DE2912292A1

DE2912292A1 - Verfahren zur herstellung von acrylamid oder methacrylamid unter verwendung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2912292A1
Application number: DE19792912292
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Satoh; Takayuki Takano; Ichiro Watanabe
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1978-03-29
Filing date: 1979-03-28
Publication date: 1979-10-11
Also published as: SU1299501A3; FR2421212B1; RO77918A; DE2954531C2; RO82577B; FR2421212A1; IT7948496A0; NL7902453A; GB2018240A; RO82577A; DE2912292C2; IT1162484B; US4248968A; GB2018240B

Description

HOFFMANN · TBITLl? & PARTNER

PAT E N TAN WALT E

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl PL.-ING. W.EITLE · D R. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEH N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABEllASTRASSE 4 (STERHHAUS) . D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)

31 910 u/bac

Anmelder: Nitto Chemical Industry Co. Ltd., Tokyo / Japan

Beschreibung

Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen.

Zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid, ist bereits ein Verfahren bekannt, bei dem Acrylnitril (nachfolgend abgekürzt AN) oder Methacrylnitril (nachfolgend abgekürzt MAIi ) mit Wasser unter Verwendung von reduziertem Kupfer als Katalysator zur Keaktion gebracht wird. Es bestand jedoch das Bedürfnis, ein neues und industriell vorteilhafteres Verfahren zu entwickeln, weil der katalytische Prozeß die schwierige Herstellung und Eegenerierung des Katalysators erforderlich macht und weil die Isolation und die Reinigung des hergestellten Amides mit Schwierigkeiten verbunden ist.

In der UG-Fo 4 001 081 ist andererseits >ein Verfahren zur-Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid aus Acrylnitril oder Methacrylnitril unter Anwendung einer enzymatisehen Eeaktion vorgeschlagen und beschrieben, bei dem interessanter Weise ein Bakterium verwendet wird, das zu den Gattungen Bacillus, Bacteridium im Sinne von Prevot, Micrococcus, Brevibacterium im Sinne von Bergey oder ähnlichen gehört. Dieses Verfahren basiert

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hauptsächlich auf der Entdeckung, daß das oben genannte Bakterium verschiedene organische Nitrile hydrolysiert, um dabei die entsprechenden organischen Säureamide zu erzeugen. Im Falle der Anwendung von ""Acrylnitril. oder Methacrylnitril (Beispiele 6 bis 8 in der genannten US-PS) ist dort beispielsweise angegeben, daß Acrylamid oder Methacrylamid fast quantitativ erhalten wird, wenn die Reaktionsbedingungen 8 bis 12 Gew.-% Acrylnitril - oder Methacrylnitril-Konzentration, 2 bis 4 Gew.-% Bakteriumzellen-Konζentration, pH-Wert 7 bis 9* Temperatur 25° C und Reaktionszeit 20 bis JO Minuten eingehalten werden. Es trifft zwar zu, daß Acrylamid oder Methacrylamid bei einer so hohen Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% hergestellt werden kann, jedoch verlieren die Bakteriumzellen ihre enzymatische Aktivität unter diesen Bedingungen derart schnell, daß es fast unmöglich ist, das Bakteriuia erneut zu benutzen. Darüberhinaus ist die Lösung, aus der die Bakteriumzellen abgetrennt werden, äußerst stark gelb gefärbt und enthält verschiedene Verunreinigungen, die aus den Zellen stammen, so daß demzufolge ein schwieriger Reinigungsprozeß erforderlich ist. Das oben beschriebene Verfahren ist somit wirtschaftlich nicht vorteilhaft und deshalb für die industrielle Anwendung nicht geeignet.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben., das es ermöglicht, Acrylamid-oder Methacrylamid-Konzentrationen von wenigstens 10 Gew.-% oder mehr zu erreichen, ohne daß dabei eine besondere Reinigungsstufe erforderlich ist und Bakteriumzellen hierfür angegeben werden, deren enzymatische Nitrilase-Aktivität auch bei niedrigen Temperaturen hoch ist und für lange Zeit auf hohem Aktivitätsniveau verbleibt, so daß eine mehrfach wiederholte Anwendung möglich ist.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das Verfahren der eingangs angegebenen Art erfindungsgemäß durch die Merkmale der Ansprüche 1 und/ oder 2 gekennzeichnet; bevorzugte Ausführungen dieses Verfahrens sind durch die Merkmale der Unteransprüche gekennzeichnet.

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Die vorliegende Erfindung schlägt somit ein Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen mit Nitrilase-Aktivität vor. Dieses Verfahren schließt ein (1) die Verwendung von hochaktivem Bakterium, das zu den Gattungen Corynebacterium oder Nocardia gehört, (2) die Durchführung der Reaktion unter Verwendung von Mikroorganismen mit Nitrilase-Aktivität bei Temperaturen, die bei oder in der Nähe des Gefrierpunktes des Mediums und bis 15° C reichen, so daß die Reaktion während einer langen Zeitperiode durchgeführt werden kann, während eine hohe Konzentration von Acrylamid oder Methacrylamid beibehalten wird, und (3) die Durchführung der Reaktion in einem entsprechend neu eingeteilten kontinuierlichen Kolonnenprozeß , um eine hochkonzentrierte wässrige Acrylamid- oder Kethacrylamidlösung in wirtschaftlich vorteilhafter Weise zu erhalten.

Es wurde somit ein neuer katalytischer Prozeß für die Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen untersucht, und es wurden Bakteria festgestellt, die eine extrem.hohe Aktivität für die Hydrolyse von Acrylnitril und Methacrylnitril zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid haben. Insbesondere die Stämme F-771 und ΪΓ-774-7 die zu den Gattungen Corynebacterium gehören, und der Stamm N-775» der zu der Gattung Nocardia gehört, sind auf dem Grund um das Gelände der Fabrik für die Herstellung von Acrylnitril und im Abwasser, das aus dieser Fabrik stammt, gefunden. (Nachfolgend werden die zuvor genannten Bakteria jeweils als N-771, N-774- und N-775 bezeichnet.) Die enzymatische Nitrilaseaktivität dieser Mikroorganismenstämme ist bei niedrigen Temperaturen überraschend hoch. Als Ergebnis intensiver Untersuchungen ist ein Verfahren zur Hydrolyse von Acrylnitril und Methacrylnitril gefunden worden , bei dem die enzymatische Aktivität der Bakteriumzellen auf einem hohen Niveau für eine lange Zeit stabil erhalten bleibt,_wobei gleichzeitig das hergestellte Acrylamid oder das Methacrylamid Konzentrationen von 10 Gew.-% oder mehr erreicht und das Verfahren eine schwierige Reinigungsstufe nicht erfordert. 909841/0709

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung wird ein Verfahren für die kontinuierliche Herstellung einasvwässrigen hochkonzentrierten Acrylamid-oder Methacrylamid-Lösung vorgeschlagen, indem eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch eine Kolonne oder durch mehrere Kolonnen gäLeitet wird, die mit festgelegten Bakteriumzellen gefüllt sind, welche eine Nitrilaseaktivität aufweisen, die bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt der Lösung bis JO⁰ C bei einem pH-wert von etwa 6 bis 10 vorliegt und dieses Verfahren darin besteht, daß (1) eine Kolonne verwendet wird, die einen oder mehrere Einlasse aufweist, die zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß angeordnet sind, v/obei eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den Kolonneneinlaß kontinuierlich beschickt wird, während zur gleichen Zeit Acrylnitril oder Methacrylnitril durch das oder die genannten Zwischeneinlässe kontinuierlich in einer Menge zugeführt wird, die in dem Reaktionsmedium löslich ist oder

(2) daß zwei oder eine Vielzahl von Kolonnen verwendet werden, die miteinander in Serie verbunden sind, wobei eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den ersten Kolonneneinlaß eingeführt wird und zur gleichen Zeit kontinuierlich Acrylnitril oder Methacrylnitril durch die Kolonnenzwischeneinlässe zwischen der Folge von Kolonnen in einer Menge eingeleitet wird, die in der Eeaktionsmischung löslich ist.

