CN116904433A - 一种酶固定化用载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶固定化用载体及其应用,涉及酶技术领域,该酶固定化用载体及其应用旨在解决现有技术下由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用,酶的活力有所损失的技术问题,该酶固定化用载体包括原料载体和包裹在原料载体内的酶,该酶固定化用载体及其应用利用交联剂进行酶分子之间的交联,使酶分子和交联剂之间形成共价键,得到三维的交联网状结构,酶之间连接牢固,具有良好的稳定性及重复使用性,且酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留,然后将酶包埋于载体内,很少改变酶的空间构象,酶活回收率较高,可超过60%,得到的固定化酶有载体保护,酶固定量高,可达10‑60㎎/g单体。

Description

一种酶固定化用载体及其应用
技术领域
本发明属于酶技术领域,具体涉及一种酶固定化用载体及其应用。
背景技术
酶可以在常温、常压下参与体内的各种代谢反应,具有能量消耗低、催化效率高的优点,与此同时酶也存在不能回收利用,难以商品发展的缺点,为了克服这一问题,人们开始了固定化酶的研究,酶固定化利用固体材料将游离态的酶在一定范围内束缚受限,赐予酶易分离可回收等特点的同时保持其自身性能不变。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类,物理方法包括物理吸附法、包埋法等,物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留,但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用,化学法包括结合法、交联法,结合法又分为离子结合法和共价结合法,是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法,但是酶的活力有所损失。
因此,针对上述物理方法不能完全适用和化学法酶的活力有所损失的问题,亟需得到解决,以改善酶固定化载体的使用场景。
发明内容
(1)要解决的技术问题
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种酶固定化用载体及其应用,该酶固定化用载体及其应用旨在解决现有技术下由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用,酶的活力有所损失的技术问题。
(2)技术方案
为了解决上述技术问题,本发明提供了这样一种酶固定化用载体,包括原料载体和包裹在原料载体内的酶。
进一步地,所述原料载体为无机载体材料、高分子载体材料和复合载体材料中的任意一种。
本发明还提供一种酶固定化用载体的制备方法,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在0-4℃下保存;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤4-6次,在0-4℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为3-5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
进一步地,所述交联试剂溶液的体积分数为6-8%,交联试剂为戊二醛、己二胺和顺丁烯二酸酐中的任意一种,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.6-4:1。
进一步地,所述载体活化反应的温度为25℃,反应时间为3-4h。
进一步地,所述0.1mol/L盐酸缓冲溶液的pH值为7.0。
进一步地,所述联酶反应的时间为12-14h。
进一步地,所述固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1。
进一步地,应用于生物及生物工程和材料科学领域。
(3)有益效果
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:本发明的酶固定化用载体及其应用利用交联剂进行酶分子之间的交联,使酶分子和交联剂之间形成共价键,得到三维的交联网状结构,酶之间连接牢固,具有良好的稳定性及重复使用性,且酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留,然后将酶包埋于载体内,很少改变酶的空间构象,因此酶活回收率较高,可超过60%,得到的固定化酶有载体保护,较之于游离酶通常稳定性更好,固定化酶能够重复使用,降低了成本,减少了酶在产物中的残留,防止产物被酶污染,酶经过固定化之后可以较长时间得持续催化反应,酶固定量高,可达10-60㎎/g单体。
具体实施方式
本具体实施方式是酶固定化用载体,包括原料载体和包裹在原料载体内的酶。
进一步地,所述原料载体为无机载体材料、高分子载体材料和复合载体材料中的任意一种。
本发明还提供一种酶固定化用载体的制备方法,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在0-4℃下保存;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤4-6次,在0-4℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为3-5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
进一步地,所述交联试剂溶液的体积分数为6-8%,交联试剂为戊二醛、己二胺和顺丁烯二酸酐中的任意一种,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.6-4:1。
进一步地,所述载体活化反应的温度为25℃,反应时间为3-4h。
进一步地,所述0.1mol/L盐酸缓冲溶液的pH值为7.0。
进一步地,所述联酶反应的时间为12-14h。
进一步地,所述固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1。
进一步地,应用于生物及生物工程和材料科学领域。
实施例1
制备本技术方案的酶固定化用载体时,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在0℃下保存,交联试剂溶液的体积分数为6%,交联试剂为戊二醛,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.6:1,载体活化反应的温度为25℃,反应时间为3h;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,盐酸缓冲溶液的pH值为7.0,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,联酶反应的时间为12h,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤6次,在0℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为3次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
通过实施例1制备的载体,其酶活回收率为65%,酶固定量为35㎎/g单体。
实施例2
制备本技术方案的酶固定化用载体时,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在4℃下保存,交联试剂溶液的体积分数为8%,交联试剂为戊二醛,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为4:1,载体活化反应的温度为25℃,反应时间为4h;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,盐酸缓冲溶液的pH值为7.0,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,联酶反应的时间为14h,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤6次,在4℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
通过实施例2制备的载体,其酶活回收率为63%,酶固定量为45㎎/g单体。
实施例3
制备本技术方案的酶固定化用载体时,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在4℃下保存,交联试剂溶液的体积分数为8%,交联试剂为戊二醛,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.8:1,载体活化反应的温度为25℃,反应时间为4h;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,盐酸缓冲溶液的pH值为7.0,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,联酶反应的时间为14h,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤6次,在4℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
通过实施例3制备的载体,其酶活回收率为75%,酶固定量为55㎎/g单体。
实施例4
制备本技术方案的酶固定化用载体时,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在2℃下保存,交联试剂溶液的体积分数为7%,交联试剂为戊二醛,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.8:1,载体活化反应的温度为25℃,反应时间为4h;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,盐酸缓冲溶液的pH值为7.0,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,联酶反应的时间为14h,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤6次,在2℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
通过实施例4制备的载体,其酶活回收率为63%,酶固定量为50㎎/g单体。

