JPS5959191A - 固定化酵素及びその製造法 - Google Patents
固定化酵素及びその製造法Info
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- JPS5959191A JPS5959191A JP17179782A JP17179782A JPS5959191A JP S5959191 A JPS5959191 A JP S5959191A JP 17179782 A JP17179782 A JP 17179782A JP 17179782 A JP17179782 A JP 17179782A JP S5959191 A JPS5959191 A JP S5959191A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
不溶化ないし固定化した酵素を用いて酵素反応を行うこ
とは，数多くの利点を有し，すでに種々の分野で実用化
されている。このうち、酵素固定化のための担体として
多孔質のイオン交換樹脂を用いるものは，これを充填し
たカラムに原料を含む溶液を流通または循環させる反応
態様において。
とは，数多くの利点を有し，すでに種々の分野で実用化
されている。このうち、酵素固定化のための担体として
多孔質のイオン交換樹脂を用いるものは，これを充填し
たカラムに原料を含む溶液を流通または循環させる反応
態様において。
担体に適度な粒径および物理的強度（耐破損・摩耗）の
ものが選べる。これにより、充分なカラム流速が採用可
能で圧力損失の少ない装置を設計・構成することができ
工業的規模での実用化に適している。
ものが選べる。これにより、充分なカラム流速が採用可
能で圧力損失の少ない装置を設計・構成することができ
工業的規模での実用化に適している。
こうした多孔質のイオン交換樹脂を用いて酵素を固定化
するには，物理的（非特異的）吸着法。
するには，物理的（非特異的）吸着法。
イオン結合法のほか，二官能性試薬を用いて担体と酵素
との間をそれぞれ共有結合によって架橋する方法などが
ある。このうち、物理的吸着法およびイオン結合法は，
固定化後の酵素反応において酵素の溶離を防ぐことが困
難であり適当でない。
との間をそれぞれ共有結合によって架橋する方法などが
ある。このうち、物理的吸着法およびイオン結合法は，
固定化後の酵素反応において酵素の溶離を防ぐことが困
難であり適当でない。
一方，二官能性試薬による架橋法は酵素の溶離は防止で
きるが，用いる試薬の性質によって下記のような欠点・
困難を生じる。
きるが，用いる試薬の性質によって下記のような欠点・
困難を生じる。
（１） グルタルアルデヒドのようなジアルデヒドを
用いた場合，自身の重合により複雑な網目構造を形成し
、その中に酵素が埋没して活性が発現されないことがあ
る。また、担体とジアルデヒドおよびジアルデヒドと酵
素の２ケ所はいずれもシッフ塩基で結合されるため化学
的な不安定性がある。
用いた場合，自身の重合により複雑な網目構造を形成し
、その中に酵素が埋没して活性が発現されないことがあ
る。また、担体とジアルデヒドおよびジアルデヒドと酵
素の２ケ所はいずれもシッフ塩基で結合されるため化学
的な不安定性がある。
（２） ジイソシアナートを用いた場合、末端のイソ
シアナート基は水とも反応するため、水溶液として供給
される酵素とのカップリング反応において酵素濃度が薄
いと酵素との多点結合が不充分となり、固定化酵素とし
ての安定性に欠けることがある。
シアナート基は水とも反応するため、水溶液として供給
される酵素とのカップリング反応において酵素濃度が薄
いと酵素との多点結合が不充分となり、固定化酵素とし
ての安定性に欠けることがある。
本発明者らは、上記の欠点を克服し困難を解消する目的
で種々探究の結果、ジイソシアナートおよびヒドロキシ