Die nachfolgende detailierte Beschreibung der Erfindung dient zur näheren Erläuterung derselben.

Als Mikroorganismenstämme, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kommen solche in Präge, die fähig sind, Acrylnitril oder Methacrylnitril zu hydrolysieren und Acrylamid oder Methacrylamid zu erzeugen, und zwar sowohl unabhängig von der Zugehörigkeitsposition (taxonomic position), als auch mit Vorteil die bereits genannten Stämme N-771, N-774 und N-775. Beispielsweise können Bakteriumzellen der Gattungen Bacillus,

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Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium, die in der genannten US-PS 4 001 081 beschrieben sind, ebenfalls verwendet werden. Darüberhinaus ist es auch möglich, einen zellularen Extrakt zu verwenden, der durch Zerstörung derartiger Bakterienzellen , durch Rohenzymaufbereitungen u.s.w. hergestellt ist.

Für die Kultivierung der Mikroorganismenstämme, die bei der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, dienen übliche Kulturmedien, die eine Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Maltose, u.s.w.), eine Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid u.s.w.), eine organische Nährstoffquelle (z.B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt, u.s.w.) und eine anorganische Nährstoffquelle (z.B. Phosphate, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen, Mangan, u.s.w.) enthalten. Die Kultur wird aerobisch geführt, während der pH-Wert des Kulturmediums auf etwa 6 bis 9 "bei einer Temperatur von etwa 20 bis 35° C gehalten wird, vorzugsweise etwa 25 bis JO⁰ C, und zwar für etwa 1 bis 5 Tage.

Die Stämme N-771, N-774 und N-775, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter den Nummern FERM-P 4445, 4446 und 4447 hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften Jeder dieser Stämme werden nachfolgend angegeben.

A: Stamm N-771

(a) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen:

(0,5 - 0,8) /u χ (2 - 5) /u

(2) Pleomorphismus der Zellen:

Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterienzellen als lange stäbchenförmige Gebilde ohne Krümmung vor, wachsen unter Verzweigung und brechen und spalten danach, zu Gebilden in kokoider oder kurzer Stäbchenform auf.

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ORIGINAL INSPECTED

2Ü12292

(3) Beweglichkeit: keine

(4) Sporen: keine

(5) Gramfärbung: positiv

(6) Säurefestigkeit: negativ

(7) Metachromatisches Granulat: positiv

(b) Wacbstumszustand in unterschiedlichen Kulturmedien (bei 30⁰C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur:

Bundscheiben (1 bis 3 mm Durchmesser) mit festen Kanten, glatt, halbspärisch, opaK mit Lüster, leicht pLnkfarben.

(2) Nährstoff Agar Flächenkultur:

Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, konvex, glänzend, leicht pinkfarben.

(3) Flüssige Bouillonkultur:

Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Häütchen) mittelgradige Trübung mit Wachstum, Bildung eines Niederschlages.

(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:

Gutes Wachstum an der Oberfläche, trichterförmiges Wachstum entlang des Impfstabes bei nahezu keinem Wachstum im unteren Bereich, keine Verflüssigung der Gelatine.

(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Eeduktion von Nitrat: positiv

(2) Entnitrierung: negativ

(3) MB-Test: negativ

(4) VP-Test: negativ

(5) Indolbildung: negativ

(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ

(7) Stärkehydrolyse: negativ

(8) Verwendung von Zitronensäure:

Kosers Kulturmedium: negativ Christiansens Kulturmedium: positiv

(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen:

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Nitrat: Ammoniumsalze:

Pigmentbildung; Urease: Oxidase: Katalase:

positiv positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

Hydrolyse von Zellulose: negativ Wachs turnst) er ei cn: pH-Wert 5 bis 10; Temperatur 5 bis

37°C

Sauerstoffverhältnis: aerobisch O-F-Test F

Värmebeständigkeit ( in 10 %iger Magermilch, bei 72° C für 15 Minuten): keine Säure-undGas-Bildung aus Zucker

L-Arabinose D-XyIose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Sucrose Lactose Trehalose D-Sorbitol D-Mannitol Inositol Glycerin Stärke Salicin

Säure-Bildung Gas-Bildung

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copy

B: Stamm H-774

(a ) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen

(0,5 - 0,8) /u χ (2 - 5) /U

(2) Pleomorphismus der Zellen:

Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterienzellen als lange stäbchenförmige Gebilde ohne Krümmung vor, wachsen unter Verzweigung und brechen und spalten danach zu Gebilden in kokoider oder kurzer Stäbchenform auf.

(3) Beweglichkeit: keine

(4) Sporen: keine

(5) Gramfärbung: positiv

(6) Säurefestigkeit: negativ

(7) Metachromatisches Granulat: positiv

(b) Vachstumszustand in unterschiedlichen Kulturmedien (bei 50⁰C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur

Rundscheiben ( 1 bis 3 mm Durchmesser), leicht irregulär, glatt mit der Tendenz der Oberflächentrocknung, flach, opak, leicht pinkfarben.

(2) Nährstoff Agar Flächenkultur

Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, konvex mit der Tendenz zur Trocknung, leicht pinkfarben.
(5) Flüssige Bouillonkultur:

Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Häutchen), leicht trüb, Bildung eines Niederschlages mit Wachstum.

(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:

(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

- 12 -

909841/0709 '

COPY

- 12 (c) Physiologische Eigenschaften

(1) Eeduktion von Nitrat: positiv

(2) Entnitrierung: negativ

(3) ME-Test: negativ

(4) VP-Test: negativ

(5) Indolbildung: negativ

(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ

(7) Stärkehydrolyse negativ

(8) Verwendung von Zitronensäure:

Kosers Kulturmedium: negativ

Christiansens Kulturmedium: positiv

(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen: Nitrat: positiv Ammoniumsalze: positiv

(iO)Pigment"bildung: negativ

(11) Urease: positiv

(i2)0xidase: negativ

(13) Katalase: positiv

(14) Hydrolyse von Zellulose: negativ

(15) Wachstumsbereich: pH-Wert 5 t>is 10; Temperatur 10 bis

40° C

(i6)Sauerstoffverhältnis:aerobisch
(i7)0-F-Test P

(18)Wärmebeständigkeit (in 10 %iger Magermilch, bei 72° C

für 15 Minuten): keine
(i9)Säure-und Gas-Bildung aus Zucker '

Säure-Bildung Gas-Bildung

L-Arabinose + D-Xylose

D-Glucoöe '+ -

D-Mannose + -

D-Fructose . + -

D-Galactose ■ - -

Maltose . + -

Sucrose - -

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lactose -

frehalose +

JD-Sorbitol +

B-Mannitol +

Inositol -

Glycerin +

Stärke -

Salicin +

C; Stamm Ή-775

(a) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen:

(0,6 - 1,0^u χ (5 - 15)/U

(2) Pleomorphismus der Zellen:

Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterienζeilen vor als lange stäbchenförmige Gebilde mit strichähnlicher Erscheinungsform (hypha-like appearance), wachsen unter Verkettung und brechen und spalten später in kokoide oder kurzstäbchenartige Form auf.

