CN1164745C - 青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
涉及青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化技术，将四甲(乙)氧基硅烷和其衍生物在水和催化剂存在下进行水解和缩聚反应，形成溶胶，将青霉素酰化酶(细胞)配于水或pH为3～11的缓冲液中后加入溶胶，反应后得凝胶，或将青霉素酰化酶(细胞)配于水或缓冲液中，并加入有机溶剂及表面活性剂或悬浮剂，形成反相胶束或悬浮体系，在体系中加入溶胶，反应后得凝胶颗粒，保持青霉素酰化酶(细胞)的高活性，化学稳定性好，具有极高的抗变性能力，可长期保存。
Description
本发明涉及一种青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化技术。
随着半合成抗生素需求量的增加，半合成青霉素的生产已成为我国医药工业的一个重要发展方向。6-氨基青霉烷酸(简称6-APA)是生产半合成青霉素的关键原料，试制和生产6-APA是发展我国半合成青霉素的重要一环。6-APA在工业化生产中先后利用了化学法、发酵法、固定酶(青霉素酰化酶)或细胞(含青霉素酰化酶细胞)法等方法和技术手段。60年代以来，酶(细胞)的固定化技术和固定化酶(细胞)反应器不断发展和完善，固定化青霉素酰化酶或固定化含青霉素酰化酶细胞(以下简称为细胞)技术也因此成为生产6-APA的主要技术手段。
青霉素酰化酶(细胞)的固定化技术主要有吸附法、化学共价法和包埋法等。
最先使用的青霉素酰化酶(细胞)的固定化技术是吸附法。吸附法是将青霉素酰化酶溶液或细胞悬浮液与吸附剂表面接触以达到吸附结合。目前最常使用的吸附剂是离子交换剂(如羧甲基纤维素，DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖等)和硅藻土。吸附法具有简便、经济的优点；但是吸附法中酶蛋白(细胞)与载体之间的结合力相当弱、而且在很多情况下，酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活。因此，采用吸附法用于青霉素酰化酶(细胞)的固定化是很不可靠的。
目前使用最多的青霉素酰化酶(细胞)固定化技术是共价法。共价法就是使非水溶性的载体与青霉素酰化酶(细胞)以共价键的形式结合。现在主要使用的共价结合载体有多糖类化合物如羧甲基纤维素、葡聚糖凝胶4B、交联葡聚糖凝胶G-200、羧甲基交联葡聚糖凝胶、丙烯酸酯类大孔树脂、聚砜膜等。用共价法固定青霉素酰化酶(细胞)，载体与酶(细胞)的结合牢固、半衰期较长；但由于化学共价法结合时反应剧烈，会引起酶蛋白高级结构发生变化，因此酶活性回收低(45％-75％)。而且由于酶(细胞)直接暴露，所以易发生变性，并易被蛋白酶和细菌破坏。
包埋法是指将青霉素酰化酶(细胞)包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。包埋法固定化酶(细胞)的条件温和、酶活力回收高。现在主要使用的包埋剂为三醋酸纤维素和琼脂。但是，包埋法中底物分子和产物分子的扩散阻力较大，不利于酶促反应的进行；且现在使用的包埋载体还有化学稳定性差、机械强度低、颗粒分布不均匀的缺点。
本发明的目的旨在提供一种利用溶胶-凝胶反应将青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞包埋在氧化硅和/或氧化硅的有机衍生物组成的载体中，以达到青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化目的的方法。
本发明所说的固定化方法如下：
在0-70℃下，按单体摩尔数百分比为100～0％和0～100％将四甲氧基硅烷单体或四乙氧基硅烷单体和四甲氧基硅烷衍生物单体或四乙氧基硅烷衍生物单体混合后在水和催化剂存在下，进行水解和缩聚反应，反应1分钟以上，形成溶胶，水与单体的摩尔比为1∶100～500∶1，催化剂与单体的摩尔比为1∶104～1∶1，所说的催化剂为无机酸、有机酸、氨水、氟化钠；将青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞配于水或pH为3～11的缓冲液中，然后加入溶胶，进行水解和缩聚反应，形成三维氧化物网络，得到凝胶；酶或细胞量与单体的量关系为20～300g酶(细胞)/mol单体，水或缓冲液与单体的摩尔比为1∶1～500∶1，所说的缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液；将凝胶在0-70℃下陈化、干燥1小时以上得到固凝胶，最后将固凝胶研碎、过筛，得到微米～毫米级的固定化青霉素酰化酶颗粒或含青霉素酰化酶细胞颗粒。
