AT246332B - Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums Tetracyclin - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums Tetracyclin 
Zur Herstellung von Tetracyclin wurden chemische oder fermentative Wege eingeschlagen. Zur fermentativen Herstellung wurden mehrere Methoden angewendet, darunter die Fermentation von Streptomyces aureofaciens oder von andern Stämmen, welche ursprünglich Chlortetracyclin erzeugen. Die letztgenannten Methoden können in zwei Gruppen geteilt werden : Fermentation auf chloridfreiem Nährboden oder kompetetive Verhinderung der Chlorierung durch Hinzufügen einer grösseren Menge an andern Halogeniden während der Fermentation. 



   Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens wurde ein neuer Stamm von Streptomyces aureofaciens entwickelt, der die Eigenschaft besitzt, über 95% Tetracyclin zu produzieren, während die Gesamtantibiotikumproduktion etwa auf das zweifache steigt. Diese Eigenschaften werden auch hereditär durch mehrere Generationen beibehalten,   u. zw.   auch auf   chloridhaltigem Nährboden. Die Gewinnung des neuen   Stammes geschieht erfindungsgemäss folgendermassen. Die   Bezeichnung"CDSD 314"bedeutet   nachstehend den erfindungsgemäss erzeugten neuen im Centraalbureau voor   Schimmelcultures   in Baarn, Holland unter No.

   CBS 11863 hinterlegten Streptomyces aureofaciens mutans und die   Bezeichnung"LSZ 536"den   Ausgangsstamm, der im Landesinstitut für Gesundheitswesen, Budapest, unter No. 601102 1. hinterlegt worden ist. Ein Chlortetracyclin produzierender Stamm von Streptomyces aureofaciens wird einer UVBestrahlung unterworfen, beispielsweise während etwa 18 min mit einer   25000 erg/mm2-Intensität ;   hierauf folgt eine Röntgenbestrahlung, beispielsweise während 3 h mit einer Intensität von 40 000 r und eine abermalige UV-Bestrahlung in Gegenwart von Benzylrhodanid,   z. B.   in Gegenwart einer 8-15 mg/ml Benzylrhodanid enthaltenden Lösung während 2 h mit einer 5000   erg/mm2-Intensität.   Die so erhaltene Mutante wird abermals mit Röntgenstrahlen, z.

   B. während 25 min mit einer Intensität von   18 000   r, bestrahlt, worauf eine Tiefkühlung, beispielsweise 6 h bei - 8 bis - 150 C folgt. Hierauf wird mit Streptomycin (z. B. mit einer 0,   5% eigen   Lösung) behandelt und danach gezüchtet. Anschliessend folgt auf einem synthetischen Nährboden eine Behandlung mit Coenzym A (z. B. auf einem Nährboden, der 2 g Glukose, 0, 1 g Ammoniumcarbonat, 2 mg Coenzym A und 100 g Wasser enthält), worauf man die Substanz mit 1   mg/ml Coenzym   A in einer 0,05-molaren    NaHCO -Lösung behandelt ;   anschliessend wird in Gegenwart von Kaliumcyanid mit Röntgenstrahlen (z. B. 8 min andauernde Röntgenbestrahlung mit einer Intensität von 6000 r in Gegenwart einer 0,005-molaren Kaliumcyanidlösung) bestrahlt.

   Der so erhaltene Stamm CDSD 314 ist zur Produktion von Tetracyclin auf Cornsteepliquor enthaltendem Nährboden geeignet und sichert die maximale Antibiotikumproduktion binnen einer kurzen Zeit von ungefähr 48 bis 52 h. Der Stamm liefert über   951o   Tetracyclin. 



   Die Eigenschaften des Ausgangsstammes (bezeichnet mit LSZ 536 bzw. No. 601102 1.) und des neuen Stammes (bezeichnet mit CDSD 314 bzw. CBS   118 63)   werden wie folgt verglichen : 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> LSZ <SEP> 536 <SEP> (No. <SEP> 601102 <SEP> 1.) <SEP> CDSD <SEP> 314 <SEP> (CBS <SEP> 118 <SEP> 63) <SEP> 
<tb> Wachs-Sporen-Pigm. <SEP> Luft-Wachs-Sporen-Pigm. <SEP> LuftNährboden <SEP> : <SEP> turn <SEP> : <SEP> entw. <SEP> : <SEP> Entw <SEP> : <SEP> mycel <SEP> : <SEP> turn <SEP> : <SEP> entw. <SEP> : <SEP> Entw. <SEP> mycel <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Saccharose
<tb> Aspargin <SEP> gut <SEP> gut <SEP> rot <SEP> grau <SEP> gut <SEP> gut <SEP> keine <SEP> weiss
<tb> Agar
<tb> Sccharose
<tb> Zepek- <SEP> schwach <SEP> schwach <SEP> keine <SEP> grauweiss <SEP> gut <SEP> gut <SEP> keine <SEP> weiss
<tb> Dox
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> mittelmitter- <SEP> rot- <SEP> grau
<tb> Kartoffel- <SEP> mässig <SEP> braun <SEP> braun <SEP> gut <SEP> gut <SEP> keine <SEP> weiss
<tb> extrakt <SEP> gut
<tb> Glycerin
<tb> mit <SEP> Hefe- <SEP> gut <SEP> mittel <SEP> gelbextrakt <SEP> mässig <SEP> keine <SEP> braun <SEP> schwach <SEP> schwach <SEP> keine <SEP> gelb
<tb> Ma <SEP> sut <SEP> s <SEP> t <SEP> keine <SEP> gelb <SEP> schwach <SEP> schwach <SEP> keine <SEP> gelb- <SEP> 
<tb> Glycerin <SEP> weiss
<tb> Maisbrei- <SEP> Gesamtantibioti- <SEP> 
<tb> Stärke-kum-Produktion <SEP> 980 <SEP> 1850.
<tb> 



