JPH0246197B2

JPH0246197B2 - Koteikakosooyobisonoseizoho

Info

Publication number: JPH0246197B2
Application number: JP17179782A
Authority: JP
Inventors: Kobei Kobayashi; Takayasu Sonoyama
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1982-09-29
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1990-10-15
Anticipated expiration: 2002-09-29
Also published as: JPS5959191A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、固定化酵素及びその製造方法に係
る。

不溶化ないし固定化した酵素を用いて酵素反応
を行うことは、数多くの利点を有し、すでに種々
の分野で実用化されている。このうち、酵素固定
化のための担体として多孔質のイオン交換樹脂を
用いるものは、これを充填したカラムに原料を含
む溶液を流通または循環させる反応態様におい
て、担体に適度な粒径および物理的強度（耐破
損・摩耗）のものが選べる。これにより、充分な
カラム流速が採用可能で圧力損失の少ない装置を
設計・構成することができ工業的規模での実用化
に適している。

こうした多孔質のイオン交換樹脂を用いて酵素
を固定化するには、物理的（非特異的）吸着性、
イオン結合法のほか、二官能性試薬を用いて担体
と酵素との間をそれぞれ共有結合によつて架橋す
る方法などがある。このうち、物理的吸着性およ
びイオン結合法は、固定化後の酵素反応において
酵素の溶離を防ぐことが困難であり適当でない。
一方、二官能性試薬による架橋法は酵素の溶離は
防止できるが、抑いる試薬の性質によつて下記の
ような欠点・困難を生じる。

(1) グルタルアルデヒドのようなジアルデヒドを
用いた場合、自身の重合により複雑な網目構造
を形成し、その中に酵素が埋没して活性が発現
されないことがある。また、担体とジアルデヒ
ドおよびジアルデヒドと酵素に２ケ所はいずれ
もシツフ塩基で結合されるため化学的な不安定
性がある。

(2) ジイソシアナートを用いた場合、末端のイソ
シアナート基は水とも反応するため、水溶液と
して供給される酵素とのカツプリング反応にお
いて酵素濃度が薄いと酵素との多点結合が不充
分となり、固定化酵素としての安定性に欠ける
ことがある。

本発明者らは、上記の欠点を克服し困難を解消
する目的で種々探究の結果、ジイソシアナートお
よびヒドロキシベンズアルデヒドを用いて固定化
操作を行つた場合、反応生成物中にジイソシアナ
ートの一方のイソシアナート基が担体のアミノ基
と他方のイソシアナート基がヒドロキシベンズア
ルデヒドのヒドロキシ基とそれぞれ結合し、その
末端アルデヒド基が酵素のアミノ基と結合したも
のが生成し得ることを発見し、こうしたものが前
記ジアルデヒドおよびジイソシアナートの両者の
欠点を同時に克服し得るものであることを確認し
て本発明を完成した。すなわち、本発明によれ
ば、ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニ
ルベンゼン共重合体多孔質イオン交換樹脂担体に
ジイソシアナートおよびヒドロキシベンズアルデ
ヒドによつて酵素を結合したことを特徴とする固
定化酵素、および上記担体をジイソシアナートお
よびヒドロキシベンズアルデヒドを用いて処理し
たのち、形成された末端活性基に酵素を結合させ
ることを特徴とする固定化酵素の製造方法が提供
される。

本発明において固定化に使用する担体は、スチ
レン／ジビニルベンゼン共重合体を母核として、
交換基にポリアミンを導入した多孔質のイオン交
換樹脂であり、該当する市販品を使用するのがよ
い。この担体の孔径分布は、通常の蛋白質が浸透
できる範囲（100〜1500Å）であればいかなるも
のであつてもよい。

また、粒子径は100〜1000μの範囲にあること
が好ましい。さらに交換基ポリアミンとしてはい
かなるポリアミンであつてもよいが、例えば−
NH（C₂H₄NH）_oC₂H₄NH₂を用いる場合、ｎの数
は特に制限はないが１〜10の範囲にあることが望
ましい。好適な担体としては、三菱化成工業(株)よ
りダイヤイオンCR−20の商品名のもとに市販さ
れているものが挙げられる。

