CS200176B2 - Process for preparing 6-aminopenicilanic acid - Google Patents

Description

Vynález se týká zlepšených enzymových komplexů, a to zejména takových, které se připravují z acylasových enzymů, o kterých je známo, že štěpí amidickou vazbu penicilinů. Tyto enzymy se nazývají penicilín acylasy a jsou použitelné pro přípravu 6-aminopenicilanové kyseliny z penicilinů získaných fermentačním postupem přírodních materiálů, to je při použití enzymu při pH, při kterém dochází k deacylaci (nebo štěpení amiidické skupiny) penicilinu a vzniká požadovaná 6-aminopenicilanová kyselina. Vynález se také týká použití zlepšeného acylasového enzymu pro přípravu 6-amiinopenicilanové kyseliny.

Přestože tyto penicilín acylasy (nebo deacylasy), buď ve formě vázané v buňkách, nebo ve formě bezbuněčné, se používají pro uvedený účel již od roku 1961, vznikají při použití bezbuněčných enzymů obtíže při jejich oddělování z reakční směsi, navíc ve vodě rozpustné enzymy vázané v buňkách se nesnadno používají znovu. Dále oba typy einzyimu produkujícího 6-aminopenicilanovou kyselinu jsou kontaminovány stopovými množstvími bakteriálního proteinu. V britském patentu č. 1 193 918 bylo pro odstranění těchto obtíží navrženo vázat enzymy na polymerní substrát a tím dosáhnout jeho nerozpustnost ve vodě. Avšak tyto poly2 měrní enzymové komplexy mají špatnou mechanickou stabilitu, zejména jestliže se jako substráty použijí polymery obecně obchodně dostupné pro jiné účely. Tyto polymery musí být speciálně vyvinuté a připravené pro uvedený účel, což je nežádoucím způsobem drahé. Navíc, jestliže se б-атгпо'реnicilanová kyselina připravuje působením acylasových enzymů, je nutno kontrolovat pH reakční směsi během reakce v úzkém rozmezí a to vyžaduje kontinuální přidávání alkálií, které neutralizují vznikající karboxylovou kyselinu z uvolněného penicilinového postranního řetězce. Bylo nalezeno, že acylasa přímo kovalentně vázaná na polymerní subšítrát vyžaduje opatrnost při výběru používaného alkalického činidla pro tuto neutralizaci a obvykle používaný hydroxid sodný se nemůže používat, protože dochází k rychlé denaturaci enzymu. Obdobně, jestliže se použije těkavá báze, jako je amoniak nebo triethylamin, vyžaduje to nákladnější modifikace zařízení, než jsou ty, které se běžně používají pro výrobu 6-aminopenicilanové kyseliny při použití nevázané acylasy ve vodě rozpustné formě, neboť při použití nevázaného enzymu nejsou žádné obtíže při použití hydroxidu sodného pro neutralizaci uvolněné kyseliny postranního řetězce.

V německém DOS 2 143 062 byla dále na200176 vržena příprava ve vodě nerozpustné penicilín acylasy adsorpcí na substrát a pak síťováním ve vodě rozpustným dialdehydem za a bez tvorby vazeb mezi polymerním substrátem a enzymem. Při této metodě se enzym převážně síťuje kolem substrátu, než aby se na něj vázal kovalentními vazbami. Ve výše zmíněném patentu jsou popsány různé substráty, například aniontové iontoměničové pryskyřice, to je takové, které obsahují bázické skupiny, jako jsou primární, sekundární nebo terciární aminoskupiny nebo obdobné dusíkaté funkční skupiny, nebo karboxymethylcelulosa, nebo polymery s neutrální reakcí, například takové, které mají funkční skupiny přítomné ve formě esterových skupin.

Bylo· nalezeno, že substráty, které mají negativně nabité funkční skupiny, jsou výhodnější než substráty, které mají positivně nabité funkční skupiny. Například byly provedeny dva pokusy srovnávající celulosu a positivně nebo negativně nabitými skupinami, jako je diethylaminoet-hyl (DEAE) celulosa nebo karboxymethyl [CM] celulosa. Podmínky pro kopulaci penicilín acylasy na každý ze substrátů byly optimalizovány a stejný enzymový roztok byl použit pro kopulaci na každý ze substrátů za těchto optimálních podmínek. Aktivita konečného nerozpustného enzymového preparátu odpovídá 11 °/o a 42 % původní celkové aktivity enzymového roztoku pro DEAE a CM celulosu. Nižší aktivity DEAE celulosy jsou způsobeny špatnou adsorpcí enzymu. Jestliže se pokus opakuje za použití různých enzymových roztoků, jsou výsledky 24 % a 56 % pro DEAE, resp. CM · celulosy. Avšak enzymové komplexy připravené z celulos mají špatnou mechanickou stabilitu, jak bylo uvedeno v D. L. Regan, P. Dunnill a M. D. Lilly „Immobilized Enzyme Reaction Stability: Attrition of the Support Materiál“ in Biotechnology and Bioengineering: Vol. XVI, str. 333—343 (1974).