或在0～70℃下，按单体摩尔百分比为100～0％和0～100％将四甲氧基硅烷单体或四乙氧基硅烷单体和四甲氧基硅烷衍生物单体或四乙氧基硅烷衍生物单体混合后在水和催化剂存在下，进行水解和缩聚反应，反应1分钟以上，形成溶胶，水与单体的摩尔比为1∶100～500∶1，催化剂与单体的摩尔比为1∶104～1∶1，所说的催化剂为无机酸、有机酸、氨水、氟化钠；按20～300g酶(细胞)/mol单体将青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞配于水或pH为3～11的缓冲液中，然后加入有机溶剂和表面活性剂或悬浮剂，混合形成反相胶束体系或反相悬浮体系，水水或缓冲液与单体的摩尔比为1∶1～500∶1，有机溶剂与水的摩尔比为2∶1～100∶1，表面活性剂与水的摩尔比为1∶50～50∶1，悬浮剂与水的摩尔比为1∶10～100∶1，所说的缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液，所说的有机溶剂为烃类溶剂、环己烷，所说的表面活性剂为曲通N-101、曲通X-100、丁二酸双(2-乙基己基)酯磺酸钠(AOT)，所说的悬浮剂为蔗糖脂肪酸脂、单月桂酸山梨糖醇酸酯；在反相胶束体系或反相悬浮体系中加入溶胶，进行水解和缩聚反应，形成三维氧化物网络，得到纳米～毫米级凝胶颗粒。将凝胶颗粒沉淀出，得到纳米～毫米级的固定化青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞球状颗粒。
本发明以Sol-Gel法制得的SiO2凝胶基质用于青霉素酰化酶(细胞)包埋具有以下优点：(1)反应条件温和，可保持青霉素酰化酶(细胞)的高活性；(2)基质热稳定性好，其耐热温度远远超过生物分子的热分解温度，且化学惰性；(3)基质具有一定的刚性，从而提高了掺杂分子的热稳定性，另外，由于基质的笼效应(Cage effect)，掺杂于基质中的青霉素酰化酶(细胞)一般不会渗出；(4)基质含有足够的水，青霉素酰化酶(细胞)处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与在水溶液中有相似的行为；(5)根据需要可以控制基质中孔的比表面积、孔的大小及其分布；(6)能很好地防止微生物蛋白酶的水解作用。
Sol-Gel法与吸附法和共价法相比有如下的优点：(1)Sol-Gel法包裹酶(细胞)分子是物理结合过程，它能使酶(细胞)表面的微结构得以保存，而共价键键合法则要求酶分子以一定的取向，从而阻碍底物分子进入酶的活性部位而影响其活性；(2)Sol-Gel包裹法是从溶胶转变为凝胶的过程中逐步把酶(细胞)分子包埋在基质中，酶(细胞)分子对基质无特殊要求，而物理吸附则要考虑基质孔的大小与酶(细胞)分子的匹配；(3)由于物理吸附一般是靠分子间力结合，结合力弱，酶(细胞)分子分子易渗出，靠化学键结合法的又易发生化学降解，而Sol-Gel包裹法无此弊端；(4)能很好地防止微生物蛋白酶的水解作用；(5)Sol-Gel制成的固定化酶(细胞)具有极高的抗变性能力，可长期保存；(6)合成方法简单、成本低。
Sol-Gel法与传统的包埋法相比具有如下优点(1)载体由氧化硅和氧化硅的有机衍生物组成，化学稳定性好；(2)载体是一种无机有机杂化材料，机械强度大，并有很好的生物相容性；(3)载体是一种多孔材料，且孔径可达2nm以上。底物分子和产物分子可以在其间自由扩散，并且固定化的酶(细胞)基本不泄漏；(4)采用悬浮聚合和乳液聚合的方法，可以合成了mm、μm和nm级，颗粒均匀的商品化固定化青霉素酰化酶(细胞)微球。使其可以直接用于酶柱反应器或板筐反应器，并应用于工业化生产。
考察了溶胶-凝胶法制备的固定化青霉素酰化酶的固定效率。实验结果表明：青霉素酰化酶的固定效率可以达到95％以上，酶活力可达350IU/g，并且在较苛刻条件下，未发现酶分子的泄露。考察了固定化酶的米氏常数、苯乙酸的抑制常数、高浓度底物的抑制常数。实验结果表明：固定化的青霉素酰化酶的的活力可达游离酶的85-92％；同时苯乙酸的竞争性抑制减弱；而6-APA的高浓度抑制仍然存在。考察了固定化青霉素酰化酶的稳定性。实验结果表明：固定化青霉素酰化酶可以在常温下放置4个月，而不出现明显的活力损失。
将固定化青霉素酰化酶装在酶柱中。10％的青霉素G钾盐在40℃高速循环通过酶柱进行裂解，三小时内其产率可达90％。连续操作20批，青霉素G钾盐的裂解速率无明显变化。
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)70℃下，向223mL的四乙氧基硅烷中加入80μL水和100μL 1mol/L氨水，混合反应60分钟，形成溶胶。
