DE961566C - Verfahren zur Gewinnung und Reindarstellung von Coliformin aus mit Coliformin bildenden Bakterien fermentierten Naehrloesungen - Google Patents

Description

Stig O. Pehrson berichtet über die antibiotische Wirkung eines Coliforminorganisrnus beim Wachstum von Fungi, die aus Holz und Holzbrei isoliert wurden (Physiologia Plantarum, Bd. 2, 1949, S. Ϊ49). Verschiedene Stämme dieser Bakterien wurden in Holzbreimühlen in Finnland, Norwegen und Schweden isoliert, die sich ähnlich verhalten und offenbar zu einer einzigen Gattung gehören. Sie sind gramnegativ, nicht sporenbildend und kommen einzeln oder in Paaren und bisweilen in Ketten vor. Sie wachsen rasch auf Würzeagar, bilden kleine kreisförmige Kolonien mit glatter Oberfläche auf Blut-, Conradi-Drigalski-, Glukose- und Fleisch-Peptonagar, sind aerob und haben eine optimale Wachstumstemperatur von 23⁰C. Gelatine wird nicht verflüssigt, und' es wird auch kein Schwefelwasserstoff erzeugt. Die isolierten Stämme sind negativ gegen Indol und Methylrot und sind fähig, Natriumeitrat als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten. Die Kulturen der Coliformbakterien können submers gezüchtet werden. Die Kulturnitrate können ohne Verlust an fungi statischer Wirksamkeit gekocht werden, doch sind Versuche, das aktive Prinzip aus den Kulturen zu isolieren, bisher ohne Erfolg geblieben.

Gemäß der Erfindung gelingt es nun, die Gewinnung und Reindarstellung von Coliformin aus mit coliforminbildenden Bakterien fermentierten

Nährlösungen dadurch, daß diese Nährlösungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert oder zunächst an Adsorbentien adsorbiert und dann mit geeigneten Lösungsmitteln eluiert und das Coliformin in Trockenform, gegebenenfalls in Form eines Salzes, übergeführt werden. Bei einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform wird das Adsorbens in gelöster Form in die Kulturlösung eingebracht und ίο das Coliformin in stato nascendi adsorbiert, worauf aus dem beladenen Adsorbens das Adsorbat herausgelöst wird.

Reines Coliformin, wie es gemäß der Erfindung gewonnen wird, enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor sowie Chlor in nachgenannter prozentualer Zusammensetzung, falls die Substanz als Hydrochlorid isoliert wird. Die Analysen sind an einem reinen Hydrochlorid durchgeführt: C = 47,6%, H = 7,02 «/0, N = 8,22 %>, O (Rest) =33.15 °/o, Cl = 3,31%, S = 0,23«/», P = 0,47·%, Aschengehalt = 0%. Im Ultraviolett gibt Coliformin als Hydrochlorid ein breites Absorptionsmaximum bei 272 ταμ. Im Infrarot gibt eine Suspension von Coliformin in Paraffinum liquidum folgende fünfzehn Absorptionsmaxima, angegeben in Cm^-1: 3970, 3160, 2730, 2170, 2040, 1660, 1530, 1410, 1230, 1070, 833, 789, 757, 683, 665.

Bei der Analyse von Coliforminhydrolysat wurden etwa 70% Aminosäuren, 15% Glukose und 5% Xylose gefunden. Das niedrigste Molekulargewicht, welches oben angeführten Elementaranalysedaten entspricht, ist 1062. Bei der Molekulargewichtsbestimmung mittels isothermischer Destillation wurden bei einem Hydrochlorid folgende Werte erhalten: 3600, 3880, 4120 und 4410.

Die Reindarstellung von Coliformin kann man durch Aktivitätsmessungen mit Pullularia pullulans oder Candida albicans als Testorganismus verfolgen. Die nachfolgend genannten Aktivitäten werden in Prozenten der Aktivität angegeben, die mit der am weitgehendsten gereinigten Substanz erhalten wurde; diese Substanz ist ein Hydrochlorid, dessen analytische Daten im vorigen Abschnitt genannt sind und die nach dem Beispiel 7 (s. dieses) hergestellt wurde. Die Aktivität der Kulturlösung im Verhältnis zu reinem Coliformin ist etwa 0,01 °/o.

Coliformin ist unter anderem fungizid gegen humanpathogene Schwämme, pflanz enpathogene Schwämme und schädliche Schwämme auf Holz und Holzmasse.

Coliformin kann aus einer Kulturlösung isoliert werden, die einen Stamm gramnegativer, nicht sporenbildender, unbeweglicher Coliformin bildender Bakterien als Stäbchen einsam oder paarweise, mitunter in Ketten mit einer Größe von 0,5 bis 0,6 · i,2 bis i,8 μ in einem geeigneten Näh-rmedium enthält, die als Kohlenstoff quelle Sacharose, Glukose., Maltose, Xylose oder andere wasserlösliche oder teilweise wasserlösliche Kohlenhydrate und als Stickstoffquelle z. B. Aminosäuren, Asparagin, Pepton sowie andere stickstoffhaltige Substanzen aus dem Pflanzen- oder Tierreich oder Ammoniumverbindungen, wie z. B. Ammoniumtartrat, enthält.