Dále tyto komplexy připravené absorpční a síťovací technikou, při které je substrátem polymer s neutrální aktivitou, mají nedostatečné charakteristiky reaktivity a opětovného použití. Například stabilita penicilín acylasy adsorbované a síťované na neutrální substrát Amberlit XAD-7 stanovená skladováním znehybnělého enzymového preparátu při teplotě 37 °C je nedostatečná, neboť aktivita klesne po 14denním skladování na 66 %.

Nyní bylo nalezeno, že při použití techniky uvedené ve výše jmenovaném DOS spisu a při použití polymerů nebo kopolymeru methakrylové kyseliny, to je polymerů, které mají karboxylovou kyselinu alifatického typu, mají vznikající enzymové komplexy překvapivě vyšší enzymovou aktivitu, ktprá se nemění při opakovaném použití pro výrobu 6-aminopenicilanové kyseliny. Substráty sestávající z makroporézního nebo gelového typu polymerů styrenu, kyseliny akrylové nebo fenolformaldehydu se sulfonovými, fosforečnými nebo · karboxylovými funkčními skupinami jsou značně horší než makroporézní geloivé polymery a kopolymery ^etakrylové kyseliny. Velmi dobrá stabilita těchto preparátů může být také demonstrována výsledky skladování při 37 °C. Podle jednoho takového pokusu aktivita znehybnělého enzymového preparátu připraveného adsorpcí a síťováním acylasy na makroporézní polymer metak-rylové kyseliny prodávané pod obchodním názvem Amberlit IRC-50, · ztrácí pouze 5 % původní aktivity po 14 · . dnech skladování při 37 °C.

Tyto· enzymové komplexy také vykazují zvýšenou mechanickou stabilitu. Tato zvýšená mechanická stabilita je důležitá z toho důvodu, že reakce se provádí v míchaném reaktoru a míchání se provádí velmi intenzívně, aby se udržovalo stejné pH a alkalická degradace penicilinu byla tak co nejmenší. Dále ve zlepšeném reakčním systému, který byl nyní vyvinut, a při kterém se například nerozpustný enzymový komplex udržuje v reaktoru sítem příslušné velikosti a při kterém po dokončení reakce přípravy 6-aminopenicilanové kyseliny se tato z reakčního prostředí odpustí, zůstává nerozpustný enzymový preparát v reaktoru připravený pro opětovné použití. Tímto způsobem jsou fyzikální ztráty enzymu minimální ve srovnání z postupem, při kterém se veškerá směs z nádoby vypouštěla a nerozpustný enzymový preparát se izoloval filtrací nebo centrifugací a pak znovu vracel do reakční nádoby. Kromě toho docházelo během takového zpracovávání k mikrobiální kontaminaci. Enzymový komplex však · se nesmí mechanicky degradovat, aby tak nedocházelo ke ·ztrátám nebo průchodu síty. Dále, jak bylo ukázáno v prácí Regan Dunnill a Lilly (citace v-ýiše], mají malé · částečky vznikající otěrem ·aminoethyloelulΌsy, ke které je /-gataktosidasa připojena, vyšší specifické aktivity než velké částečky. Ztráty těchto č-ásteček z reaktoru tedy vedou ke větším ztrátám celkové aktivity, než jaká by odpovídala hmotnostnímu úbytku materiálu.

V druhém reaktorovém systému, který · je popsán v belgickém patentu č. 782 646, zůstává nerozpustný enzymový preparát v koloně reaktoru, přes kterou substrát cirkuluje rychlým průtokem tak, aby se udržovalo nutné pH, načež se substrát oddělí od nerozpustného enzymového preparátu. Nosič musí proto mít takové hydraulické vlastnosti, aby se mechanicky nedegradoval při vysokých tlacích nutných pro rychlé průtoky reakční směsi. Každý z těchto reaktorových systémů se může modifikovat tak, že pracuje jako kontinuální reakční systém, při kterém problémy s příslušnou mechanickou stabilitou enzymu a opětovného použití zůstávají zachovány.

Další výhodou použití · polymerů a kopolymerů metakrylové kyseliny spočívají v tom, že tyto pryskyřice vykazují dobrou mecha200176 nickou stabilitu. Jestliže enzymové komplexy z nich připravené mají již tak pokleslou - aktivitu, že již nejsou vhodné pro opětovné použití v reaktoru, pak se pryskyřice může regenerovat odstraněním zbylého enzymu působením horkého alkalického roztoku. Čerstvý enzym se pak může připojit na stejnou pryskyřici. ,

Dále bylo také nalezeno, že při přípravě enzymových komplexů adsorpcí na výše uvedené polymery metakrylové kyseliny nebo odpovídající kopolymery metakrylové kyseliny nebo odpovídající kopolymery a následujícím síťováním některými síťovacími činidly, získá se ve vodě nerozpustný enzymový komplex, který se může použít . pro přípravu 6-aiminopenicilanové kyseliny, aniž by bylo nutno dávat pozor na výběr alkálií nutný pro neutralisací uvolněné kyseliny postranního řetězce. Tak bylo nalezeno, že přestože se jedná o systémy, při kterých enzym je vázán přímo na poiymerní nosič kovalentními vazbami, může se použít pro tento účel hydroxid sodný, což je obvyklé při použití volných, ve vodě rozpustných enzymů. Z tohoto důvodu odpadá nutnost modifikace odpařováku v existujících zařízeních pro použití těkavých alkálií, jako je amoniak nebo triethylamin.

