PL79702B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Republi¬ ka Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania penicylinazy zwiazanej na nosniku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia penicylinazy zwiazanej na nosniku, stosowanej do hydrolitycznego rozszczepienia penicylin w ce¬ lu uzyskania kwasu 6-aminopenicylanowego <6 APS).Wiadomo juz, ze pewne gatunki mikroorganiz¬ mów tworza enzym penicylinaze (P.A.), 5.5.1.11), który dzialajac na penicyliny, np. peni¬ cyline G, prowadzi do hydrolitycznego odszczepie- nia bocznej grupy karbonamidowej bez jednoczes¬ nego otwarcia pierscienia 0-laktamowego.Na dzialaniu tego enzymu oparty jest sposób wytwarzania 6 APS z penicyliny G zawarty w niemieckim opisie patentowym nr 1111778.We wspólczesnej wielkotechnicznej produkcji stosuje sie szlam bakteryjny, korzystnie E. coli.Sposób ten ma szereg nastepujacych wad: Szlam bakteryjny zawiera oprócz wewnatrzkomórkowej PA inne proteiny i enzymy oraz skladniki pozyw¬ ki i jej produkty przemian powstale w czasie fer¬ mentacji. W przeróbce koncowej zanieczyszczen tych nie mozna calkowicie wymyc z krystaliczne¬ go 6-APS. Szlam bakteryjny mozna uzyc tylko jednowzorowo w procesie technicznym. Szlam bak¬ teryjny zawiera zanieczyszczenia i inne enzymy, które inaktywuja penicyline G iAub 6 APS otwie¬ rajac pierscien p-laktamowy.Szlam bakteryjny zawiera male ilosci P.A. Sto¬ sowanie wiekszej ilosci enzymu, np. w celu skró¬ cenia czasu reakcji i uzyskanie wiekszej wydaj¬ nosci 6-APS przy nieznacznej zawartosci produk¬ tów rozkladu jest praktycznie niemozliwe. Wy¬ dajnosc 6-APS zalezy od zmiennego tworzenia sie P.A. w kazdym wsadzie fermentacyjnym. 8 Calkowite oddzielenie komórek bakteryjnych wymaga wprowadzenia dodatkowej operacji w procesie obróbki koncowej wsadów 6-APS. Usu-' niecie proteinowatych zanieczyszczen, które moga wywolac reakcje alergiczne wymaga dodatkowych 10 operacji oczyszczajacych (opisy patentowe Wiel¬ kiej Brytanii nr nr 1169 696, 1076847, 1114 311, opis patentowy RFN nr 1909 915).Nierozpuszczalne, biologicznie czynne proteiny zwiazane na nosniku sa po raz pierwszy opisane 15 w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 3167486.Znane sa takze próby wiazania kowalencyjnego penicylinazy na nosniku z polimerów i stosowa¬ nia do wytwarzania 6-APS (opis patentowy RFN DOS nr nr 1917 057, 1907 365, 1933 301). 20 Znane sposoby wytwarzania nierozpuszczalnej penicylinazy sa jednak niezadowalajace poniewaz enzym w warunkach wiazania traci znaczna czesc aktywnosci biologicznej lub wiaze sie w ogóle mniej niz 50*/t proteiny. Wydajnosci wynoszace 25 50—60°/o zwiazanej penicylinazy na nosniku mozna wprawdzie uzyskac stosujac wedlug opisu patento¬ wego DOS nr 1 917 057 nosnik stanowiacy liniowy polimer etylenu i bezwodnika kwasu maleinowego (zywica EMA). Stosowany polimer jest jednak nie- 30 jednolity, po hydrolizie grup bezwodnika kwaso- 7970279702 3 wego rozpuszcza sie w wodzie przy obojetnej lub alkalicznej wartosci pH. Dopiero po zwiazaniu sie enzymu z innymi dwu- lub poMaminami, zwiaza¬ nymi w wielu miejscach jako komonomery, ulega sieciowaniu i staje sie .nierozpuszczalny w wodzie. 