(3) Beweglichkeit: keine

(4) Sporen: keine

(5) Gramfärbung: positiv

(6) Säurefestigkeit: schwach positiv

(7) Ketachromatisches Granulat: positiv

(b) Wachstumszustand in verschiedenen Kulturmedien ( bei 30°C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur:

Rundscheiben (1 bis 3 mm Durchmesser) , irregulär, glatt, mit Belief, opak, leicht glänzend, leicht rot.

(2) Nährstoff Agar Plächenkultur:

Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, flachtrapezoider Querschnitt mit leichtem Glanz, leicht rot.

(3) Flüssige Bouillonkultur:

Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Hätchen),

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transparente Lösung, bildet leicht einen Niederschlag mit Wachstum.

(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:

Gutes Wachstum an der Oberfläche, trichterförmiges Wachstum entlang des Impfstabes bei nahezu keinem Wachstum am unteren Stabteil, keine Verflüssigung der Gelatine.

(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv

(2) Entnitrierung: negativ (5) MR- Test negativ

(4) VP-Test: negativ

(5) Indolbildung: negativ

(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ

(7) Stärkehydrolyse: negativ

(8) Verwendung von Zitronensäure: Kosers Kulturmedium: positiv Christiansens Kulturmedium: positiv

(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen: Ammoniumsalze: positiv

Nitrate: positiv

(lO)Pigmentbildung: negativ (ii)Urease: positiv

(i2)0xidase.^/ negativ

(i3)Katalase: positiv

(i4)Hydrolyse von Zellulose: negativ (15) Wachstumsbereich: pH-Wert 6 bis 10; Temperatur 10 bis

40° C

(i6)Sauerstoffverhältnis: aerobisch (i7)0-P-Test: 0

(18)Wärmebeständigkeit (in 10 %iger Magermilch, bei 72⁰C

für 15 Minuten): keine
(19)£äure-und Gas-Bildung aus Zucker

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Säure-Bildung Gas-Bildurtp;

D-Arabinose +

D-Xylose +

D-Glucose +

D-Mannose -

D-Fructose +

D-Galactose +

Maltose -

Sucrose +

Lactose -

Trehalose +

D-Sorbitol +

D-Mannitol +

Inositol -

Glycerin + Stärke

Salicin -

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Um die Zuordnungsposition der Bakterienstämme aufgrund der oben angegebenen bakteriologischen Eigenschaften entsprechend Bergy's "Manual of Determinative Bacteriology, 7th ed. (1957) und 8th ed. (1974) zu bestimmen, fallen die Stämme H-771 und N-774-unter die aerobischen, Gram-positiven, nichtsäurefesten und katalysepositiven stäbchenförmigen Kategorien,die keine Endo-Sporen und keine Geißeln bilden. Aufgrund der Tatsache, daß die Bakterien als lange Stäbchenform im Anfangsstadium des Wachstums auftreten, keine faserförmige Art zeigen, jedoch ein verzweigendes Wachstum ohne Verkettung aufweisen und daß das Bakterium in kokoide oder kurze stabförmige Gebilde aufbricht und aufspaltet ist es klar, daß hier die Kategorie der Coryneform-Bakterien vorliegt. Darüberhinaus ergibt ein Vergleich mit den Coryneform-Bakterien, die in Bergy's Manual beschrieben sind, daß für die Bakterien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Zugehörigkeit auszuschließen ist für : (1) die Gattung Cellulomonas, weil sie keine Zellulose abbauenden Eigenschaften haben, (2) die Gattung Arthrobacter, weil die Gram-Färbung nicht variabel ist, (3) die Gattung Microbacterium, weil sie keine Hitzebeständigkeit in 10 %-iger Magermilch bei 72° C für 15 Minuten haben, und (4) die Gattung Kurthia, weil sie keine Geißeln haben. Hieraus folgt somit, daß die bei der vorliegenden Erfindung zu verwendenen Bakterienstämme zur Gattung Corynebacterium gehören.

Der Stamm N-775 fällt unter die aerobische, Gram-positive, schwach säurefeste und Katalase-positive stäbchenförmige Kategorie und bildet keine Endosporen und keine Geißeln. Aufgrund der Tatsache, daß die Eakterienstämme in Form langer Stäbchen im Anfangsstadium des Wachstums vorliegen, strichähnliche Erscheinungsform zeigen und unter Verzweigung wachsen,um danach zu kokoiden oder kurzstäbchenförmigen Gebilden zu brechen und zu spalten, ist dieser Stamm als zur Gattung Nocardia gehörig anzusehen.

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Zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung genügt es, einen Mikroorganismenstamm auszuwählen, der die Fähigkeit -hat _s Acrylnitril oder Methacrylnitril zu hydrolysieren oder einen der oben angegebenen Mikroorganismen zu verwenden,zu kultivieren für 2 bis 3 Tage in der oben angegebenen ¥eise, die Bakteriumzellen von der Kulturlösung durch Zentrifugieren abzutrennen, in V/asser oder in physiologischer Salzlösung zu suspendieren und Acrylnitril oder Methacrylnitril der Einwirkung der Zellen zu unterwerfen.

D.h., äaß die Beaktion üblicherweise in einer wässrigen Suspension durchgeführt werden soll, die etwa 1 bis 10 Gewichts.-% (berechnet als Trockensubstanz) der Bakteriumzellen und 0,5 bis 10 Gew.-% Acrylnitril oder Methacrylnitril enthält, und zwar bei einer Temperatur im Bereich etxtra vom Gefrierpunkt des Mediums bis 30° C, vorzugsweise etwa vom Gefrierpunkt bis 15° C, bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 10, vorzugsweise etwa 7 bis 9, für etwa 0,5 his 10 Stunden. Zusätzlich zu dieser Reaktion ist es vorteilhaft, stets Acrylnitril oder Methacrylnitril in konzentrierter Form als solche in das System einzuführen, wobei die Konzentration von Acrylnitril oder Methacrylnitril im System auf ein Maß von nicht mehr als 2 Gew.-% zu begrenzen ist, weil sie eine starke Toxizität besitzen und die enzymatische Reaktion verzögern würden. Im allgemeinen sind geringfügig höhere Konzentrationen von Acrylnitril und Methacrylnitril im Standverfahren eher möglich als im kontinuierlich durchgeführten Verfahren , das nachfolgend beschrieben wird, weil es möglich ist, das Reaktionssystem zu rühren, so daß ein homogenes System erhalten werden kann.

eier Beaktion soll der pH-Wert vorzugsweise so gesteuert werden, daß er im Bereich von 7 bis 9 verbleibt, indem im Bedarf sf alle laufend Ätzalkali, Ammoniak oder ähnliches hinzugefügt wird oder indem von vornherein eine Pufferlösung in das Reaktionssystem eingeleitet wird. pH-Werte außerhalb des oben

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genannten Bereiches würden zu einer weiteren Hydrolyse des erzeugten und abgetrennten Acrylamids oder Methacrylamids unter Bildung von Nebenprodukten führen oder es würde zu einer Verminderung der Stabilität der Zellenzyme kommen. Unter Berücksichtigung obiger Bedingungen können Acrylamid oder Methacrylamid mit fast hundertprozentiger Ausbeute hergestellt und abgetrennt werden.