USA patent č. 3 705 084 popisuje adsorpci enzymů na poiymerní povrchy a následující síťování. Polymery a kopolymery metakrylové kyseliny jsou vhodné pro přípravu těchto polymerních povrchů. Tento patent však specifikuje, že poiymerní povrchy musí mít skupiny usnadňující adsorpci, jako Jsou nitrilová skupina (C=Nj, amidoskupina (—CONH2) a ureidoskupina (— NHCONH2) a před použitím těchto polymerů a kopolymerů metakrylové kyseliny se podle tohoto patentu musí karboxylové skupiny těchto polymerů a kopolymerů převést na jednu z těchto specifických adsorpci usnadňujících skupin. Polymery a kopolymery metakrylové kyseliny používané při tomto patentu se odlišují od polymerů a kopolymerů podle předloženého vynálezu právě přítomností těchto specifických adsorpčních skupin. Při specifikaci přítomnosti těchto specifických adsorpčních skupin v USA patentu je uvedeno, že modifikované polymery a kopolymery metakrylové kyseliny tvoří lépe použitelné enzymové komplexy než nemodifikované polymery a kopolymery. USA patent tak uvádí opačné tvrzení, než jak bylo nalezeno podle vynálezu, že acylasy na nemodifikovaných polymerech a kopolymerech metakrylové kyseliny jsou výhodnější.

Pro prokázání výhodnějších vlastností polymerů a kopolymerů metakrylové kyseliny v acylasových enzymových komplexech, byly připraveny komplexy z nylonu a polyurethanu, dva polymery reprezentující výhodné příklady polymerů z USA patentu používající glutanaldehyd jako síťovaní činidlo a jejich aktivita byla srovnána s acylasovým enzymovým komplexem připraveným z Amber lit IRC-50, stejným způsobem. Když se vezme v úvahu různá velikost částeček enzymových komplexů, bylo nalezeno, že komplex Amberlit IRC-50 je 2 až 3krát aktivnější než polyuretanový komplex a jedenáctkrát aktivnější než nylonový komplex. Tyto výsledky Jsou blíže popsány v dále uvedených příkladech.

Adsorpce enzymu na substrát a síťování in šitu je také popsáno v britském patentu č. 1 257 263. Tam však není uveden žádný odkaz na použití penicilín acylas, ani se nepopisuje použití metakrylových polymerů a kopolymerů, jakožto nosičů a ani se neuvádí výhody takto vybraného nosiče a jeho dobré mechanické stability. Tento patent rozšiřuje pojem síťování enzymu kolem nosiče použitím polyfunkčních reakčních činidel jiných než ve vodě rozpustných dialdehydů, například použitím bis-diazo-o-dianisidinu. Obdobně tento pojem podle vynálezu je kromě glutaraldehydu možno rozšířit o použití glyoxalu a formaldehydu jakožto síťovacích činidel.

Vynález se týká způsobu přípravy 6-aminopenicilanové kyseliny reakcí vodného roztoku benzylpenicilinu nebo fenoxymethylpenicilinu nebo jejich solí, udržovaného na hodnotě pH od 6,0 do 9,0 při teplotě 30 až 50 °C s enzymovým komplexem nerozpustným ve vodě sestávajícím z penicilín acylasy adsorbované na substrát polymeru nerozpustného ve vodě a síťovaného síťujícím činidlem vybraným z glutaraldehydu, glyoxalu a formaldehydu, který se vyznačuje -' tím, že se jako poiymerní substrát použije polymer metakrylové kyseliny nebo kopolymer metakrylové kyseliny a divinylbenzenu nerozpustný ve vodě.

Acylasa, s výhodou používaná pro tento účel se připravuje z bakterií, jako jsou Escherichia ' cóli, jestliže se připravuje 6-aminopenicilanová kyselina z benzylpenicilinu nebo například z plísní a actinomycet, jestliže se jako výchozí materiál používá fenoxymeíthylpenicilin.

Enzymatická aktivita deacylasového enzymu se s výhodou stanovuje v poměru k jeho schopnosti produkovat 6-aminopenicilanovou kyselinu z benzylpenicilinu. Tak se aktivita pro deacylasový enzym uvádí jako množství 6-aminopenicilanové kyseliny [uváděné v mikromolech «Μ) připravené z roztoku benzylpenicilinu . při - pH 7,8 - a 37 °C za minutu a na miligramy proteinu obsaženého v enzymu, přičemž obsah proteinu se stanovuje standardní metodou Lowryho. Enzymatická aktivita enzymového komplexu podle předloženého vynálezu se obdobně stanovuje na základě množství 6-aminopenicilanové kyseliny (v μΜ) produkované z benzylpenicilinu. při pH 7,8 a teplotě 37 °C za minutu, ale vztaženo na množství enzymového komplexu v gramech.