5 Frakcje maloczasteczkowe i czesciowo rozpusz¬ czalne -w wodzie nie daja sie oddzielac, dlatego zwiazana proteine traci sie jako produkt rozpusz¬ czalny. Ponadto zywica EMA ze wzgledu na wyz¬ sza koncentracje proteiny ulega silnemu siecio- io waniu i jest tylko czesciowo dostepna dla penicy¬ liny.W opisie^ patentcJwyip, RFN DOS nr 1906 290 i nr 1935 711 sa opisane silnie peczniejace kopoli¬ mery akryloamddu, kwasu maleinowego i N,N'- 15 metylenobisafcryloamidu.; Wymienione sla'bo~ siecio- wane polimery umozliwiaja zachowawcze wiazanie proteiny i tym samym zachowuje sie ,po zwiaza¬ niu struktura proteinowa i enzymatyczna aktyw¬ nosc, ¦-*-- 20 Grupy aminowe enzyniów reaguja z grupami ( bezwodnikowymd polimeru. Poniewaz jednak w wyniku solwolizy jak tez jednoczesnie z tworze- nim sie karboriarnidu powstaja wolne grupy kar¬ boksylowe, proteina wiaze sie nie tylko kowalen- 25 cyjnie lecz równiez heteropolarnie.Wedlug opisu patentowego RFN DOS nr 1935 711 stwarza sie warunki w których wiaze sie naj¬ wyzej 50% trypsyny i kowalencyjnie i 50% hete¬ ropolarnie. Heteropolarnie zwiazana czesc enzymu 30 wymywa sie w pózniejszych reakcjach przy zmieniajacych sie stezeniach soli i wartosciach pH, a tym samym zmniejsza sie wydajnosc wiaza¬ nia enzymu i jednoczesnie zanieczyszcza sie pro¬ dukt. 35 Sposób wedlug wynalazku usuwa wymienione wady poniewaz stosowane^ kopolimery moga wia- zas do 98% penicylinazy kowalencyjnie.Penicylinaza zwiazana kowalencyjnie sposobem wedlug wynalazku na nosniku moze byc stosowa- 40 na w wielkotechnicznym procesie do enzymatycz¬ nego rozszczepienia penicyliny. Po kazdej operacji mozna ja odzyskac przez filtracje lub wirowanie i stosowac ponownie.Kopolimery stosowane w sposobie wedlug wy- 45 nalazku mozna wytworzyc w znany sposób. Po ko- polimeryzacji galaretowata zywice tloczy sie przez sito o oczku 0,5 mm, dobrze sie przemywa i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Sposobem wedlug wynalazku wchodzacy w sklad" 50 kopolimeru kwas dwukarboksylowy przeprowadza sie w bezwodnik kwasu dwukarboksylowego przez 2-godzinne ogrzewanie do temperatury 180°C. Nie nalezy ogrzewac dluzej niz 2 godziny do tempera¬ tury 180° C, poniewaz maleje wyraznie pojemnosc 55 wiazania kopolimeru. Pojemnosc wiazania protein przez kopolimery jest zalezna od obecnych grup bezwodnikowych i wielkosci porów. Zdolnosc wia¬ zania gesciej sieciowanego produktu jest mniejsza niz polimeru sdeciowanego mniej gesto. 