Es wird insbesondere darauf hingewiesen, daß die Gesamtkonzentration des herzustellenden Acrylamids oder Methacrylamids und die Dauerhaftigkeit der Enzym-Aktivität der Zellen merklich verbessert werden, wenn die Reaktion bei einer Temperatur durchgeführt wird, die in einem Bereich vom Gefrierpunkt des Reaktionsmediums bis 15° C liegt; dies basiert auf der nachfolgend beschriebenen Erkenntnis, die bislang unbekannt war und überraschend ist.

Es wurde nämlich folgendes gefunden: (1) Die Mtrilase, die durch die vorgenannten Bakteriumzellen im Ergebnis der vorliegenden Erfindung als Hydrolase produziert und gesammelt wird, hat eine beträchtlich höhere Aktivität als die allgemein bekannte Hydrolase, und zwar um das 1O-bis 50-fache. Aus diesem Grund kann die Reaktion bei einer wirtschaftlichen Reaktionsausbeute sogar bei Temperaturen durchgeführt werden, die 15° C oder weniger betragen. (2) Das Enzym, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat eine verhältnismäßig geringe Hitzebeständigkeit und könnte in einer äußerst kurzen Zeit bei Temperaturen inaktiviert werden, die üblicherweise bei normalen enzymatischen Reaktionen angewendet werden (25 bis 30° C), so daß der Effekt sich nicht vollständig zeigen kann, weil verschiedene chemische Behandlungen zur Sicherstellung der Stabilität durchgeführt werden, sofern die Reaktion nicht bei niedrigen Temperaturen durchgeführt wird. (3) Weil das bei der vorliegenden Erfindung anzuwendende Enzym eine relativ hohe Aktivität aufweist und bei niedrigen Temperaturen reagieren kann, ist es mög-

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lieh, die Verzögerung der enzymatischen Aktivität von Acrylnitril oder Methacrylnitril und Acrylamid ocer Methacrylamid beträchtlich zu verringern, so daß man im Ergebnis Konzentrationen von erzeugtem Acrylamid, oder Methacrylamid erhält, die sogar 10 bis 30 Gew.-% erreichen, während die enzymatisch^ Aktivität für eine lange Zeitperiode stabil aufrechterhalten bleibt.

Diese Mikroorganismenstämme können als intakte Zellen verwendet werden, jedoch ist es vom Standpunkt der wiederholten Verwendbarkeit , der kontinuierlichen Durchführung und Reinigung vorteilhaft, festgelegte Zellen, insbesondere durch Einbettung in ein Polyacrylamid und verwandte polymere Gele festgelegte Zellen zu verwenden.

Bei üblicherweise festgelegten Zellen, die durch Einbettung der Zellen mit Polyacrylamid und verwandten Polymeren hergestellt werden, beträgt der Grad der enzymatischen Aktivität in den festgelegten (immobilisierten) Zellen 30 bis 60 % der Aktivität von intakten Zellen in den meisten Fällen. Andererseits können die Mikroorganismenzellen,die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bei einer Festlegung auf einen Aktivitätsgrad von 100 % gebracht werden, weil es sich um Mikroorganismen handelt, die Acrylamid-erzeugende Bakteriumzellen sind und gegen hochkonzentrierte Acrylamide stabil sind, ferner weil die Immobilisierung der Zellen bei 15° C oder weniger durchgeführt werden kann.

Die Immobilisierung der Zellen kann erreicht werden, indem die oben genannten Mirkoorganismenstämme in einem geeigneten wässrigen Medium suspendiert werden (z.B. Wasser» physiologische Salzlösung, Pufferlösung u.s.w.), das ein Acrylamid-Serien-Monomeres und ein Verzweigungen bildendes Mittel enthält, indem ein geeigneter Polymerisationsinitiator und ein Polymerisationsbeschleuniger zu der Suspension hinzugefügt, die Polymerisation

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und Gelierung "bei einer Temperatur von O bis 30° C, vorzugsweise O bis 15° C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 10, vorzugsweise etwa 6 bis 8 durchgeführt wird. Der Gehalt des Mikroorganismenstammes in der Polymerisationsreaktionslb'sung hängt von der Art und der Form des verwendeten Mikroorganismenstammes ab, jedoch sind 0,1 bis 50 Gew.-% , vorzugsweise etwa 1 bis 20 Gew.-% gerechnet als trockene Substanz, üblich.

Das Acrylamid-Serien-Iionomere, das für die Immobilisierung der Zellen bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt beispielsweise Acrylamid, Methacrylamid u.s.w. und - falls erforderlich - äthylenisch ungesättigte Monomere, die mit jenen copolymerisierbar sind und die deshalb in Kombination verwendet werden können, ein. Die Konzentration des Monomeren in der Eeaktion soll wenigstens so hoch sein, daß im Ergebnis der Polymerisation ein Gel gebildet wird; gewöhnlich werden 2 bis JO Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-% , bezogen auf die Keaktionslösung, verwendet.

Als Verzweigungen bildendes Mittel kommen N.N'-Methylen-bis-Acrylamid, 1,3-Di-(Acrylamidmethyl)-2-Imidazolidon und ähnliche in Präge. Als Polymerisationsinitiator und als Polymerisationsbeschleuniger werden solche ausgewählt, die die Aktivität des Mikroorganismenstammes mögichst wenig beeinträchtigen. Gewöhnlich werden Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat u.a. als Polymerisationsinitiator und Dimethylaminpropionitril, Triäthanolamin u.a. als Polymerisationsbeschleuniger verwendet, jeweils in Mengen von etwa 0,01 bis 10 Gew.-%.

Auf die beschriebene Weise werden polymere Gele erhalten, die Bakteriumzellen enthalten, d.h. festgelegte (immobilisierte) Zellen.

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Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Reaktion entweder diskontinuierlich, d„h. schubweise^ oder kontinuierlich durchgeführt werden·, die Verwendung der oben beschriebenen festgelegten Zeilen und die Durchführung in kontinuierlicher Weise im Kolonnenprozeß, der nachfolgend beschrieben wird, ermöglicht es Jedoch, eine xvässrige hochkonzentrierte Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid mit besonders guten industriellen Vorteilen zu erhalten, weil die Durchführung verhältnismäßig einfach ist und dabei die Aktivität der Zellensyme für eine lange Zeit aufrechterhalten bleibt. "

Der kontinuierliche Kolonnenprozeß gemäß der vorliegenden Erfindung wird demzufolge unter Verwendung einer oder mehrerer, miteinander in Serie verbundener Kolonnen durchgeführt, die mit nach oben beschriebener Methode festgelegten Zellen in einer Dichte von etwa 0,5 bis 0,5 g immobilisierter Zellen pro ei gefüllt sind, welche zu einer geeigneten Größe zerteilt sind (etwa 0,5 bis 5 MQi vorzugsweise etwa 1 bis 3 mm), wobei dann eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den Kolonneneinlaß eingeleitet wird und zur gleichen Zeit kontinuierlich Acrylnitril öder Methacrylnitril an einem Zwischenstück, das Örtlich vor der vollständig abcgeschlossenen Reaktion sich befindet, kontinuierlich in einer Menge eingeleitet wird, die in der Reaktionslösung löslich ist. Genauer gesagt heißt das, daß bei Verwendung einer Kolonne ein sog. Kolonnenteil vorteilhaft ist, der üblicherweise einige Sektionen aufweist und eine oder mehrere Zuführungsleitungen zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß aufweist, wobei je Sektion eine Zuführungsleitung vorgesehen ist. Eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril wird kontinuierlich durch den Kolonneneinlaß einleitet und zur gleichen Zeit wird Acrylnitril oder Methacrylnitril kontinuierlich durch alle diese Zuführungsleitungen eingeführt. Eine vorteilhafte Zuführungsmenge beträgt etwa 0,1 bis 1,5 g AN oder MAN pro Gramm Bakteriumzellen und pro Stunde, wobei 0,3 bis 0,8 6 AH oder MAII pro Gramm Bakteriumzellen und pro Stunde besonders vorzuziehen sind. Die Menge an Acrylnitril oder Meth-