Nyní bylo nalezeno, že účinek adsorpční -a síťující reakce a specifická aktivita vzniklého enzymového komplexu nerozpustného ve vodě je lepší, jestliže se zvýší čistota původního enzymu. Avšak, překročí-li se určitý stupeň čistoty, značně klesá zlepšení enzymatické aktivity komplexu ve vztahu к dosaženému stupni čistoty a tak existuje ekonomický limit čistoty enzymu. Tak čistota deacylasového enzymu se běžně pohybuje v rozmezí 0,15 až 50 mikromolů/min/mg proteinu a s výhodou je v rozmezí od 1,5 do 30 mikromolů/min/mg proteinu.

Je proto žádoucí zlepšit čistotu enzymu před adsorpci a síťováním. To je možno dosáhnout zahříváním enzymového roztoku na teplotu asi 50 °C po krátkou dobu, např. 30 minut a/nebo ultrafiltrací. Rovněž tak se mohou použít jiné vhodné čisticí operace, jako je například trakční srážení nebo použití iontoiněničových celulos nebo Sefadexu.

Jako substrát pro použití podle vynálezu jsou vhodné polymery nebo kopolymery methakrylové kyseliny, které obsahují volné karboxylové skupiny, které poskytují polymeru kyselý charakter. Makroporézní polymery a kopolymery methakrylové kyseliny jsou výhodnější než gelové polymery a kopolymery methakrylové kyseliny.

Vyžaduje se, aby methakrylové polymerybyly nerozpustné ve vodě a proto se obvykle používají ve formě síťovaných kopolymerů, například kopolymerů methakrylové kyseliny s divinylbenzenem nebo ve formě diesteru glykolu s methakrylovou kyselinou, například použitím ethylenglykol bis-methakrylátu. Ostatní komonomery, jako jsou estery methakrylátu se mohou rovněž použít při přípravě kopolymerů pro použití podle vynálezu. Jednou z výhod vynálezu je, že dovoluje použití polymerníc-h substrátů, které jsou již obchodními produkty pro Jiné fičely, zejména jako kationtové iontoměničové pryskyřice typu slabých kyselin.

Polymerní substráty pro použití podle vynálezu se s výhodou vyskytují ve formě jemně rozptýlených částeček velikosti, které projdou síty 10 A. S. T. M., to je kde průměr velikosti částečky je pod 2,0 mm. Avšak vzniklý enzymový komplex nesmí být tak jemně rozptýlen, aby se nemohl oddělit a z reakční směsi odfitrovat nebo použít v reakční koloně. Tak polymer by měl mít velikost částeček větší než 0,01 mm, to Je, měl by zůstat na sítech 800 A. S. T. M. Přesný výběr velikosti částeček v tomto rozmezí závisí na typu použitého systému reaktoru.

Acylasa, která se má uvést ve styk s polymerem, má být ve formě vodného roztoku, který se má dialysovat, až iontová vodivost klesne z běžné hodnoty 5 až 10 S. m na 0,1 áž 5 S. m, s výhodou na asi 1 S. m. Hodnota pH enzymového roztoku se má s výhodou pohybovat mezi 4,5 a 7,0 a jsou nutné určité empirické pokusy, při kterých se stanoví optimální hodnota pH tohoto rozmezí, při kterém se dosáhne maximální adsorpce a zůstane zachována enzymatická aktivita. Avšak optimální hodnota se pohybuje běžně mezi pH 5,2 až 6,5. Polymer se uvede ve styk s roztokem enzymu po dobu nutnou pro zajištění maximální enzymatické aktivity, přičemž se tato doba odhaduje mezi 2 až 16 hodinami.

Po adsorpci na substrátu se enzym síťuje in šitu síťujícím činidlem vybraným z glutaraldehydu, glyoxalu a formaldehydu. Použití glutaraldehydu nebo glyoxalu je výhodné, glutaraldehyd zejména poskytuje enzymové komplexy s nejvýhodnějšími vlastnostmi, jestliže se použijí pro přípravu 6-aminopenicilanové kyseliny. Síťující činidla se běžně používají ve vodném roztoku v koncentraci mezi 0,1 a 15 % hmot., s výhodou mezi 0,5 a 5,0 % hmot.

Po dokončení síťující reakce je nutné zajistit, aby veškeré nezreagované síťující činidlo se odstranilo. Například přebytek činidla se může odstranit promytím vodou пето roztoikem aminu a také bylo nalezeno, že pro tyto účely je velmi účinná močovina.