上記ヒドロキシベンズアルデヒドは、好ましく
はｐ−またｍ−ヒドロキシベンズアルデヒドであ
り、ベンゼン核のその他の位置に非官能置換基を
有するものであつてもよい。また、ジイソシアナ
ートは、アルキレンジイソシアナートを意味し、
好ましくはヘキサメチレンジイソシアナートであ
るが、この他芳香族のジイソシアナートたとえ
ば、４，4′−ジフエニルメタンジイソシアナー
ト、トルエン−２，４−ジイソシアナートなどが
挙げられる。これらを用いて担体を活性化する
際、担体にジイソシアナートを先に反応させたの
ち、ヒドロキシベンズアルデヒドを反応させる順
次的な方法を採つても、両者を同時に反応させて
もよい。通常、担体を有機溶媒（例えばジメチル
ホルムアミド）で洗浄したのち、同溶媒中で反応
を行い、次に、この活性化された担体に酵素を水
溶液中で共有結合させる。このとき大部分の酵素
はアルデヒド基に結合されるが、一部は残存して
いるイソシアナート基に結合される。

本発明によつて固定化することのできる酵素と
しては、ペニシリンアシラーゼ、ペニシリナー
ゼ、トリプシン、リボヌクレアーゼなどの工業的
に繁用の酵素を挙げることができるが、本発明の
実施態様は、これらの酵素に関してのみ限定され
るものではない。

このようにして得られた固定化酵素は、その担
体の性質からわかるように充分な物理的強度を大
きな有効表面積を有し、工業的規模での実用化に
適したものである。すなわち、本発明の固定化酵
素は、かなり手荒く取扱つても破損・摩耗が少な
い。したがつて、反応液中での混合・撹拌あるい
は反応液を高速で流通させるといつた操作に長時
間耐えうるものである。また、本発明の固定化酵
素を使用することにより、占有空間に対比して処
理能力の大きな装置を採用して反応を行うことが
できる。

一方、架橋基自体が交叉結合することが少な
く、担体に対して酵素を可及的に多くの点で共有
結合させることができるため、担体当りの酵素活
性が高い。また、非特異的吸着が少なく、形成さ
れるシツフ塩基も、一架橋基に対して１ケ所に限
られるから化学的に安定で、活性低下の速度が低
い。ちなみに、グルタルアルデヒドのみを使用
し、他の条件をほぼ同一にしてペニシリンアシラ
ーゼを固定化した酵素を例にとり、比較試験を行
つた結果、本発明の固定化酵素は約1.5倍に半減
期（繰返し使用可能回数）を示した。

本発明の固定化酵素は、通常、これをタンクの
内に入れ、原料物質の水溶液と混合・撹拌する回
分式の反応態様でも使用できるが、固定化酵素を
カラムに充填して、原料物質の水溶液を貯槽とカ
ラムとの間で循環させる方式の反応態様で使用す
るのに適している。原料物質の水溶液中には通常
酵素反応を結果生ずる副成物を除去または中和す
る物質、あるいは緩衝剤を加え酵素活性を最適の
状態に維持することが望ましい。たとえばペニシ
リンアシラーゼを用いて、ペニシリンＧから６−
アミノペニシラン酸（６−APA）を得る場合は
反応の進行中連続的に水酸化アルカリを補給して
反応液のPH値を一定に維持する。そして、この補
給が不要となる時点を反応の終点とする。

また循環流速は毎時、反応溶液の10〜50倍とす
る。担体はこうした高流速でカラム液が流下して
も、圧力損失があまり生じないように選ばれてい
るため、カラムの設計には特別の工夫はいらな
い。ペニシリンアシラーゼを例にとつた場合、こ
の循環反応は通常ペニシリンの95％以上が６−
APAに転換されるまで続け、反応は10時間以内
で終了する。反応終点は上記水酸化アルカリの所
要量が減少し、ほとんど要しなくなる点である。
また反応温度は20〜40℃の間で、ペニシリンの濃
度は３〜15wt％の範囲で使用するのがよい。

こうして得た反応終了液から、６−APAをと
り出すためには、反応終了液中のカルボン酸（ペ
ニシリンＧであるとき、カルボン酸はフエニル酢
酸となる）および残存しているペニシリンを抽出
により除いたのち、６−APAを晶析してもよい
が、反応終了液から６−APAを直接とり出す方
法も用いられる。後者の場合、反応終了液と適当
な溶媒（メタノール、エタノールなど）とを混合
し、６−APA等電点沈澱させることにより得ら
れる。

以下、実施例および参考例によつて本発明をよ
り詳細に説明する。

実施例１担体の活性化 (1) ダイヤイオンCR−20（商品名、三菱化成工業
(株)製）をジメチルホルムアミドで充分洗浄し水
分を除去した。この担体50g（湿重量）を１，
６−ジイソシアナートヘキサン50ml／ジメチル
ホルムアミド300mlに加え、室温で２時間撹拌
した。反応後担体を取し、ｐ−ヒドロキシベ
ンズアルデヒド10g／ジメチルホルムアミド
200mlを加え、さらに室温で２時間反応する。
反応終了後、担体を同溶媒でよく洗浄し活性化
CR−20(1)を得た。