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clef

acrylnitril , die durch jede'Zuführungsleitungen eingeleitet wird, ist derartig, daß das Acrylnitril oder Methacrylnitril , das einleitet wird, sich in der Seaktionsmischung auflösen kann. Es ist vorteilhaft, die Konzentration von Acrylnitril oder Methacrylnitril im Reaktionssystem auf ein Niveau zu begrenzen, das nicht höher als 2 Gew.-% beträgt, weil - wie oben erläutert bei höheren Konzentrationen der toxische Effekt von AN und MAN sich auszuwirken beginnt und die enzymatische Reaktion verzögert. Besondere Zuführungsmengen je Zuführungsleitung sind nicht erforderlich wegen des Unterschiedes in der Verbrauchsmenge von AN oder MAN während des Ablaufs der Eeaktion, d.h. die Zuführungsinengen variieren in Abhängigkeit davon, ob das AN oder das MAN hei dem jeweiligen Niveau löslich ist.

Werden zwei oder mehrere Kolonnen verwendet, so sind sie miteinander in Serie verbunden; die wässrige Lösung von AN oder MAN wird durch den Kolonneneinlaß der ersten Kolonne eingeleitet, während AN oder MAN durch die nachfolgend und successive längs der Kolonne angeordneten Zuführungsleitungen in der gleichen Weise eingeleitet werden, wie es oben beschrieben ist. Es kann somit eine hochkonzentrierte Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid als Eluat der zweiten oder der letzten Kolonne erhalten werden.

Andererseits ist es beim üblichen kontinuierlichen Kolonnenprozeß schwierig gewesen, die Bakteriumzellen in einen gleichmäßigen Kontakt mit einem Material zu bringen, das eine geringe Löslichkeit in Wesser aufweist, wie z.B. Acrylnitril oder Methacrylnitril bei hohen KonzentrstLonen, das dann reagieren soll, so daß der übliche Prozeß an dem Mangel leidet, daß hochkonzentriertes Acrylamid oder Methacrylamid in Form einer wässigen Lösung mit hohem Wirkungsgrad und auf einfache Weise nicht erhalten werden kann und daß die enzymatische Aktivität der Bakteriumzellen besonders stark reduziert wird.

- 23 909841/07 09

Gemäß der vorliegenden Erfindung können darüberhinaus sogar noch höher konzentrierte wässrige Lösungen von Acrylamid oder Methacrylamid oder Kristalle von Acrylamid oder Methacrylamid aus der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen wässrigen Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid erhalten werden, wenn man übliche Techniken anwendet. Beispielsweise kann die oben beschriebene Reaktionslösung - falls erforderlich - mit Aktivkohle, Ionenaustauscherharz, ü.s.w. behandelt werden, wonach sie unter verringertem Druck konzentriert wird, um eine höher konzentrierte wässrige Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid oder sogar Kristalle hiervon zu erhalten.

Die Erfindung soll nunmehr im einzelnen durch die nachfolgend angegebenen Beispiele bevorzugter Ausführungsformen beschrieben werden, die jedoch in keiner Weise den Umfang des Erfindungsgedankens einengen. Es wird darauf hingewiesen, daß alle Teilangaben und Prozente in den nachfolgenden Beispielen als Gewichtsprozente zu verstehen sind. Die Reaktionsprodukte, wie beispielsweise Acrylamid und Methacrylamid, nicht reagiertes Material, beispielsweise Acrylnitril und Methacrylnitril , und Nebenprodukte wie Methacrylsäure und Acrylsäure_fwurden mittels GasChromatographie bestimmt.

Beispiel 1

12,5 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 80 %) , der durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2) bereitet wurde, das Λ % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 % Malzextrakt enthielt, 6 Teile Acrylnitril und 81,5 Teile eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,8) wurden miteinander vermischt und für eine Stunde bei 30° C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Diese Lösung enthielt 8 % Acrylamid, enthielt jedoch kein unreagiertes Acrylnitril und keine

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Nebenprodukte, wie beispielsweise Acrylsäure. Hieraus folgt, daß die Reaktion praktisch quantitativ abgelaufen ist.

Beispiel 2

12,5 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt-80 %) , der in gleicher Weise bereitet wurde, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, wurden mit 87,5 Teilen Wasser gemischt, und es wurde Acrylnitril kontinuierlich tropfenweise dieser Mischung in einer Menge von 4 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei der pH-Wert auf 8,0 unter Verwendung von KOH gehalten wurde; unter Rühren erfolgte die Reaktion bei 30 C.Nach einer Reaktionszeit von 2,5 Stunden wurde die tropfenweise Zuführung von Acrylnitril gestoppt, wonach für weitere 30 Minuten gerührt wurde. Die entstandene Reaktionslosung hat noch weitere 30 Minuten reagiert und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen und eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung enthielt 12,0 % Acrylamid, unreagiertes Acrylnitril war absolut nicht feststellbar. Die Reaktion war somit vollständig abgelaufen.

Beispiel 3

15 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 80 %) , der in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt war, 8 Teile Methacrylnitril und 77 Teile eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,8) wurden gemischt und für eine Stunde bei 30° C zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Diese Lösung enthielt 10,2 % Methacrylamid. Obwohl eine Spur von Methacrylsäure feststellbar war, war unreagiertes Methacrylnitril überhaupt nicht feststellbar. Die Reaktion lief somit praktisch quantitativ ab.

909841/0709 _?ς_

Beispiel 4-

12 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-774 (Wassergehalt: 75%), der in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet war, wurden mit 88 Teilen Wasser gemischt, und es wurde Methacrylnitril kontinuierlich tropfenweise in einer Menge von 3 Teilen pro Stunde hinzugefügt, während der pH-Wert der Lösung unter Verwendung von Kaliumhydroxid auf 8,5 gehalten wurde; unter Eühren reagierte die Mischung bei 30° C. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden wurde die tropfenweise Zuführung von Methacrylnitril unterbrochen, anschließend wurde für v/eitere 30 Minuten gerührt, um das Methacrylnitril in dem System vollständig reagieren zu lassen. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. In dieser Lösung wurden 13»0 % Methacrylamid bestimmt.

Beispiel 5

25 Teile gewaschener Zellen (Wassergehalt :78%) des Stammes N-775» erzeugt durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2), das 1 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,3 % Malzextrakt, 0,1 % Acetonitril, 0,1 % KH₂PO^ und 0,05 % MgSO^.7H₃O enthält, wurden mit 5 Teilen AN und 70 Teilen eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,8) gemischt und während einer Stunde bei 30° C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung enthielt 6,7 % Acrylamid, unreagiertes AN und Nebenprodukte wie Acrylsäure konnten überhaupt nicht festgestellt werden. Hieraus folgt, daß die Reaktion praktisch vollständig bis zum Abschluß abgelaufen ist.