Eine geeignete Nährlösung kann z. B. folgende Zusammensetzung haben:

Glukose 10,0 g/l

N H₄-Ammoniumtartrat 5,0 g/l

KHgPO₄ 1,0 g/l

MgSO₄, 2H₂O _> 0,5 g/l

CaCl₂ (0,1 Mol/l) 5,0 ml

FeCl₃ (2 g FeZl)- 0,5 ml

ZnSO₄ (2g Zn/1) 0,5 ml

MgCl₂ (0,1 Mol/l) 0,5 ml

H₂O 995>°ml

Die BakterienkultureB werden bei Luftzufuhr entweder submers, in Oberflächenkultur oder in Schüttelkultur gezüchtet bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 30⁰ C und bei einem pjj-Wert von ungefähr 5,5. Eine geeignete Gärzeit bei stationärer Kultur dürfte ungefähr eine Woche sein. Hernach wird die Kulturlösung einige Minuten gekocht, die Bakterien werden entfernt, und die Kulturlösung wird nach folgenden Beispielen aufgearbeitet.

Beispiel 1 _go

500 ml einer gemäß oben angegebenen nach allgemeinen Methoden hergestellten Kulturlösung werden bei p_H 7 mit 3 · 100 ml n-Butanol extrahiert. Das Lösungsmittel wird hernach im Vakuum bei Zimmer- oder etwas höherer Temperatur abgetrieben. Der Rückstand, der aus einem braunen öl besteht, hat 500 mal so hohe Aktivität als die ursprüngliche Kulturlösung, entsprechend 5% der Aktivität der reinsten Substanz per Gramm gerechnet.

Beispiel 2

71 der Nährlösung werden mit 10 g aktiver Kohle ι Stunde hindurch behandelt. Hernach wird die Kohle abfiltriert und mit 250 ml 8o°/oigem Äthanol ausgelaugt. Die Substanz in der Äthanollösung hat eine Aktivität, die 25mal höher ist als die der ursprünglichen Kulturlösung.

Beispiel 3

3,5 1 Kultuflösung werden 1 Stunde lang mit 50 g Aluminiumoxyd nach Brockmann geschüttelt, worauf das Aluminiumoxyd abfiltriert und mit gleichen Teilen 0,2 molarer Natronlauge und 95% Äthanol eluiert wird. Zur Eluierung werden 4 · 250 ml der genannten Mischung verwendet. Das Eluat wird unmittelbar mit Salzsäure neutralisiert.

Die daraus erhaltene Substanz hat ungefähr 2omal so hohe Aktivität wie die der ursprünglichen Kulturlösung.

Beispiel 4

Die aktive Substanz in 500 ml Kulturlösung wird in Kieselgur absorbiert. Die Kieselgur wird mit 150 ml Salzsäure bei p_H2 eluiert. Die Lösung wird neutralisiert.

Die Aktivitätserhöherung der aus der Lösung isolierten Substanz ist ungefähr 2omal der Kulturlösung.

Beispiel 5
5

Zu ι 1 Kulturlösung wird unter kräftigem Umrühren 25 g Benzoesäure, gelöst in 100 ml Aceton, zugesetzt. Dauer des- Umrührens 2 Stunden. Die Benzoesäure wird hernach abfiltriert, gewaschen und bei 40⁰ C während 48 Stunden getrocknet. Die trockene Benzoesäure, welche die aktive Substanz aufgenommen hat, wird mit 400 ml trockenem Äther ausgeschüttelt, wobei der Hauptteil der Benzoesäure in Lösung geht. Der Rest wird isoliert und 24 Stunden am Soxhletapparat mit Äther extrahiert, der während der Extraktion 3mal erneuert wird. Der schwach graugefärbte Rückstand ist praktisch frei von Benzoesäure. Diese Substanz ist ungefähr 6oomal so aktiv wie die Kulturlösung.

Sie hat eine Aktivität im Verhältnis zu der reinsten Substanz von zirka 6%.

Beispiel 6

iog der im Beispiel 5 erhaltenen Substanz werden mit 300 ml Methanol während 18 Stunden im Soxhletapparat extrahiert und hernach der Extrakt auf +S⁰C abgekühlt. Die hierbei ausfallende Substanz wird abgetrennt, mit kaltem Äther gewaschen und im Exsikkator über Calciumchlorid getrocknet. Diese Substanz ist öooomal mehr aktiv als die ursprüngliche Nährlösung und 63% der meist aktiven Substanz. Analyse: C = 49,81 "Yo, H = 7,80%, N = 8,99 %, S = 0,62 %, P = 1,66 °/o, Aschengehalt = 7,3%.

τ-, . . .

Beispiel 7

310 mg einer Substanz, mit einer Aktivität entsprechend der Substanz, die gemäß Beispiel 6 isoliert wurde, werden in 50 ml siedenem Methanol gelöst; hierauf werden 5 ml absolutes Äthanol, 3% Chlorwasserstoffgas enthaltend, zugesetzt und das Sieden etwa 2 Minuten fortgesetzt. Die Lösung wird warm filtriert und hernach auf Zimmertemperatur abgekühlt; dann setzt man 150 ml Äther zu. Die ausgefällte Substanz wird 2 mal mit Äther gewaschen und im Vakuumexsikkator über Calciumchlorid getrocknet.