(2) 上記(1)で使用したｐ−ヒドロキシベンズアル
デヒドに代え、ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒ
ドを用い、その他は全く同様の操作によつて活
性化CR−20(2)を得た。

(3) 上記(1)で用いた、洗浄・脱水済のCR−20担
体4.63g（湿重量）にｐ−ヒドロキシベンズアル
デヒド0.722g／ジメチルホルムアミド20mlを加
え、同時に１，６−ジイソシアナートヘキサン
１mlを加え８℃で１時間撹拌した。反応後担体
を取し、同溶媒で充分洗浄し活性化CR−20
(3)を得た。

実施例２ペニシリンアシラーゼの固定化実施例１(1)で得た活性化CR−20(1)50g（湿重量）
を後記参考例に従つて調製したペニシリンアシラ
ーゼ溶液250mlおよび0.1Mホウ酸緩衝液（PH８）
250ml中に分散させ、室温で約４時間反応させた。
反応終了後担体を取し、0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）および0.5MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）で順次洗浄し、固定化ペニシリンアシラ
ーゼを得た。（湿潤担体の活性、43U／ｇ、ただ
し1Uを28℃、PH7.5において１分間に1μモルの６
−APAを生成する酵素量とする、以下同じ）。

同様な操作を実施例１(2)で得た活性化CR−20
(2)に施して得た固定化ペニシリンアシラーゼの湿
潤担体活性は40U／ｇであつた。

また、実施例１(3)で得た活性化CR−20 1g（湿
重量）に上記ペニシリンアシラーゼ溶液５mlおよ
び0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.0）５mlを加え、室温
で約３時間反応させたのち同様の処理を経て得た
固定化ペニシリンアシラーゼ1g（湿重量）の活性
は45Uであつた。

参考例１ペニシリンアシラーゼ溶液の調製バチルス・メガテリウム・ATCC14945をグル
コース0.1％、コース・ステイープ・リカー0.5
％、総合アミノ酸粉末（味の素(株)製）0.5％、リ
ン酸−カリウム0.15％およびNaCl0.25％の組成の
培地で28℃、３日間培養して得た遠沈上澄液から
酵素をセライト（ジヨーンズ・マンビル・セール
ズ社製、No.545）に吸着させ、これの溶離・透析
を行うことによつてペニシリンアシラーゼ部分精
製酵素液（20U／ml）を得た。

参考例２６−アミノペニシラン酸の生成 (1) 活性化CR−20(1)を用い、実施例２に従つて
調製した固定化ペニシリンアシラーゼ26g（湿
重量）をカラム（内径2.5×8.5cm）に充填し、
これにペニシリンＧカリウム溶液（ペニシリン
Ｇカリウム10gを0.02Mリン酸緩衝液（PH8.0、
0.3mMのCaCl₂を含む）140mlに溶解し、PH8.5
に調節したもの）を50ml／分で流し、熱交換器
を用いて反応液を28℃に調節した。カラム流出
液は、PHが下がつて出てくるため反応液貯槽内
で1.5N水酸化ナトリウムを用いてPH8.4〜９に
調節した。この操作を３時間継続して水酸化ナ
トリウムの添加をほとんど要しなくなつた時点
を反応の終点とした。この反応液及びカラムの
洗浄液185mlに当量のメタノールを加え、10℃
まで冷却、6N塩酸でPH4.3まで低下させた。こ
の液を冷蔵庫で一夜熟成し、析出した結晶を
取し、メタノール洗浄、乾燥して６−APAの
結晶5.01g（収率86％、純度99％）を得た。この
反応を100回くり返したところ、固定化ペニシ
リンアシラーゼの活性は、初発活性の約80％を
保持しており、６−APAの収率及び純度の低
下は認められなかつた。

(2) 活性化CR−20(2)を用い調製した固定化ペニ
シリンアシラーゼ20g（湿重量）をカラム（内
径2.5×6.5cm）に充填し、ペニシリンＧカリウ
ム溶液（ペニシリンＧカリウム8.0gを0.02Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0、0.3mMCaCl₂含有）114ml
に溶解し、PH8.5に調節）を40ml／分で流し、
前記１記載の操作と同様の操作を行つたとこ
ろ、６−APAの結晶4.1gを得た。（収率88％、
純度98％）この反応を10回くり返したが、収率、純度の
低下はみられなかつた。