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-²⁶~ ■ 2912232

Beispiel 6

8 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 75 %) » erzeugt durch, aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2), das 1 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 % Malzextrakt enthielt, wurden mit 92 Teilen Wasser gemischt, und es wurde AK intermettierend tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei der pH-Wert der Lösung durch entsprechende Beigabe einer wässrigen, 0,5 N KOH-Lösung unter Rühren auf 8,0 eingestellt wurde; die Reaktion wurde bei verschiedenen Reaktionstemperaturen im Bereich von etwa 0° C bis 30° C wie in Tabelle 1 angegeben durchgeführt. Der Ablauf der Reaktion erfolgte,bis unreagiertes AN feststellbar war, in diesem Stadium wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Der Gehalt an Acrylamid wurde jeweils für jede Lösung bestimmt, um die Konzentration des angesammelten Acrylamide bei den jeweiligen Reaktionstemperaturen vergleichen zu können. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Aus diesen Ergebnissen folgt, daß die enzymatische Aktvität der Zellen stabil wurde und daß die Konzentration des erzeugten und angesammelten Acrylamide beträchtlich erhöht war, wenn die Reaktion bei Temperaturen von nicht höher als 15° durchgeführt wurde.

Tabelle 1

Versuchs-Nr.

§=1 6=2 6^2

Reakt.-xemp(ö-C) -3-0 5 10 15 20 30

Reakt.Zeit bis AN

feststellbar war (h) 16 16 14 12 5 4-

Acrylamid i.d.Heakt.-

Lösung (%) 31,8 31.0 28,1 25,0 10,7 9,3

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Beispiel 7

13 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-775 (Wassergehalt: 78 °/o) , erhalten durch Kultivierung in der im Beispiel 6 beschriebenen V/eise, wurden mit 86,5 Teilen Wasser gemischt, AN wurde intermittierend tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde zugefügt, wobei der pH-Wert der Lösung durch entsprechende Zufügung einer wässrigen, 0,5 η KOH-Lösung unter Rühren^eingestellt wurde; die Reaktion wurde bei verschiedenen Reaktionstemperaturen im Bereich von 0° C bis etwa 30° C wie in Tabelle 2 gezeigt - durchgeführt. Die Reaktion wurde danach in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise fortgesetzt, bis unreagiertes AN feststellbar war. Die Konzentration an Acrylamid wurde jeweils für ^ede Lösung bestimmt, um die in&er Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zu erhalten. Aus diesem Beispiel geht ebenfalls hervor, daß die Konzentration des hergestellten und angesammelten Acrylamids bei diesen Untersuchungen ebenfalls beträchtlich erhöht war, wenn die Reaktion bei Temperaturen von nicht höher als 15° C durchgeführt wurden.

Tabelle 2 ,_r , ,_T versuch ITr. :

7-1 7-2 7-3 7-4 7-5 7-6 Reakt.-Temp. (⁰C) -3-0 5 10 15 20 30

Reakt.-Zeit bis AN

feststellbar war (h) 14 13 11 10 5 4

Acrylamid i.d.Reakt,-

Lösung (%) 28,2 27,5 23,1 21,0 11,5 9,5

Beispiel 8

13,5 Teile gewaschener Zellen des Stammes CBS 717.73 ( der Stamm ist in den Ausführungsbeispielen der US-PS 4 001 081 beschrieben) , erhalten durch Kultivieren in der in Beispiel 6

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— do —

_ pc _

angegebenen Weise (Wassergehalt: 78 %) , wurdenmit 86,5 Teilen Wasser gemischt, und es wurde AN intermittierend und tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde zugeführt, während dabei der pH-Wert der Lösung durch entsprechende Zufügung einer

aüfx.o wässrigen, 0,5 η KOH-Lösung unter Rühren^eingestellt wurde;die Reaktion wurde bei verschiedenen Reaktionstemperaturen im Bereich von etwa 0° C bis 30° C durchgeführt, wie in Tabelle gezeigt ist. Danach wurde die Reaktion in der in Beispiel 6 angegebenen Weise fortgesetzt, bis unreagiertes AN feststellbar war. Die Acrylamidkonzentration jeder Lösung wurde bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Es geht auch aus diesem Beispiel hervor, daß die Konzentration des hergestellten und angesammelten Acrylamide bei diesen Untersuchungen erheblich erhöht war, wenn die Reaktionen bei Temperaturen von nicht höher als 15° C durchgeführt wurden.

^Tabel3e - Versucher.:

8-1 8-2 8-3 8-4 8-5 8-6

Reakt.-Temp.(⁰C) -3-0 5 10 15 20 30

Reakt.-Zeit bis AN

feststellbar war (h) 13 13 11 10 5 4

Acrylamid i.d.Reakt.-

Lösung (%) 27.5 26.2 22.9 21.3 10.2 9-5

Beispiel 9

4 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771, erhalten in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise, 0,45 Teile Acrylamid, 0,05 Teile von Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid und 4 Teile physiologischer Salzlösung wurden miteinander vermischt, um eine homogene

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Suspension zu erzeugen. Dieser Suspension wurden 0,5 Teile einer wässrigen, 5 %-±gen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 1 Teil einer wässrigen , 2,5 %-igen Kaliumpersulfat-Lösung zugefügt, danach wurde das System "bei 10° C für JO Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten- Das auf diese Weise erhaltene massive, Bakteriumzellen enthaltende Gel wurde in kleine Teile zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen, um 10 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten. Zu 20 Teilen der immobilisierten Zellen wurden 72 Teile eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0, also eine wässrige Lösung), und es wurde AlT tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei unter Rühren die Reaktion während 4 Stunden abgelaufen ist. Eine klare Lösung wurde durch Abtrennen und Entfernen der Bakteriumzellen vom Reaktionsprodukt erhalten, Nebenprodukte wie Acrylsäure und unreagiertes AN Viaren praktisch nicht feststellbar. Die Reaktion ist somit praktisch quantitativ abgelaufen.

Die abgetrennten immobilisierten Zellen wurden erneut für den Ablauf der gleichen Reaktion benutzt. Andererseits wurden entsprechende Untersuchungen bei 30° C durchgeführt, um einen Vergleich zu ermöglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Anzahl der Wiederholungen der Verwendung d.Stammes

1 2 3

5 6

Ausbeute an Acrylamid (%)

15°C	30°C
100	100
100	100
100	85
100	LfS
100	0
100	0
• 100	0

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³⁰ " ■ 2312232

Beispiel 10

40 g immobiliserter Zellen des Stammes ΪΓ-7711 erhalten in der in Beispiel 9 angegebenen Weise, wurden in eine ummantelte Kolonne (Innendurchmesser : 3 cm, Länge: 25 cm) eingefüllt, eine wässrige, 4 %-ige AN-Lösung bzw. eine wässrige 2,6 %-ige MAN-Lösung wurde kontinuierlich durch den oberen Einlaß der Kolonne mit einer Menge von 100 ml/h bei 10° C und bei 25° C (für den Vergleich) eingeleitet; die jeweiligen Reaktionszeiten sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die Mengen an erzeugten Acrylamid oder Methacrylamid bei den jeweiligen Eeaktionsstufen wurden bestimmt, wobei die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle 5

Acrylamidausb eut e (%) Methacrylamidausbeute $0

Reakt.-Zeit Qi)

10 • 20

50 100 150 200 250 300

10° C	25° C
100	100
100	32
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0

10°C	25°C
100	100
100	100
100	100
100	4
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0
100	0

- 31 909841/0709

" ³¹ " · 2312232

Beispiel 11

Die nachfolgende Tabelle 6 zeigt die Aktivität einerseits beweglicher, unbehandelter Bakteriumzellen (intact cells) und andererseits immobilisierter Bakteriumzellen im Hinblick auf unterschiedliche Mikroorganismen, die fähig sind, Acrylamid zu produzieren.

