура роста 4-37oС, оптимальное значение 30oС. Штамм растет при рН 4,5-10, оптимальное значение рН 7,2.
Температура роста 4-37oС, оптимальное значение 30oС. Штамм растет при рН 4,5-10, оптимальное значение рН 7,2.
Биохимические свойства:
Тест с метиловым красным - Положительно
Реакция Фогес-Проскауэра - Отрицательно
Потребление цитрата - Положительно
Восстановление нитрата - Отрицательно
Разложение тирозина - Положительно
Оксидаза - Отрицательно
Каталаза - Положительно
Уреаза - Положительно
Фосфатаза - Отрицательно
Липаза - Отрицательно
Образование индола - Отрицательно
Гидролиз целлюлозы - Отрицательно
Денитрификация - Отрицательно
Штамм использует в качестве источников азота соединения аммония, нитриты и нитраты. Гидролизует крахмал и казеин. Образует кислоту при росте на большинстве углеводов и многоатомных спиртов (см.таблицу А).
Тест с метиловым красным - Положительно
Реакция Фогес-Проскауэра - Отрицательно
Потребление цитрата - Положительно
Восстановление нитрата - Отрицательно
Разложение тирозина - Положительно
Оксидаза - Отрицательно
Каталаза - Положительно
Уреаза - Положительно
Фосфатаза - Отрицательно
Липаза - Отрицательно
Образование индола - Отрицательно
Гидролиз целлюлозы - Отрицательно
Денитрификация - Отрицательно
Штамм использует в качестве источников азота соединения аммония, нитриты и нитраты. Гидролизует крахмал и казеин. Образует кислоту при росте на большинстве углеводов и многоатомных спиртов (см.таблицу А).
Хемотаксономические признаки:
Клеточная стенка содержит липид LCN-A типа Rhodococcus erythropolis. Основная аминокислота клеточной стенки - мезоДАПК (мезодиаминопимелиновая кислота).
Клеточная стенка содержит липид LCN-A типа Rhodococcus erythropolis. Основная аминокислота клеточной стенки - мезоДАПК (мезодиаминопимелиновая кислота).
Чувствительность к антибактериальным препаратам:
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.
Патогенность: штамм не патогенный.
На основании перечисленных характеристик штамм был отнесен к виду Rhodococcus erythropolis.
Изобретение описывает данный микроорганизм для использования в процессе гидратации различных нитрилосоединений и получения соответствующих амидосоединений.
Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть выращена на простых микробиологических средах, включающих различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые обычно используются для получения биомассы бактерий.
Ферментативную активность биомассы бактерий определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту мкМ амида/мг сухого веса/мин.
Пример 1. Заявляемый штамм Rhodococcus erythropolis E84 был выделен из почвы следующим образом:
1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
КН2РO4 - 0,8
К2НРO4•3Н2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 сут при температуре 28oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 24-48 ч при 30oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus erythropolis E84, обладающий нитрилгидратазной активностью.
1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
КН2РO4 - 0,8
К2НРO4•3Н2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 сут при температуре 28oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 24-48 ч при 30oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus erythropolis E84, обладающий нитрилгидратазной активностью.
Пример 2. Использование штамма Rhodococcus erythropolis E84 для трансформации акрилонитрила в акриламид.
Клетки культивировали в среде следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
(NH4)2SO4 - 1
КН2РO4 - 0,8
К2НРO4•3Н2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.
Глюкоза - 1
(NH4)2SO4 - 1
КН2РO4 - 0,8
К2НРO4•3Н2O - 1,5
NaCl - 1
MgSO4•7H2O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.
Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом: 1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,2-0,5 при длине волны 540 нм. К 2 мл клеточной суспензии добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 25oС в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. НСl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.
Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 240 ед. Изменение нитрилгидратазной активности в процессе культивирования показано в таблице 1.
Пример 3. Использование штамма Rhodococcus erythropolis E84 для трансформации 3-цианопиридина в никотинамид.
Штамм Rhodococcus erythropolis E84 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли 3-цианопиридин в количестве 25 мкл. Активность нитрилгидратазы в отношении 3-цианопиридина достигала 190 ед.
Пример 4. Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus erythropolis E84.
Бактерии Rhodococcus erythropolis E84, выращивали в течение 24 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в таблице 2. Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к виду Rhodococcus erythropolis E84. Штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus erythropolis E84 на минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или другие дешевые субстраты (ацетат, сахароза). Все компоненты среды являются коммерчески доступными соединениями, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Важными технологическими качествами для использования штамма являются высокая скорость роста и достаточная температурная стабильность фермента. Максимальная активность фермента наблюдается при 35oС.
Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь.
Штамм Rhodococcus erythropolis E84 и его производные могут быть использованы в биотехнологических процессах получения амидов, в частности акриламида и никотинамида.
Claims (1)
- Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis Е-84 - продуцент нитрилгидратазы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001120750/13A RU2196822C1 (ru) | 2001-07-25 | 2001-07-25 | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001120750/13A RU2196822C1 (ru) | 2001-07-25 | 2001-07-25 | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2196822C1 true RU2196822C1 (ru) | 2003-01-20 |
Family
ID=20252041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001120750/13A RU2196822C1 (ru) | 2001-07-25 | 2001-07-25 | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2196822C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9518279B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-12-13 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
| US20210388336A1 (en) * | 2019-10-31 | 2021-12-16 | Jiangnan University | Mutant of Nitrile Hydratase Derived from Caldalkalibacillus thermarum |
-
2001
- 2001-07-25 RU RU2001120750/13A patent/RU2196822C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9518279B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-12-13 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
| US10138459B2 (en) | 2012-12-27 | 2018-11-27 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
| US20210388336A1 (en) * | 2019-10-31 | 2021-12-16 | Jiangnan University | Mutant of Nitrile Hydratase Derived from Caldalkalibacillus thermarum |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0134094B1 (ko) | 아미드의 생물학적 제조방법 | |
| FI87579C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av amider anvaendande mikroorganismer | |
| RU2053300C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы | |
| US5714357A (en) | Process for producing optically active α-hydroxycarboxylic acid having phenyl group | |
| Kato et al. | Isolation and characterization of a bacterium possessing a novel aldoxime-dehydration activity and nitrile-degrading enzymes | |
| US5179014A (en) | Process for the preparation of amides using microorganisms | |
| US5200331A (en) | Method of producing an amide utilizing a microorganism | |
| RU2196822C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы | |
| Nawaz et al. | Degradation of organic cyanides by Pseudomonas aeruginosa | |
| JP3154646B2 (ja) | グリコール酸の微生物学的製造法 | |
| JPS6255097A (ja) | Ｌ−アミノ酸の製造法 | |
| JPS594987B2 (ja) | ニトリラ−ゼ活性の高い細菌菌体の製造法 | |
| JPH04365491A (ja) | ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法 | |
| Zhang et al. | Screening and characterization of microorganisms capable of converting iminodiacetonitrile to iminodiacetic acid | |
| RU2304165C1 (ru) | Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления | |
| SU1731814A1 (ru) | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы | |
| SK279053B6 (sk) | Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam | |
| RU2160778C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы | |
| JPH0499495A (ja) | Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法 | |
| RU2223316C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | |
| EA006444B1 (ru) | Микроорганизмы amycolatopsis, способные превращать нитрил в амид, фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из указанных микроорганизмов, и способы их использования | |
| JPH03277292A (ja) | 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
| RU2177034C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы | |
| JPH0681597B2 (ja) | アミド化合物の製造法 | |
| Shaini et al. | Optimization of Staphylococcus saprophyticus lipase isolated from windrow compost |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180726 |