Před použitím pro přípravu 6-a.mino-penicilanové kyseliny se pH enzymového komplexu opatrně upraví tak, aby byl použitelný při této reakci, obvykle se ke konci síťující reakce přidává alkalické činidlo. Hodnota pH se pohybuje v rozmezí od 6,0 do 9,0, obvykle se používá rozmezí od 7,0 do 8,5 a výhodné pH je 7,8. Pro použití se enzymový komplex podle vynálezu uvede ve styk s vodným roztokem benzylpenicilinu nebo fenoxymethylpenicílinu nebo jejich solemi, přičemž roztok má požadované pH. Reakční teplota se běžně udržuje v rozmezí 30 až 50 °C, s výhodou 37 °C. Během reakce uvolňovaná fenyloctová kyselina z benzylpenicilinu a fcnoxyoctová kyselina z fenoxymethylpenicilinu se kontinuálně neutralizují nebo se současnou kontrolou pH reakční směsi udržuje pH v požadovaném rozmezí. Jak bylo uvedeno výše, výběr alkalického činidla pro neutralizaci není rozhodující. Tak se s výhodou používá roztok hydroxidu sodného, i když se případně mohou použít i těkavé aminické báze, jako je amoniak nebo triethylamin.

Enzymové komplexy podle vynálezu jsou často dostatečně stabilní jak mechanicky tak biologicky, tak, že se mohou použít pro provedení alespoň 40 po sobě jdoucích štěpení penicilinu v nekontinuálním reaktoru.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech, ve kterých se používá částečně čištěný preparát acylasy, která byla připravena uvolněním enzymu z buněk acylasu produkujícího kmenu Escherichia coli NC1B 8734 mechanickým způsobem v homogenisátoru.

Zbytky buněk se pak odfiltrují po úpravě na pH 5,0 a enzymový roztok se dále čistí tak, že se dosáhne požadované rozmezí specifické aktivity (to je 1,5 až 30 mikromolů/ /min/img proteinu). Roztok enzymu se pak dialýsuje až se získá vodivost asi 1 S. m.

Příklad 1

Alikvotní díly (20 až 25 g nebo 50 g) obchodně dostupných katexových nebo anexových pryskyřic uvedených níže se suspenduje v destilované vodě (asi 100 až 500 ml) a Upraví se pH tak, že se pohybuje mezi 4,4 a

6,3 v případě katexových pryskyřic a mezí

6,5 a 9,0 v případě anexových pryskyřic přidáním hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové za míchání. Pryskyřice se pak odfiltrují, promyjí dokonale destilovanou vodou a znovu se suspendují v roztoku částečně čištěné penicilín acylasy (60 až 100, 250 nebo 500 ml; specifická aktivita 3,85 až 6,75 μΜ/min/mg proteinu; vodivost 1 S. m a pH upravené na' příslušnou hodnotu. Množství enzymu přidávané k pryskyřici se pohybuje mezi 71 a 308 μΜ/min/g pryskyřice. Enzym se nechá odsorbovat mírným 16 hodinovým mícháním za udržování pH přidáváním titračního činidla, načež se pryskyřice odfiltruje, resuSpenduje v roztoku glu taraldehydu ve vodě (100 ml, 0,825 % až

3,3 % hrnot/obj.) a nechá se reagovat asi 16 hodin za udržování pH přidáváním titračního činidla. Vzniklé komplexy enzymu s pryskyřicí se izolují, promyjí třikrát destilovanou vodou, resuspendují ve vodě nebo 0,2 M roztoku fosfátového pufru pH 7,8, upraví se na> pH 7,8 a nechají se jednu hodinu reagovat s vodným roztokem močoviny (100 ml, 0,1 M pH 7,8), načež se třikrát promyjí destilovanou vodou.

Každý takto připravený enzymový, komplex se použije pro přípravu 6-aminoperncilanové kyseliny, za standardních podmínek při pH 7,8 při teplotě 37 °C. Aktivita enzymového komplexu je uvedena v tabulce 1. Aktivity se vztahují na komplexy připravené při optimálním pH pro enzymovou adsorpci a na zbylou enzymovou aktivitu.

Je třeba , uvést, že výhody vynálezu jsou omezeiny ná případy, kdy substrát je polymerem nebo kopolymerem methakrylové kyseliny.

Tabulka 1 pokus

Typ matrice a funkční skupiny pryskyřice pryskyřice

Fyzikální forma pryskyřice

Specifická aktivita komplexu enzymu a pryskyřice při optimálním pH μΜ/min/g μΜ/mto/g vlhké suché hmotnosti hmotnosti

'a	styren-kvartérní amonium	Amberlite IRA—938	makroporézní	10,4	32,4
b	styren-kvartérní amonium	Amberlite IRA—401	gel	0	0
c	akrylát-kvartérní amonium	Amberlite IRA—458	gel	4,71	10,1
d	styren-polyamin	Lewatit MP62	makroporézní	15,1	30,7
e	styren-polyamin	Amberlite IR—45	gel	2,3	5,8
f	akrylát-polyamin	Amberlite IRA—68	gel	0	0
g	styre-n-SO3H	Lewatit SP 120	makroporézní	19,3	39,2
h	styren-SChH	Lewatit S 100	gel	0	0
1	styren-SO3H	Zerolit 325	gel	0	0
i	styren-SO3H	Amber lit IR—120	gel	0	0
k	fenol-formaldehyd-SO’.H	Blo-Rex 40	gel	4,01	8,3
1	styren-SO3H	Bio-Rad AG(MP)50	makroporézní	9,9	19,8
m	styren-PO 3H2	Bio-Rex 63	gel	0
n	styren-CH2—N’(CH2—COOH)2	Chelex 100	gel	7,16	30,1****)
0	methakrylát-COOH	Amberlite IRC—50	makroporézní	37,0	88,8
P	akrylát-COOH	Amberlite IRC—72	makroporézní	ca. 8,0	ca. 24,9*)
q	akrylát-COOH	Amberlite IRC—84	gel	7,0	13,9