  NHNOg-E/ml
<tb> CaCO3 <SEP> Tetracyclin- <SEP> < 3 <SEP> < 95
<tb> 
 Auch das Zuckervergärungsvermögen der beiden Stämme zeigte einen wesentlichen Unterschied : 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> Zuckerart <SEP> : <SEP> LSZ <SEP> 536 <SEP> : <SEP> CDSD <SEP> 314 <SEP> : <SEP> 
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> +
<tb> Fructose <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> - <SEP> +
<tb> Magnose <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannit-+
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> +
<tb> Galsctose <SEP> - <SEP> +
<tb> Xylose <SEP> - <SEP> +
<tb> 
 
Die Sporen und Sporophoren des Ausgangsstammes sind grau, die Sporophoren entwickeln sich in offenen einfachen Spiralen. Der neue Stamm (CDSD 314) weist hakenartig gekrümmte Sporophoren und weisse Sporen und Sporophoren auf. Der neue Stamm wird auf Grund des Systems von Pridham und Mitarb. 



    (Appl. Microbiol..   6, S.52, [1958]) als der Gruppe Retinaculum apertum, erste Serie, zugehörig erachtet ("white series"), während der Ausgangsstamm ein Glied der sechsten Serie ("gray series") ist. 



   Das mit Hilfe des neuen Stammes erhaltene Fermentationsprodukt kann ohne weitere Reinigung für Futterzwecke verwendet werden. In diesem Fall wird aus dem fermentierten Material und einem Futter- 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 mittel zweckmässig vorerst ein Vorgemisch hergestellt. Das Fermentationsprodukt kann aber auch nach beliebigen, bekannten Tetracyclin-Verarbeitungsmethoden verarbeitet und gereinigt werden. Besonders vorteilhaft ist die folgende Verfahrensweise : Die Fermentflüssigkeit wird sauer vom Mycel abfiltriert, worauf nach entsprechendem Alkalisieren (PH   8 - 9)   mit einer quaternären Ammoniumbase oder einem Salz behandelt wird ; das ausgeschiedene quaternäre Tetracyclinsalz wird filtriert und nach Auswaschen in einem wässerigen Medium mit Säure zersetzt.

   Aus dem Filtrat wird das Tetracyclin nach Beseitigung der überschüssigen Eisen- und Calciumionen mit einem organischen Lösungsmittel, zweckmässig mit einem Alkohol, extrahiert. Aus dem Alkoholextrakt wird das Tetracyclin durch wiederholte Extraktion mit einem sauren Medium wieder in die wässerige Phase überführt. Der Wirkungsgrad der Extraktior steigt in Gegenwart von Ferrisalzen auf über   95go.   Beim Einengen des wässerigen Extraktes fällt das Tetracyclinhydrat kristallin aus. Es ist vorteilhaft, wenn die Lösung vor dem Einengen bzw. Kristallisieren mit einem Borhydrid, zweckmässig Natriumborhydrid, behandelt wird. 



   Das erhaltene Tetracyclinhydrat ist für pharmazeutische Zwecke anwendbar und entspricht den Vorschriften der Arzneibücher. 



   Aus der Lösung des Tetracyclins oder aus dem Tetracyclinhydrat kann in gewünschtem Falle ein beliebiges Tetracyclinsalz hergestellt werden. Aus den Mutterlaugen können noch weitere Mengen gewonnen werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums Tetracyclin durch Fermentation einer Streptomyces EMI3.1 den aus einem unter der No. 601102 1. im Landesinstitut für Gesundheitswesen, Budapest, hinterlegten Chlortetracyclin produzierenden Stamm von Streptomyces aureofaciens durch UV-Bestrahlung, hierauf Röntgenbestrahlung, hierauf weitere UV-Bestrahlung in Gegenwart von Benzylrhodanid, hierauf Röntgenbestrahlung mit darauffolgender Tiefkühlung und Behandlung mit Streptomycin, sodann Züchtung auf einem synthetischen Nährboden und Behandlung der Kultur mit Coenzym A und schliesslich Röntgenbestrahlung in Gegenwart von Kaliumcyanid erhaltenen, unter Nr.

   CBS 11863 im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland, hinterlegten Mutantenstamm in für die Tetracyclinproduktion üblicher Weise auf Cornsteepliquor enthaltenden Nährboden kultiviert, bis erhebliche Mengen von Antibiotikum gebildet sind und gegebenenfalls Tetracyclin in bekannter Weise aus dem Fermentationsprodukt isoliert.