Die auf diese Weise erhaltene Substanz hat eine Aktivität, die ungefähr 9Öoomal höher ist als die

.50 der ursprünglichen Kulturlösung. Die Substanz ist das Hydrochlorid des Coliformins und hat folgende Zusammensetzung: C = 47,6 % H = 7,02 %, N = 8,22%, O (Rest) = 33,85%, Cl = 3,31%, S = 0,23%, P = 0,47%, Aschengehalt = 0%.

.55 Diese Substanz ist das reinste Produkt, mit dem die Aktivität der übrigen Substanzen verglichen wurde.

Beispiel 8

'60 Man läßt die Methanolmutterlauge von Beispiel 6 von Aluminiumoxyd absorbieren. 300 ml der Methanolmutterlauge passieren eine Kolonne Aluminiumoxyd, welches vorher mit verdünnter Salzsäure vom p_H-Wert6 behandelt wurde. Hierauf wäscht man die Kolonne mit 100 ml Methanol und 100 ml Wasser, wobei der größte Teil der gefärbten Verunreinigungen entfernt werden. Die Eluierung selbst wird mit 3 1 0,36 molarer Salzsäure, verteilt auf vier Fraktionen, durchgeführt, und die Lösung zu p_H 6,5 neutralisiert, wobei Aluminiumhydroxyd ausfällt. Dieses wird abgetrennt und die Flüssigkeit im Vakuum bei 50 bis 6o° C zu 290 ml eingeengt. Diese Lösung wird 3mal mit je 150 ml n-Butanol ausgeschüttelt. Die Butanolphase wird dann mit 3 · 50 ml Wasser ausgeschüttelt, um gelöstes Natriumchlorid zu entfernen. Die Butanolphase wird abgetrennt und das Butanol im Vakuum bei 50⁰ C abgetrieben.

Der Rückstand wird in Form eines dickflüssigen Öls erhalten. Dieses öl wird mit 50 ml absolutem Alkohol und 75 ml Äther geschüttelt, wobei eine Substanz ausfällt, die abgetrennt und getrocknet wird. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist 84oomal mehr aktiv als das der ursprünglichen Nährlösung oder 87·% der höchstaktiven, im Beispiel 7 beschriebenen Substanz.

Beispiel 9

3 g der im Beispiel 5 isolierten Substanz wird durch Kochen mit 2 · 50 ml Pyridin während je ι Minute extrahiert. Hierauf kühlt nian auf Zimmertemperatur ab und zentrifugiert. Das Extrakt wird in Vakuum eingedickt, wobei ein braunes öl erhalten wird. Dieses öl hat eine Aktivität, die i8oomal derjenigen der Kulturlösung entspricht bzw. 19% der höchsten aktiven Substanz.

Beispiel 10

Die aktive Substanz in 1000 ml unfiltrierter Kulturlösung wird in 5 g Kieselgur absorbiert, von der Kieselgur abzentrifugiert und bei 40⁰ C getrocknet. Die Kieselgur wird hierauf mit 25 g Phenol ausgelaugt. Nach Zentrifugierung wird die Phenollösung mit 20 ml Aceton behandelt, wobei eine Ausfällung eintritt.

Die auf diese Weise erhaltene Substanz hat eine Aktivität, die ungefähr 1200 mal größer ist als die der ursprünglichen .Kulturlösung.

τ? · · 1

Beispiel 11

ι g der nach Beispiel 10 erhaltenen Substanz wird 3mal in je 100 ml destilliertem Wasser, jedesmal 30 Minuten, gekocht. Die Wasserlösung wird einer Gefriertrocknung unterworfen und dabei eine Substanz erhalten mit einer Aktivität, die etwa 66oomal größer ist als die der ursprünglichen Kulturlösung.

Analyse: C = 47,88%, H = 5,99%, N = 12,2%, O (Rest) = 33.93%·

Diese Substanz enthält keine Xylose, aber 6% Glykose. Die veränderte Zusammensetzung bringt eine gewisse Veränderung im Absorptionsmaximum im Infrarot sowie auch eine Veränderung der Aktivität gegen Fungi mit sich. Folgende Absorptionsmaxima werden für eine Suspension in

Paraffinöl erhalten. Die Absorptionsmaxima werden in cm—¹ angegeben: 3300, 2900, 1660, 1550, 1410, 1240, 1060.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Gewinnung und Reindar-. stellung von Coliformin aus mit Coliformin bildenden Bakterien fermentierten Nährlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nährlösungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert oder zunächst an Adsorbentien adsorbiert und dann mit geeigneten Lösungsmitteln eluiert und das Coliformin in Trockenform, gegebenenfalls in Form eines Salzes, übergeführt werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in gelöster Form in die Kulturlösung eingebracht und das Coliformin in stato nascendi adsorbiert wird, ao worauf aus dem beladenen Adsorbens das Adsorbat herausgelöst wird.

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