11	12
pokus Typ matrice a funkční	pryskyřice	Fyzikální	Specifická aktivita
skupiny pryskyřice		forma	komplexu enzymu a
		pryskyřice	pryskyřice při optimálním pH
			jiM/min/g	μΜ/min/g -
			vlhké	suché
			hmotnosti	hmotnosti
r akrylát-COOH	Zerolit	gel	ca.	ca.
	236		8,0	17,1*)
s +’ ·) - COOH	Lewatit CHP—80	makroporézní	15,2	36,5
t -рч-соон	Lewatit	makroporézní	0	0
	CHP
, — OH	Zerolit		0	0
u fenol-formaldehyd _COOH	216	gel
—COOH’*’|			25,9	57,0
v methylakrylát _SO3H 1	Zeokarb 227	gel
Tabulka 1 — Poznámky:	Přík	lady 2 · až 5

*) Výsledky jsou velmi proměnlivé, uvedené hodnoty jsou průměry několika stanovení.

**) Struktura polymeru není známa.

***) Pryskyřice není dostupná obchodně. ****) Ok 100 až 200 viz 14,50 ostatních pryskyřic.

Pryskyřice a až c jsou silný anex. Pryskyřice d až f jsou slabý anex. Pryskyřice g až 1 jsou silný katex. Pryskyřice o až u jsou slabý katex.

Tyto příklady objasňují účinek různých stupňů čistoty acylasy během absorpčního stupně. Byl použit postup popsaný v příkladu 1. Enzym se adsorbuje, při pH 5,7 a komplex enzymu a pryskyřice se nechá reagovat s 3,3 % hmot./obj. glutaraldehydu. Použitá pryskyřice byla Amberlit IRC—50 předem promytá alkáliemi a pak kyselinou. Specifické aktivity takto připraveného enzymového· komplexu · jsou uvedeny v tabulce 2 níže. Z výsledků uvedených v tabulce 2 je patrné, že zvýšení čistoty původního enzymu v uvedeném rozmezí zvyšuje specifickou aktivitu enzymového komplexu.

Tabulka 2

Příklad specifická aktivita původního enzymu μΜ/min/mg protein

Aktivita enzymu Specifická aktivita nanášeného na pryskyřici komplexu pryskyřice μΜ/min/g pryskyřice μΜ/min/g vlhké hmotnosti

2	4,64	216	38,1
3	7,87	463	72,0
4	20,5	1160	124,0
5	18,2	586	109,0

Příklady 6 až 15

Důležitost pH, při kterém se enzym adsorbuje na pryskyřici je uvedena v těchto příkladech.

a) Pět alikvotních dílů Amberlitu IRC-50 (50 g) upraví se na pH 4,9; 5,1; 5,3; 5,5 a 5,7, vysuší se a pak se ke každému podílu přidá roztok částečně čištěné penicilín acylasy (95 ml; aktivita 60,9 μΜ/min/ml; 16,8 mg proteinu na ml; vodivost 0,55 S. m; a upravené na konečný objem 200 ml). Po adsorpci 16 hodin při příslušném pH se en zymový komplex nechá reagovat postupem popsaným v příkladu 1 nebo

b) Pět · dalších alikvotních dílů stejné pryskyřice se nechá reagovat stejným způsobem s tou výjimkou, že odsorpční postup se provádí v rozmezí ph 5,7 až 6,5. Enzym použitý pro tyto pryskyřice má následující charakteristiky (105 ml; aktivita · 54,7 μΜ/ /min/ml; 9,03 proteinu/ml; vodivost 0,75 S. m).

Výsledky těchto pokusů jsou · uvedeny v tabulce 3 níže. Tyto výsledky ukazují, že optimální pH pro adsorpční stupeň je od pH 5,2 do 5,8.

Tabulka 3

Příklad	pH	Specifická aktivita enzymového komplexu μΜ/min/g vlhké hmotnosti
6	4,9	30,2
7	5,1	21,2
8	5,3	40.8
9	5,5	49,0
10	5,7	57,2
1.1	5,7	44,4
12	5,9	13,0
13	6,1	8,4
14	6,3	5,6
15	6,5	5.6

Příklady 16 a 17

Tyto příklady objasňují účinek použití stejné pryskyřice avšak různých velikostí částic. Tak byla použita pryskyřice Amberlit IRC—50 pro chromatografií, to- je Amberlit CG—50 typ 1 s velikostí částic, které procházejí síty 100 A. S. Τ. M., avšak zůstávají na sítech 200 A. S. Τ. M. (to je velikosti 0,074 až 0,149 mm).

