SU446971A1 - Способ получени ковалентно св занной с носителем пенициллинацилазы - Google Patents

Description

Изобретение относилс  к способу получени  нерастворимой в воде пенициллинацилаэы, ковалентно св занной с носителем в виде слабо сшитого смешанного полимеризата акриламида, малеиновой кислоты , и 1(,Н-метиленбисакриламида. Изобретение мохет найти применение дл  ферментативного получени  6-аминопенициллановой кислоты из пенициллинов.

Известно применение дл  получени  6-аминопенициллановой кислоты пенициллиназы, фиксированной на носителе в виде линейного полимера ,ангидрида этиленмалеиновой кислоты ТЕМА - смола). Этот полимер  вл етс , однако, очень неоднородным и после гидролиза группы ангидрида карбоновой кислоты при нейтральном или щелочном значении рН растворим в воде. Этот полииер только в результате св зи с ферментом и другими, св занными как сомономеры в нескольких местах ди-или полиаминами образует поперечные св зи и вследствие этого становитс  растворимым в воде. Низкомолекул рные и частично растворимые в воде фракции не могут быть разделены. Поэтому св занный протеин тер етс  как растворимый материал. Кроме того ЕМА - смола вследствие более высоких концентраций протеина образует так сильно поперечные св зи, что она оказываетс  лишь частично доступной дл  субстрата.

Предлохен способ получени  нового нерастворимого в воде фермента , фиксированного на носителе посредством образовани  с ним ковалентных св зей: пенициллинацилааы , ковалентно св занной с полимеризатом акриламида, малеиновой кислоты и Ч,м-метиленбисак иламида ,

Способ заключаетс  в том, что смешанный полимеризат из акриламиа , малеиновой кислоты и N,N-мети ленбисакриламида нагревают в вакууме и полученный ангидрид течение нескольких часов при емпературе нихе 20 С и при знаении рН 0,0-6,5 ввод т в реакцию водным раствором пенициллинаилазы .

При этом аминогруппы фермента реагируют с ангидридными группами полимеризата, причем до 98% пенициллинацилазы св зываетс  ковалентно с носителем и активность фермента, вводамого во взаимодействие с полимером - носителем , полностью сохран етс .

Получение смешанного полимеризата осуществл ют известными методами . После смешанной полимеризации желеобразную смолу продавливают через сито с отверсти ми 0,5 мм, хорошо промывают и высушивают в вакууме. Лолимеризованную дикарбоновую кислоту посредством двухчасового нагревани  до 180 С перевод т в ангидрид дикарбоновой кислоты. Больше 2 ч нагрев лродолхать не следует, так как затем  вно уменьшаетс  способность смешанного полимеризата образовывать св зи.

Способность св зи протешш смешанного полимеризата зависит от числа присутствующих ангидридных групп и от величины пор. При узко сшитом пр-одукте спосрбно сть к св зи меныве, чем при менее узко сшитых полимерах. Вследствие меньшего образов,ани  поперечных св зей увеличиваетс  способность набухани  полим-еризата, причем одновременно уменьдаетс  прочность на истирание.

Дл  ковалвнтной св зи пенициллинацилазы изготовл ют предпочтительно пол-имеризат из 45 ч акрил-амида , . 3 ч. NJN-мeтилeш5иcaкpилa:мида и 15 ч малаиновой кислоты. Аминогруппы пенициллинацилазы с ангидфидннми групп,ами полимеризата при рН 5,0 - 6,5, предпочтительно при рЙ 5,8. Так как вследствие сольволиза циклических ангидридных групп возникает слабокислый катионит, значение рН реакционной смеси медленно понижаетс , если в реакционную смесь непрерывно не добавл ют разбавленный раствор едкой щелочи. Целесообразно примен ть регул тор

значени  рН. Специальные услови  еакдаи имеют большое значение л  выхода св занной пенициллинаилазы . Выход зависит полностью т рН, Так например при рН 5,8

н равен Ж. пси пН 6.5 - 45 и при рН - 4,5 - только 22%.

Температура реакции также меет большое значение. Она должна быть возможно ниже. При более высоких температурах гидролиз циклических ангидридных групп протекает скорее, чем аммонолиа. Предпочтительно работаю при -+-4.

Вза.имодействие зависит, кроме того от ионной силЫ| его провод т предпочтительно в буферном раствоЕе с незначительной ионной силой. ри высоких буферш1х концентр.аци х полимеризат сжимаетс , так что фермент медленнее проникает в матрицу полимера и мржет медленнее реагировать. Предпочтительно примед ть О,01-0,05 моль фосфатного буфера. После взаимодейсти  отфильтровывают пенициллинацилаэу на носителе и интенсивно промывают водоД с 1 М раствором повдренной С.ОЛИ.

На 1 г фермента пр-ш,ш ют ,по меньшей м&ре 10 г сме.шанво.го полимэризата . И.з этой смеси при-близиг тельно Зг-4 г прцба. в раствор ферменра в 250 мл О,Ш М фо.сМтного буфера при -вначении рН 6,5 инте-нС-иВНО -размеЕИва т ипо истечении 2 ч .л ;ю-т маленьдими дозами остал-ьной .смеш.анный полимериват. &1.ачение .рН в течение всей ре-анщи подде рживают посто нный посредсожом добавлени - раабавленного раствора едкого натра. Если по прошествии

0Ч отСТОЯвши-йс  верхний в-одный слой содерхи-т, евде не прореагировавший знзим, добавл ют еще смешанный полимери-зат. Соотнатени«

1ч энйима к 15-20 ч смешанного пол-ьшери-зата  вл етс  обычно достаточным дл  полной реакции обменного разложени .

Пенициллина илазу на носителе можно Х1 анить &ез потерь ферментной эффективности.

Дл  определени  ферментной . активности пенициллинацилазы на носителе инкубируют раствор 30 000 М. Ел/мл бензилпеницилинакали  при . Освобожденную, фенилуксусную кислоту при посто нно поддерживаемом значении рН 7,8