Herstellung der immobilisierten Zellen

4 Teile intakter Zellen (Wassergehalt: 75 %) , 0,45 Teile Acrylamid, 0,05 Teile Ν,Ν¹-Methylen-bis-Acrylamid und 4 Teile physiologischer Salzlösung wurden miteinander gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Dieser Suspension wurden 0,5 Teile einer wässrigen, 5 %-igen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 1 Teil einer wässrigen, 2,5 %-igen Kaliumpersulfat-Lösung hinzugefügt, wonach das System bei 10 bis 15° C und 30 Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten wurde. Nachfolgend wurden die so erhaltenen, zellenthaltenden Gele zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen, um 10 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten.

Messung der Fähigkeit, Acrylamid zu -produzieren

0,8 Teile intakter Zellen oder 2 Teile immobilisierter Zellen wurden mit 0,05 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH : 8,0) vermischt um 100 Teile zu bilden. Danach wurde 1 Teil jeder der se erhaltenen Lösung mit je einem Teil einer 0,05 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) vermischt, die 2 % AW enthielt. ITach der Reaktion bei 10° C während 3"O Minuten unter Rühren wurde das in der Reaktionslösung entstandene Acrylamid bestimmt, um die Fähigkeit, Acrylamid zu erzeugen, für jede Art der intakten und der immobilisierten Zellen zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

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2312292

Tabelle 6

Fähigkeit zur Acrylamidbildung;

Mikroorganismus

Stamm N-771 Gattung Corynebacterium(FEBM-P Nr. 4445)

Stamm N-774 Gattung Corynebacterium(FEEM-P Nr. 4446)

intakte Zellen immobilisierte Zellen

10.7

6.0

10.8

5.8

Stamm N-775 Gattung Corynebact erium ( FEEI-I-Nr. 4447)

2.6

2.5

* Menge an Acrylamid (g), erzeugt durch Reaktion während 1 Stunde pro g trockener Bakteriuiazellen.

Beispiel 12

4-0 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Vassergehalt : 75 %) » erhalen durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums(pH-Wert 7,2), das 1 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 % Malzextrakt enthielt, wurden mit 4,5 Teilen Acrylamid, 0,5 Teilen Ν,Ν'-Methyl^bis-Acrylamid und 40 Teilen physiologischer Salzlösung gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Dieser Suspension wurden 5 Teile einer wässrigen, 5 %-igen Diinethylaminopropionitril-Lösung und 10 Teile einer wässrigen, 2,5 %igen Kaliumpersulfat-Lösung hinzugefügt, wonach die Mischung bei 10° C 30 Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten wurde. Das auf diese Weise

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" ⁵³ ~ · 231229-2

erhaltene massive, zellenthaltende Gel wurde in kleine Teilchen zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gut gewaschen, um 100 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten.

ummantelte Kolonnen (Innendurchmesser 3 cm, Länge 25 cm), SE- je mit 40 g der immobilisierten Zellen H-ftgef üllt, die jeweils miteinander in Serie verbunden waren, ^i wurde eine wässrige, 4,5 %-ige AN-Lösung unter Verwendung einer 0,05 m Phosphat-Pufferlösung mit pH-Wert 8,0 durch den oberen Einlaß der Kolonne Nr. 1 bei 10° C mit einer Ablaufmenge von 50 ml/h eingeleitet (SV=O,5 h~¹). Danach wurden 100 Teile des Eluates mit 4,5 Teilen AN vermischt und durch den Einlaß der Kolonne Nr. 2 einfließen gelassen, und zwar mit einer Ablaufmenge von 52,3 ml/h (SV =0,53 h~¹). Das Eluat wurde dann nachfolgend durch die Kolonne Nr. 3 fließen gelassen, wobei die Abflußmenge auf 54,5 ml/h (SV = 0,54 h~¹) eingestellt wurde,^durch die Kolonne Nr. 4 mit 5&,8 ml/h (SV =0,57 h~¹) und durch die Kolonne Nr. 5 mit 59 ml/h (SV = 0,59 h'""¹) während einer Zeit von 48 Stunden geleitet. Auf diese Weise wurde kontinuierlich ein Eluat bei einer Reaktionsmenge von 100 % erhalten. Die Acrylamid-Konzentration in diesem Eluat betrug 25?5%·

Beispiel 13

7 ummantelte Kolonnen (Innendurchmesser 3 cm, Länge 25 cm) wurden mit 40 g immobilisierter Zellen, erhalten auf die in Beispiel 12 angegebene Weise, gefüllt; die 7 Kolonnen waren miteinander in Serie verbunden; eine wässrige, 2,5 %-ige MAN-Lösung, gelöst in 0,05 m Phosphatpuffer (pH: 8,0), wurde durch die Kolonne Nr. 1 von oben nach unten geleitet, und zwar mit einer Durchflußmenge von 100 ml/h (SV = 1,0Oh"¹) . 100 Teile des Eluates, d.h. der aus der Kolonne Nr. 1 ausfließenden

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Reaktionslösung, wurden mit 2,5 Teilen MAN vermischt und von oben nach, unten durch die Kolonne Nr. 2 mit einer Durchflußmenge von 103 ml/h (SV = 1,03 h~¹) geleitet.

Das Eluat wurde danach der Reihe nach durch die Kolonne Nr. mit auf 105 ml/h (SV = 1,05 h ) gesteuerter Durchflußmenge geleitet, danach durch Kolonne Nr. 4 mit 108 ml/h (SV=1,08h"¹), dann durch Kolonne Nr. 5 mit 110 ml/h (SV =1,10 h~¹), dann durch Kolonne Nr. 6 mit 113 ml/h (SV = 1,13 IT¹) und schließlich durch Kolonne Nr. 7 mit H5 ml/h (SV = 1,15 h"¹) geleitet, und zwar für 48 Stunden. Die Reaktionsmenge im letztlich austretenden Eluat betrug 100 %,und die Konzentration von Methacrylamid im Eluat betrug 19,3 %·

Beispiel 14

45 Teile gewaschener Zellen des Stammes Nr.-775 (Wassergehalt 78 °/o) , erhalten durch aerobische Kultivierung unteo? Verwendung eines Kulturmediums mit 1 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,3 % Malzextrakt, 0,1 % Acetonitril, 0,1 % KH₂PO₄ und0,05 % MgSO₄.7HpO, wurden mit 4,5 Teilen Acrylamid 0,5 Teilen N,N'-Methylen-bis-Acrylamid und 40 Teilen physiologischer Salzlösung gemischt, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Zu dieser Suspension wurden 5 Teile einer wässrigen, 5 %-igen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 10 Teile einer wässrigen, 2,5 %-igen Kaliumpersulfatlösung zugefügt und die gesamte Mischung bei 10° C für 30 Minuten gehalten. Das auf diese Weise erhaltene massive, Bakterxumzellen enthaltende Gel wurde in kleine Partikel zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gut gewaschen, um 100 Teile immobilisierter Bakteriumzellen zu erhalten.