Na alikvotní podíl (15 g) pryskyřice se nechá adsorbovat enzym (200 ml, 23,7 μΜ./ /min/ml; 3,86 μΜ/min/mg proteinu) při pH

6,3 po dobu tří hodin. Enzymový komplex se izoluje, nechá reagovat s glutaraldehydem (200 ml, 0,825 hmot./obj) po dobu 16 hodin a pak izoluje a promyje postupem popsaným v příkladu 1. Produkt (21 g) má aktivitu

114,5 μΜ/min/g vlhké hmotnosti a byl srovnán s produktem podle příkladu 2, kde Amberlit IRC—50 byl použit o -velikosti částic procházejících síty 14 A. S. T. ML, ale zůstávající na -sítech 50 A. S. Τ. M. (to je s velikostí - částic 0,297 až 1,41). Srovnání ukazuje, že lepší výsledky se dosáhnou při použití pryskyřic -s menší velikostí.

Pokus -se opakuje použitím Amberlitu pro farmaceutické účely, to je Amberlitu IRP—64 s velikostí částic procházející síty 100 A. S. Τ. M., ale zůstávající na sítech 500 A. S. T. M., to jest s velikostí částeček < 0,037 až 0,149 mm. Na pryskyřici -se nechá adsorbovat enzym (3920 μΜ/min/g pryskyřice; -specifická aktivita 17,4 μΜ/min/mg proteinu) při pH 6,3. Enzymový komplex se pak nechá reagovat s glutaraldehydem (3,3 % hmot./ /obj) způsobem popsaným v příkladu 1. Vzniklý komplex enzymu a pryskyřice má specifickou aktivitu 478,4 μΜ/min/g vlhké hmotnosti.

Příklad 18

Hodnota pH pryskyřice Amberlit IRC—50 se upraví na 5,5 buď promytím 0,2 M fosfátovým pufrem stejného pH nebo rozmělněním v destilované vodě a pak přidáním roztoku hydroxidu sodného. Pryskyřice se pak dále promyje destilovanou vodou, až není patrná změna ve vodivosti vody.

Vlhká pryskyřice (100 g) se pak přidá k penicilín acylase aktivity 5,25 ,«M/min/mg proteinu v 500 ml 0,02 M fosfátovém - pufru pH 5,5 a směs se pak míchá 20 hodin při teplotě místnosti. Pevný podíl se- odfiltruje, resuspenduje v 500 ml 0,25 % hmot./obj. glutaraldehydu -rozpuštěného ve fosfátovém roztoku a směs se míchá dalších 20 hodin při teplotě místnosti. Vzniklý enzymový komplex se pak odfiltruje a promyje 0,2 - M fosfátovým pufrem pH 7,8 až se pryskyřice ekvilibruje na toto pH.

Takto připravený enzymový komplex (15 gramů) -se pak použije pro štěpení 200 ml 6,25 % hmot./obj vodného roztoku benzylpenicilinu v 0,02 M fosfátovém pufru -pH 7,8, které -se - provádí dvě hodiny -při 37 °C.

Bylo nalezeno, že enzymový komplex se může izolovat zpět a znovu použít a že jeho mechanická a biologická stabilita byla zachována i když komplex byl znovu použit alespoň 25krát.

Příklad 19

Tento příklad objasňuje použití enzymového komplexu podle vynálezu při přípravě 6-aminopenicilanové kyseliny ve - velkém a jeho vynikající opětovnou použitelnost za těchto podmínek.

Enzymový komplex se připraví - použitím Amberlitu IRC—50. Komplex má aktivitu

26,3 μΜ/min/g a použije se pro štěpení 40 litrů roztoku benzylpenicilinu koncentrace

6,5 % -hmot./obj v 0,02 M fosfátovém pufru. Enzymový komplex je umístěn v nádobě - uzavřený v drátěném sítu. Tak se může po dokončení reakce roztok 6-aminopenicilanové kyseliny - odfiltrovat, komplex promýt vodou a reakce -se může znovu opakovat. Průměrný účinek konverse 6-aminopenicilanové kyseliny v 50 po sobě následujících stupních po 6 hodinách je 95 °/o.

Příklad 20

Tento· příklad objasňuje mechanickou -stabilitu enzymového komplexu podle vynálezu připravenou a popsanou v příkladu 1 z Amberlitu IRC 50 ve srovnání s obdobným, ale . 16 neutrálním polymerním substrátem; jmenovitě XAD-7, který je síťový akrylátový ester.

Vzorky každého enzymového komplexu (1,6 kg] se suspendují v 8 litrech 0,2 M fosfátového pufru při pH 7,8 a 37 °C a každá směs se míchá 72 h. při 200 ot/mln ve fermentačním tanku s přepážkami. Vzorky se odebírají v 4 hodin, intervalech a vizuálně se sleduje rozpad pryskyřičných částeček. Rozpad u XAD—7 je signifikantně větší než u IRC—50 a to asi tak, že rozpad IRC—50 po 64 hodinách je stejný jako u XAD—7 po 8 hodinách. Toto jasně dokazuje větší mechanickou odolnost pryskyřice IRC—50.