Claims (9)

1.一种酶固定化用载体,其特征在于,包括原料载体和包裹在原料载体内的酶。
2.根据权利要求1所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述原料载体为无机载体材料、高分子载体材料和复合载体材料中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,其制备步骤如下:
步骤一:载体活化
首先将交联试剂溶液与二乙醇胺混溶,在容器内搅拌30min,然后加入原料载体,进行载体活化反应,用0.1mol/L的氯化钠溶液反复洗涤,洗到中性为止,0.2mol/L盐酸于室温下搅拌30min,最后用蒸馏水洗至中性,在0-4℃下保存;
步骤二:联酶反应
在容器中加入100mL 0.1mol/L盐酸缓冲溶液和0.6g酶,搅拌20min后加入10ml的载体,25℃搅拌下进行联酶反应,反应结束后分出固定化酶小球,用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤4-6次,在0-4℃下保存;
步骤三:将步骤二中的固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀,得到混合液,用取样器吸取混合液,滴加到白瓷板的孔中待凝胶聚合;
步骤四:用蒸馏水冲洗凝胶波表面未固化的酶,冲洗次数为3-5次,蒸馏水的流速为0.3mL/min;
步骤五:测定酶活性。
4.根据权利要求3所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述交联试剂溶液的体积分数为6-8%,交联试剂为戊二醛、己二胺和顺丁烯二酸酐中的任意一种,交联试剂溶液与二乙醇胺的摩尔比为3.6-4:1。
5.根据权利要求3所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述载体活化反应的温度为25℃,反应时间为3-4h。
6.根据权利要求3所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述0.1mol/L盐酸缓冲溶液的pH值为7.0。
7.根据权利要求3所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述联酶反应的时间为12-14h。
8.根据权利要求3所述的一种酶固定化用载体,其特征在于,所述固定化酶小球、10%过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺、水和酶液混匀的体积比为75:1:0.2:22.8:1。
9.根据权利要求1所述的一种酶固定化用载体,应用于生物及生物工程和材料科学领域。
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