60 Ze zmniejszeniem sieciowania wzrasta jednak zdolnosc pecznienia polimeru i zmniejsza sie jed¬ noczesnie odpornosc na scieranie.Dla kowalencyjnego wiazania penicyLiinazy wy¬ twarza sie korzystnie polimer z 45 czesci akrylo- 65 amidu, 3 czesci N,N'-metYlenobisakryloamidu i 15 czesci kwasu maleinowego.Grupy aminowe penicylinazy reaguja z grupa¬ mi bezwodnikowymd polimeru przy wartosciach pH 5—6,5, korzystnie 5,8. Poniewaz w wyniku, sol¬ wolizy cyklicznych grup bezwodnikowych powsta¬ je slabo kwasny wymiennik jonowy wartosc pH mieszaniny reakcyjnej powoli maleje jesli biezaco nie dodaje sie rozcienczonego roztworu alkaliów do mieszaniny reakcyjnej. Korzystne jest stosowanie^ buforów. Wydajnosc procesu wiazania penicylina¬ zy jest uzalezniona w duzej mierze od okreslonych warunków procesu. Wydajnosc jest scisle uzalez¬ niona od wartosci pH. Przy wartosci pH 5,8 wiaze sie 98%, przy wartosci pH 6,5 45%, a przy war¬ tosci pH 4,5 tylko 22%.Znaczenie ma równiez temperatura, winna ona byc mozliwie niska i powinna wynosic ponizej 20°C.W wyzszej temperaturze hydroliza cyklicznych grup bezwodnikowych przebiega szybciej niz amo- noliza. Korzystnie proces prowadzi sie^ w tempera¬ turze 4°C. Wiazanie zalezy równiez od stezenia jonów i dlatego proces korzystnie prowadzi sie w roztworze buforowym o nieznacznym stezeniu jo¬ nów. Przy duzym stezeniu buforu polimer kurczy sie i enzym wolniej wnika i reaguje z matryca po¬ limeru. Korzystnie stosuje sie 0,01—0,05 molowy bufor fosforanowy. Po reakcji wiazania penicyli- naze zwiazana na nosniku odsacza sie i intensyw¬ nie przemywa sie woda i 1 molowym roztworem soli kuchennej.Na Ig enzymu stosuje sie co najmniej 10 g kopolimeru. Do roztworu enzymu w 250 ml 0,05 molowego buforu fosforanowego o wartosci pH .5,5 wprowadza sie okolo 3—4 g' kopolimeru, miesza sie intensywnie i po 2 godzinach wprowadza sie malymi porcjami reszte kopolimeru.W ciagu calego czasu reakcji utrzymuje sie sta¬ la wartosc pH przez wprowadzanie rozcienczonego lugu sodowego. W przypadku gdy po 5 godzinach ciecz nad osadem zawiera jeszcze niezwiazany en¬ zym wprowadza sie dodatkowo kopolimer. Stosu¬ nek wynoszacy 1 czesc enzymu na 15—20 czesci kopolimeru jest na ogól wystarczajacy do calko¬ witego przereagowania.Penicylinaze zwiazana na nosniku otrzymana sposobem wedlug wynalazku mozna magazynowac bez utraty skutecznosci enzymatycznej.Dla oznaczenia enzymatycznej aktywnosci pemd- cylinazy zwiazanej na nosniku inkubuje sie w roz¬ tworze 30 000 Ju/ml soli potasowej penicyliny G w temperaturze 37°C. Uwolniony kwas fenyloocto¬ wy .miareczkuje sie 0,1 n lugiem sodowym przy stalej wartosci pH 7,8. Jednostka enzymu (E) jest aktywnosc, która powoduje w podanych warun¬ kach rozszczepienie w ciagu 1 minuty, 1 \i mola penicyliny na 6-APS i kwas fenylooctowy i wy¬ maga uzycia 1 \i mola lugu sodowego.Nizej podane przyklady objasniaja sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie kopolimeru, a) Rozpuszcza sie 450 g akryloamidu, 22,5 g N,N'-metylenobasakryloamidu i 150 g kwasu male-79702 6 inowego w 3500 ml 0,05 — buforu m-fosforanowe¬ go o wartosci pH 7,6 i pod azotem jako gazem ochronnym, traktuje sie 150 ml 5°/o wodnego roz¬ tworu nitrylu kwasu propionowego i 150 ml 5% nadsiarczanem amonu. Mieszanine reakcyjna 