Die immobilisierten Zellen wurden in eine Teilkolonne eingefüllt, die einige Teile enthielt, von denen jeder ein Volumen

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von 100 ml hatte und 40 g immobilisierter Zellen enthielt. Eine 2,5 %-ige MAN-Lösung (unter Verwendung eines 0,05 m Phosphatpuff erss , pH-Wert 8,0) wurde kontinuierlich in einer Menge von 100 ml/h durch den oberen Einlaß der obersten Sektion der Kolonne eingeleitet, xvährend die Temperatur innerhalb der Kolonne auf 15° C gehalten wurde; MAN wurde in einer Menge von 3 ml/h im oberen Teil einer jeden Sektion der Nummern 2 bis 7 zugefügt, und zwar für eine Zeit von 48 Stunden, um die Reaktion durchzuführen. In diesem Falle war kein MAN im Eluat feststellbar, das aus dem Boden der siebenten Sektion der Kolonne austrat. Hieraus folgt, daß eine 100 %-ige Reaktion erfolgt war. Der Anteil an Methacrylamid im Eluat betrug 19,3 %·

Beispiel 15

40 Teile gewaschener Bakterienzellen des Stammes CBS 717«73 (dieser Stamm ist in den Ausführungsbeispielen der US-PS

4 001 081 beschrieben), erhalten durch Kultivierung in der im Beispiel 12 beschriebenen Weise (Wassergehalt : 75 %)? wurden mit 4,5 Teilen Acrylamid, 0,5 Teilen Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid und 40 Teilen physiologischer Salzlösung gemischt, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Zu dieser Suspension wurden 5 Teile einer wässrigen, 5 %-igen Diaminopropionitril-Lösung und 10 Teile einer wässrigen, 2,5 %-igen Kaliumpersulfat-Lösung hinzugefügt, wonach das System für 30 Minuten auf einer Temperatur von 10 C gehalten wurde, um zu polymerisieren.

Das auf diese Weise erhaltene massive, Bakteriumzellen enthaltende Gel wurde in kleine Partikel zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gut gewaschen, um 100 Teile immobilisierter Bakteriumzellen zu erhalten.

5 ummantelte Kolonnen (Innendurchmesser 3 cm, Länge 25 cm),

je gefüllt mit 40 g der immobilisierten Zellen , waren miteinander in Serie verbunden; eine wässrige, 4 %-ige AN-Lösung

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2S12292

(unter Verwendung eines 0,05 m Phosphatpuffers, pH-Wert 8,0) wurde von oben nach unten durch die Kolonne Nr. 1 bei einer Temperatur von 10° C und einer Durchflußmenge von 50 ml/h (SV =0,5 h"¹) geleitet. Nachfolgend wurden 100 Teile des Eluates mit 4,5 Teilen AN gemischt und dann durch die Kolonne Nr. 2 durch deren oberen Einlaß mit einer Durchflußmenge von 52,3 ml/h (SV = 0,55 h~¹) geleitet.

Das Eluat wurde danach in ähnlicher Weise und hintereinander durch die Kolonne Nr. 3 mit auf 54,5 ml/h (SV =0,54 h~¹) eingestellter Durchflußmenge geleitet, danach durch Kolonne Nr. mit 54,8 ml/h (SV =0,57 ti"'¹) und schließlich durch Kolonne Nr.5 mit 59 ml/h (SV = 0,59 h~¹) geleitet. Die Analyse des Eluates der Kolonne Nr. 5 ergab 48 Stunden nach dem Beginn des Durchflusses der Lösung das Vorhandensein einer geringen Menge Acrylnitril, die Konzentration an Acrylamid betrug 24,8 %.

Obwohl die Erfindung ins einzelne gehend und unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen derselben beschrieben worden ist, ist es für einen auf diesem Gebiet tätigen Fachmann offensichtlich, daß verschiedene änderungen und Modifikationen des Verfahrens möglich sind, ohne vom Wesen und vom Umfang der Erfindung abzuweichen.

18 Patentansprüche

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Claims

HOFFMANN - BITI/jS Oc PAHTFER

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197<5) . DIPL.-ING. W.EIILE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL. -ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE4(STERNHAUS) . D-SOOO MÖNCHEN 81 · TELEFON (08?) 911087 ■ TELEX 05-59ί19 (PATHE)

Unsere Nr. 31 910 u/bac

Anmelder; Nitto Chemical Industry Co- Ltd., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter "Verwendung von Mikroorganismen

Patentansprüche

· Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß Acrylnitril oder Methacrylnitril in wässrigem Medium der Einwirkung eines Bakteriums unterworfen werden, das zur Gattung Corynebacterium oder zur Gattung Jüfocardia gehört und fähig ist, Acrylnitril oder Methacrylnitril bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Mediums bis 30° C bei einem pH-Wert von 6 bis 10 zu hydrolysieren.
2. Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid unter Verwendung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß Acrylnitril oder Methacrylnitril in einem wässrigen Medium der Einwirkung eines Bakteriums unterworfen wird, das fähig ist, Acrylnitril oder Methacrylnitril bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Mediums bis 15° C bei einem pH-Wert von 6 bis 10 zu hydrolysieren.
3« Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mikroorganismenstammes, der aus einem Bakterium ausgewählt ist, das zu den Gattungen Corynebacterium, ITocardia, Bacillus, Bacteridium im Sinne von Prevot, Micrococcus und Brevibacterium im Sinne von Bergey gehört.

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— 2 —
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Bakteriums des Stammes Corynebacterium oder des Stammes Nocardia.
5. Verfalrren nach Anspruch 1 oder 3> gekennzeichnet durch die Verwendung eines Bakteriums des Stammes Corynebacterium.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Bakteriums des Stammes Hocardia.
7« Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium in einem polymeren Gel festgelegt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7? dadurch gekennzeichnet, daß das festgelegte Bakterium in einem Polyacrylamid und einem verwandten Polymer eingebettet ist.
9· Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung einer hochkonzentrierten Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch eine oder mehrere Kolonnen geleitet wird, die mit festgelegten Bakteriumzellen gefüllt ist, die eine Nitrilase-Aktivität bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Mediums bis 30° C bei einem pH-Wert von 6 bis 10 aufweist, während Acrylnitril oder Methacrylnitril durch einen oder mehrere Einlasse zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß in einer Menge zugeführt wird, die in der Reaktionsmischung löslich ist.
10.Verfahren nach Anspruch 9? dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei miteinander in Serie verbundene Kolonnen verwendet werden und eine wässrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den ersten Kolonneneinlaß eingeleitet wird, während Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den zvelten oder folgende Kolonneneinlässe eingeleitet wird.
11.Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,

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daß das verwendete Bakterium aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Corynebacterium, Nocardia, Bacillus, Bacteridium im Sinne von Prevot, Micrococcus und Brevibacterium im Sinne von Eergey bestellt.
12.Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Bacterium in einem polymeren Gel festge-r legt ist.
13.Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete festgelegte Bakterium in einem Polyacrylamid und verwandtem polymeren Gel eingebettet ist.
14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer [Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Mediums bis 15°C durchgeführt wird.
15·Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Bakterium zu den Gattungen Corynebacterium oder Nocardia gehört.
16.Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Bakterium zur Gattung Corynebacterium gehört.
17.Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Bakterium zur Gattung Nocardia gehört.
18.Verfahren nach Anspruch 1,2, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium die Stämme N-771 oder N-774, die zur Gattung Corynebacterium gehören, oder der Stamm N-775» eier zur Gattung Nocardia gehört, verwendet werden.

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