(3) 活性化CR−20(3)を用い調製した固定化ペニシリンアシラーゼ20g（湿重量）
をカラム（内径2.5×6.5cm）に充填し前記(2)記
載の操作と同様の操作を行つたところ６−
APAの結晶4.0gを得た。（収率86％、純度98
％）実施例３リボヌクレアーゼの固定化実施例１(3)に従つて得た活性化CR−20(3)1g（湿
重量）に、リボヌクレアーゼ５mg（牛膵臓起源・
ウオージントン・バイオケム社製）／0.1Mホウ
酸緩衝液（PH8.5）10mlを室温、３時間反応させ
て固定化リボヌクレアーゼを得た。この固定化酵
素1g（湿重量）当りの活性は、13Uであつた。こ
こで1Uとは、RNA（パン酵母）を分解して、25
℃、PH５において260nmの吸光値と1.0／分で増
加させる酵素量を示す。

実施例４トリプシンの固定化実施例１(3)に従つて得た活性化CR−20(3)1g（湿
重量）にトリプシン（牛膵臓起源、生化学工業(株)
製）５mg／0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.5、
0.2MNaCl含有）10mlを室温・３時間反応させて
固定化トリプシンを得た。この固定化酵素1g（湿
重量）当りの活性は11Uであつた。ここで1Uと
はNa−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエス
テルルを25℃、PH８において1μモル／分で加水
分解する酵素量を示す。（ただし、トリプシン１
mgは68Uに相当する。）実施例５ペニシリナーゼの固定化実施例１(3)に従つて得た活性化CR−20(3)1g（湿
重量）にペニシリナーゼ（カルビオケム社製）20
mg／0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.5）10mlを室温、２
時間反応させて固定化ペニシリナーゼを得た。こ
の固定化酵素1g（湿重量）当りの活性は10Uであ
つた。ここで1Uとは、ペニシリンＧカリウムを、
25℃、PH7.5において1μモル／分で分解する酵素
活性を示す。

比較例本発明の固定化酵素と、従来の二官能性試薬
（ジアルデヒドおよびジイソシアナート）を用い
て製造された固定化酵素の安定性を比較するた
め、以下の実験を行なつた。

(1) 本発明の固定化酵素実施例１(1)で製造された活性化担体に、実施
例２に記載の方法で、ペニシリンアシラーゼを
固定化したものを用いた。

(2) ジアルデヒド法による固定化酵素よく水洗した10g（湿重量）のダイヤイオン
CR−20（商品名、三菱化成工業(株)製）に、40ml
の0.1Mホウ酸緩衝液（PH7.5）および40mlの25
％グルタルアルデヒドを加え、氷水浴上で20分
撹拌した。その担体を濾取し、0.1Mホウ酸緩
衝液（PH7.5）で充分洗浄したものを活性化担
体とし、実施例２と同様な方法で、ペニシリン
アシラーゼを固定化した。固定化酵素の活性は
担体1g（湿重量）あたり43Uであつた。

(3) ジイソシアナート法による固定化酵素ジメチルホルムアミドでよく洗浄した10g
（湿重量）のダイヤイオンCR−20（前出）に、
33mlのジメチルホルムアミドおよび７mlのジイ
ソシアナートヘキサンを加え、28℃で２時間撹
拌した。この担体を濾取し、ジメチルホルムア
ミドで充分洗浄したものを活性化担体とし、実
施例２と同様な方法で、ペニシリンアシラーゼ
を固定化した。固定化酵素の活性は担体1g（湿
重量）あたり41Uであつた。

参考例２の方法に従い、上記の固定化酵素をペ
ニシリンＧカリウムと反応させ、６−アミノペニ
シラン酸を製造した。但し、固定化酵素はそれぞ
れ10g（湿重量）、ペニシリンＧカリウムは4gとし
た。

この反応を、60〜140回繰り返し、反応速度／
初回反応速度を指標として、それぞれの固定化酵
素の安定性を比較した。初回反応時間は３時間で
あつた。結果を第１図に示す。

第１図から明らかなように、ジイソシアナート
法では反応回数が60回を越えると初発活性の50％
以下となり、ジアルデヒド法では反応回数が60回
を越えると初発活性の80％以下となる。これに対
して本発明の固定化酵素を用いた場合、反応回数
が60回を越えても初発活性のほぼ90％を保持して
おり、さらに、140回反応させても初発活性の80
％以上を保持していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の固定化酵素と従来法による固
定化酵素の安定性についての比較実験結果を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】１ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニ
ルベンゼン共重合体多孔質イオン交換樹脂担体
に、ジイソシアナートおよびヒドロキシベンズア
ルデヒドによつて酵素を結合したことを特徴とす
る固定化酵素。２ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニ
ルベンゼン共重合体多孔質イオン交換樹脂担体
を、ジイソシアナートおよびヒドロキシベンズア
ルデヒドを用いて処理したのち、形成された末端
活性基に酵素を結合させることを特徴とする固定
化酵素の製造方法。