(2)将300g的含青霉素酰化酶细胞溶解分散在9000mL水中，并加入(1)中所得溶胶后，70℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒在70℃下，陈化1小时后，研碎，过筛，得到100-200μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实施例2
(1)0℃下，向118mL四甲氧基硅烷和27mL的甲基三甲氧基硅烷中加入8mL水和10mL 1mol/L盐酸，混合反应30分钟，形成溶胶。
(2)将100g的含青霉素酰化酶溶解在5400mL pH7.0的磷酸缓冲液中，并加入(1)中所得溶胶后，0℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒在0℃下，陈化48小时后，研碎，过筛，得到100-200μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实验结果表明，青霉素酰化酶的固定效率可以达到92％以上，酶活力可达250IU/g，活力可达游离酶的88％。将该固定化青霉素酰化酶装在酶柱中。10％的青霉素G钾盐在40℃高速循环通过酶柱进行裂解，三小时内其产率可达86％。
实施例3
(1)37℃下，向199mL的甲基三乙氧基硅烷中加入8000mL水和1000mL 1mol/L氟化钠，混合反应1分钟，形成溶胶。
(2)将20g的含青霉素酰化酶细胞溶解分散在18mL pH9.0的碳酸缓冲液中中，并加入(1)中所得溶胶后，37℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒在37℃下，陈化48小时后，研碎，过筛，得到100-200μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实施例4
(1)70℃下，向223mL的四乙氧基硅烷中加入80μL水和100μL 1mol/L氨水，混合反应60分钟，形成溶胶。
(2)将20g的含青霉素酰化酶细胞溶解分散在18mL水中，搅拌条件下加入10800mL环己烷，3000mL AOT，形成反相胶束体系。加入(1)中所得溶胶，70℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到10-100nm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实施例5
(1)0℃下向118mL的四甲氧基硅烷和27mL的甲基三甲氧基硅烷中加入8mL水和10mL 0.01mol/L盐酸，混合反应30分钟。
(2)将100g的青霉素酰化酶溶解在90mL pH7.0的磷酸缓冲液中，搅拌条件下加入4318mol环己烷，490mL曲通X-100，形成反相胶束体系。加入(1)中所得溶胶，10℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到1-5μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实验结果表明，青霉素酰化酶的固定效率可以达到95％以上，酶活力可达350IU/g，活力可达游离酶的92％。将该固定化青霉素酰化酶装在酶柱中。10％的青霉素G钾盐在40℃高速循环通过酶柱进行裂解，三小时内其产率可达90％。
实施例6
(1)37℃下向199mL的甲基三乙氧基硅烷中加入8000mL水和1000mL 1mol/L氟化钠，混合反应1分钟，形成溶胶。
(2)将300g的青含霉素酰化酶细胞分散在9000mL pH6.0的磷酸缓冲液中，搅拌条件下加入20000mL环己烷，6000mL曲通X-100，形成反相胶束体系。加入(1)中所得溶胶，37℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到10-20μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实施例7
(1)0℃下，向223mL的四乙氧基硅烷中加入80μL水和100μL 1mol/L氨水，混合反应60分钟，形成溶胶。
(2)将20g的含青霉素酰化酶细胞溶解分散在18mL水中，搅拌条件下加入10800mL环己烷，200g蔗糖脂肪酸脂，形成反相悬浮体系。加入(1)中所得溶胶，70℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到100-200μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实施例8