Příklad 21

Amberlit IRC—50 (235 g, 39,4 μΜ/min/g] připraveného postupem popsaným v příkladu 1 se použije pro štěpení 6,25 % hmot./ /obj benzylpenicilinu G v sérii 10 po sobě jdoucích pokusech. Každý pokus byl prováděn použitím 1 litru draselné soli benzylpenicilinu G po dobu 2½ hodiny při teplotě 37 °C a pH 7,8. Amberlit IRC—50 se odfiltruje po každém pokusu a promyje se destilovanou vodou. Filtrát a promývací roztoky se zahustí na rotační vakuové odparce, koncentrát se smísí se stejnými objemy methylisobutylketonu, ochladí se na 4 až 10 °C a nakonec se okyselí, aby se vysrážela 6-aminopenicilanová kyselina. 6-aminopenicilanová kyselina se promyje malým množstvím destilované vody, propláchne se acetonem a vysuší v sušárně. Průměrný výtěžek 6-aminopenicllanové kyseliny z deseti pokusů je 91,3 %.

Příklad 22

Adsorpce acylasy na urethanem povlečený polyethylen

Polyethylenové částečky s nízkou hustotou (< 400 μη) se protáhnou urethanovým polymerem a nechají se 10 dnů vysušit. Materiál se pak promývá jednu hodinu 20 % vodným acetonem (obj/obj), dokonale promyje vodou a na alikvotní podíly (5 g) se nechá adsorbovat enzym (125 ml, 54,0 μΜ/min/ml, 3,80 μΜ/min/mg proteinu] po dobu pět hodin v rozmezí pH 4,8 až 9,0. Částečky povlečené urethanem se odfiltrují, zpracují s glutaraddehydem (75 ml, 3,3% hmot./obj) po dobu 3 hodin a pak se ekvilibrují na pH 7,8 postupem popsaným v příkladu 1.

Přestože urethanem povlečené částečky mají v průměru menší velikost než IRC—50 je takto získaná aktivita 2 až 3krát menší než aktivita získaná použitím IRC—50

	pH	aktivita vlhká hmotnost μΜ/mín/g
	4,8	11,3 .
	5,2	14,0
	5,6	16,4
	6,0	13,2
	6,4	13,6
	7,0	12,3
	7,5	7,8
	8,0	10,0
	8,5	9,0
	9,0	12,2

Příklad 23

Adsorpce acylasy na nylon

Orgolacq (práškovaný nylon 6, průměr < 30 μΐη) se jednu hodinu promývá 65 % hmot./obj kyseliny mravenčí a pak se dokonale propláchne destilovanou vodou. Alikvotní podíly (10 g) se použijí pro adsorpci enzymu (100 ml, 50,9 μΜ/min/ml, 4,7 μΜ/ Zmln/mg proteinu] po dobu 16 hodin v rozmezí pH 4,8—9,0. Práškovaný nylon se pak odfiltruje, nechá se tři hodiny reagovat s glutaraldehydem (100 ml 3,3% hmot./obj) izoluje se a promyje postupem popsaným v příkladu 1. Nejvyšší získaná aktivita (pH 4,8) byla 41,7 μΜ/min/g vlhké hmotnosti, která je srovnatelná s typickým preparátem IRC—50. Avšak, jestliže se vezme v úvahu velikost částeček nylonu a IRC—50, je IRC—50 daleko lepší. IRP 64 (Farmaceutický IRC 50, velikost částeček 0,037 až 0,149 milimetrů se může nechat reagovat s acylasou za vzniku preparátu specifické aktivity 478 μΜ/min/g vlhké hmotnosti, což je aktivita llkrát větší než aktivita nylonového preparátu.

pH	aktivita vlhká hmotnost μΜ/mln/g
4,8	41,7
5,2	36,1
5,6	26,9
6,0	22,2
6,4	15,7
7,0	17,6
7,5	17,6
8,0	21,3
8,5	15,7
9,0	9,3

PŘEDMĚT VYNALEZU

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Způsob přípravy 6-aminopenicilanové kyseliny reakcí vodného roztoku benzylpenicilinu neibo fenoxymethylpenicilinu nebo jejich solí, udržovaného na hodnotě pH od 6,0 do 9,0 při teplotě 30 až 50 °C, s enzymovým komplexem nerozpustným ve vodě sestávajícím z penicilín acylasy adsorbované na substrát polymeru nerozpustného ve vodě a síťovaného síťujícím činidlem vybíraným z glutaraldehydu, glyoxalu a formaldehydu, vyznačený tím, že se jako polymerní sub strát použije polymer metakrylové kyseliny nebo, kopolymer metakrylové kyseliny a divinylbenzenu nerozpustný ve vodě.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se jako substrát použije kopolymer metakrylové kyseliny a dlvinylbenzenu.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se jako substrát použije iontoměničové pryskyřice sestávající z kopolymeru metakrylové kyseliny a divinylbenzenu.

   Severografia, n. p., závod 7, Most