5 ogrzewa sie do temperatury 80°C, nastepnie utrzy¬ muje sie w temperaturze pokojowej przez 15 go^ dzin i przetlacza sie przez sito o wielkosci oczka 0,5 mm. Po dokladnym przemyciu woda polimer suszy sie przez zamrozenia i ogrzewa sie pod cis- io nieniem 20 torów przez 2 godziny do temperatury 180°C.Wedlug podanego przykladu mozna otrzymac in¬ ne kopolimery stosujac np.: b) 450 g akryloamidu, 30 g N,N'-metyleno,bisa- 15 kryloamidu i 150 g kw^asu maleinowego; c) 450 g akryloamidu, 45 g N,N'-metylenobis- akryloamidu i 150 g kwasu meleinowego d) 450 g akryloamidu, 45 g N,N'-metylenobisa- kryloamidu, 75 g kwasu maleinowego 20 e) 450 g akryloamidu, 135 g N,N'-,metylenobis- akryloamidu i 150 g kwasu maleinowego Polimery przerabia sie dalej wedlug przykladu la.Przyklad II.. Sposób,wytwarzania penicylina- 25 zy zwiazanej na nosniku: a) Rozpuszcza, sie w 200 ml 0,01 molowego bufo¬ ru o pH 5,8 1,0 g penicylinazy o wlasciwej aktyw¬ nosci enzymatycznej wynoszacej 15 E/mg 1 w tem¬ peraturze 4°C dodaje sie, mieszajac malymi por- 30 cjami kopolimer w ogólnej ilosci 15 g wytworzo¬ ny wedlug przykladu I pod a).Stala wartosc pH 5,8 utrzymuje sie za pomoca rozcienczonego lugu sodowego. Po 24 godzinach saczy sie w temperaturze 4°C i przemywa sie 35 300 iml wody. Wilgotny enzym zwiazany na nosni¬ ku (specznialy do 300 g) ma aktywnosc wlasciwa 0,049 E/mg.Wydajnosc penicylinazy zwiazanej kowalencyjnie wynosi 98°/o. b) Poddaje sie reakcji 15 g kopolimeru wytwa¬ rzanego wedlug przykladu Ib i Ig penicylinazy (15 E/mg). Wydajnosc: 290 g wilgotnego zwiaza¬ nego z nosnikiem enzymu o aktywnosci 0,044 E/mg.Wydajnosc kowalencyjnie zwiazanej penicylinazy wynosi 85%. c) Poddaje sie reakcji wedlug przykladu Ila 15 g kopolimeru wytworzonego wedlug przykladu Ic z Ig penicylinazy (15 E/mg). Wydajnosc 296 g wilgotnego zwiazanego na. nosniku enzymu o aktywnosci 0,039 E/mg. Wydajnosc kowalencyjnie zwiazanej penicylinazy wynosi 77°/o. d) Poddaje sie reakcji wedlug przykladu Ila 15 g kopolimeru wytworzonego wedlug przykladu Id z 1 ,g penicylinazy <15 E/mg). Wydajnosc: 280 g wilgotnego zwiazanego na nosniku enzymu o ak¬ tywnosci 0,041 E/mg. Wydajnosc kowalencyjnie zwiazanej penicylinazy wynosi 76,5°/o. e) Poddaje sie reakcji wedlug przykladu Ha 15 g kopolimeru wytworzonego wedlug przykla¬ du Je z 1 g penicylinazy (15 E/mg). Wydajnosc: 65 g wilgotnego, zwiazanego na nosniku enzymu o aktywnosci 0,146 E/mg. Wydajnosc kowalencyj¬ nie zwiazanej penicylinazy wynosi 63°/o. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania penicylinazy zwiazanej kowalencyjnie na nosniku, znamienny tym, ze ja¬ ko nosnik stosuje sie kopolimer akryloamidu, N,N'-metylenobisakryloa'inidu i kwasu meleinowe¬ go, przy czym kwas maleinowy przeprowadza sie przez ogrzewanie kopolimeru, pod zmniejszanym cisnieniem w bezwodnik, a kopolimer nastepnie poddaje sie reakcji przez kilka godzin z wodnym roztworem penicylinazy, przy wartosci pH 5—6,5, w temperaturze ponizej 20°C. PL PL