(1)0℃下向118mL的四甲氧基硅烷和27mL的甲基三甲氧基硅烷中加入8mL水和10mL 0.01mol/L盐酸，混合反应30分钟。
(2)将100g的青霉素酰化酶溶解在90mL pH7.0的磷酸缓冲液中，搅拌条件下加入4000mL环己烷，5g蔗糖脂肪酸脂，形成反相悬浮体系。加入(1)中所得溶胶，10℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到500-1000μm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
实验结果表明，青霉素酰化酶的固定效率可以达到92％以上，酶活力可达300IU/g，活力可达游离酶的90％。将该固定化青霉素酰化酶装在酶柱中。10％的青霉素G钾盐在40℃高速循环通过酶柱进行裂解，三小时内其产率可达87％。
实施例9
(1)37℃下向199mL的甲基三乙氧基硅烷中加入8000mL水和1000mL 1mol/L氟化钠，混合反应1分钟，形成溶胶。
(2)将300g的青含霉素酰化酶细胞分散在9000mol pH6.0的磷酸缓冲液中，搅拌条件下加入20000mL环己烷，5g单月桂酸山梨糖醇酸酯，形成反相悬浮体系。加入(1)中所得溶胶，37℃下发生凝胶化。
(3)凝胶颗粒经沉淀后，得到mm级的固定化青霉素酰化酶颗粒。
Claims (4)
1、青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法，其特征在于所说的固定化方法如下：
在0～70℃下，按单体摩尔数百分比为100～0∶0～100％将四甲氧基硅烷单体或四乙氧基硅烷单体和四甲氧基硅烷衍生物单体或四乙氧基硅烷衍生物单体混合后在水和催化剂存在下，进行水解和缩聚反应，反应1分钟以上，形成溶胶，水与单体的摩尔比为1∶100～500∶1，催化剂与单体的摩尔比为1∶104～1∶1，所说的催化剂为盐酸、氨水、氟化钠；所说的四甲氧基硅衍生物单体为甲基三甲氧基硅烷单体，四乙氧基硅烷衍生物单体为甲基三乙氧基硅烷单体；将青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞配于水或pH为3～11的缓冲液中，然后加入溶胶，进行水解和缩聚反应，得凝胶，酶或细胞量与单体的量关系为20～300g酶(细胞)/mol单体，水或缓冲液与单体的摩尔比为1∶1～500∶1；将凝胶在0～70℃下陈化、干燥1小时以上得到固凝胶；最后将固凝胶研碎、过筛，得到微米～毫米级的固定化青霉素酰化酶颗粒或含青霉素酰化酶细胞颗粒；
或在0～70℃下，按单体摩尔数百分比为100～0％∶0～100％将四甲基硅烷单体或四乙氧基硅烷单体和四甲氧基硅烷衍生物单体或四乙氧基硅烷衍生物单体混合后在水和催化剂存在下，进行水解和缩聚反应，反应1分钟以上，形成溶胶，水与单体的摩尔比为1∶100～500∶1，催化剂与单体的摩尔比为1∶104～1∶1，所说的催化剂为盐酸、氨水、氟化钠；所说的四甲氧基硅衍生物单体为甲基三甲氧基硅烷单体，四乙氧基硅烷衍生物单体为甲基三乙氧基硅烷单体；按20～300g酶(细胞)/mol单体将青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞配于水或pH为3～11的缓冲液中，然后加入有机溶剂和表面活性剂或有机溶剂和悬浮剂，混合形成反相胶束体系或反相悬浮体系，水或缓冲液与单体的摩尔比为1∶1～500∶1，有机溶剂与水的摩尔比为2∶1～100∶1，表面活性剂与水的摩尔比为1∶50～50∶1，悬浮剂与水的摩尔比为1∶10～100∶1；所说的有机溶剂为环乙烷；在反相胶束体系或反相体系中加入溶胶，进行水解和缩聚反应，得到纳米～毫米级的固定化青霉素酰化酶或含青霉素酰化酶细胞的球状颗粒。
2、如权利要求1所述的青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法，其特征在于所说的缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液。
3、如权利要求1所述的青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法，其特征在于所说的表面活性剂为曲通N-101、曲通X-100、丁二酸双(2-乙基己基)酯磺酸钠(AOT)。
4、如权利要求1所述的青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法，其特征在于所说的悬浮剂为蔗糖脂肪酸脂、单月桂酸山梨糖醇酸酯。
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