ベンズアルデヒドを用いて固定化操作を行った場合９反
応生成物中にジイソシアナートの一方のイソシアナート
基が担体のアミノ基と他方のイソシアナート基がヒドロ
キシベンズアルデヒドのヒドロキシ基とそれぞれ結合し
、その末端アルデヒド基が酵素のアミノ基と結合したも
のが生成し得ることを発見し、こうしたものが前記ジア
ルデヒドおよびジイソシアナートの両者の一？− 欠点を同時に克服し得るものであることを確認して本発
明を完成した。すなわち９本発明によれば。
で種々探究の結果、ジイソシアナートおよびヒドロキシ
ベンズアルデヒドを用いて固定化操作を行った場合９反
応生成物中にジイソシアナートの一方のイソシアナート
基が担体のアミノ基と他方のイソシアナート基がヒドロ
キシベンズアルデヒドのヒドロキシ基とそれぞれ結合し
、その末端アルデヒド基が酵素のアミノ基と結合したも
のが生成し得ることを発見し、こうしたものが前記ジア
ルデヒドおよびジイソシアナートの両者の一？− 欠点を同時に克服し得るものであることを確認して本発
明を完成した。すなわち９本発明によれば。
ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニルベンゼン
共重合体多孔質イオン交換樹脂担体にジイソシアナート
およびヒドロキシベンズアルデヒドによって酵素を結合
したことを特徴とする固定化酵素、および上記担体をジ
イソシアナートおよびヒドロキシベンズアルデヒドを用
いて処理したのち、形成された末端活性基に酵素を結合
させることを特徴とする固定化酵素の製造方法が提供さ
れる。
共重合体多孔質イオン交換樹脂担体にジイソシアナート
およびヒドロキシベンズアルデヒドによって酵素を結合
したことを特徴とする固定化酵素、および上記担体をジ
イソシアナートおよびヒドロキシベンズアルデヒドを用
いて処理したのち、形成された末端活性基に酵素を結合
させることを特徴とする固定化酵素の製造方法が提供さ
れる。
本発明において固定化に使用する担体は、スチレン／ジ
ビニルベンゼン共重合体を母核として。
ビニルベンゼン共重合体を母核として。
交換基にポリアミンを導入した多孔質のイオン交換樹脂
であり、該当する市販品を使用するのがよい。この担体
の孔径分布は９通常の蛋白質が浸透できる範囲（／θ０
−／３θθＸ）であればいかなるものであってもよい。
であり、該当する市販品を使用するのがよい。この担体
の孔径分布は９通常の蛋白質が浸透できる範囲（／θ０
−／３θθＸ）であればいかなるものであってもよい。
また９粒子径は／θＯ〜ｌθＯθμの範囲にあることが
好ましい。さらに交換基ポリアミンとしではいかなるポ
リアミンであってもよいが９例えば−ＮＨ（Ｃ，２ＨＩ
１．ＮＨ）ｎＣ２Ｈ４ＬＮＨユを用いる場合、ｎの数は
特に制限はないが７〜ｌθの範囲にあることが望ましい
。好適な担体としては、三菱化成工業（株）よりダイヤ
イオンＣＲ−，ｌθの商品名のもとに市販されているも
のが挙げられる。
好ましい。さらに交換基ポリアミンとしではいかなるポ
リアミンであってもよいが９例えば−ＮＨ（Ｃ，２ＨＩ
１．ＮＨ）ｎＣ２Ｈ４ＬＮＨユを用いる場合、ｎの数は
特に制限はないが７〜ｌθの範囲にあることが望ましい
。好適な担体としては、三菱化成工業（株）よりダイヤ
イオンＣＲ−，ｌθの商品名のもとに市販されているも
のが挙げられる。
はｐ−またはｍ−ヒドロキへアルデヒドであり。
ベンゼン核のその他の位置に非官能置換基を有するもの
であってもよい。また、ジイソシアナートは、アルキレ
ンジイソシアナートを意味し、好ましくはへキサメチレ
ンジイソシアナートであるが。
であってもよい。また、ジイソシアナートは、アルキレ
ンジイソシアナートを意味し、好ましくはへキサメチレ
ンジイソシアナートであるが。
この他芳香族のジイソシアナートたとえば、ｌＡｐ’−
ジフェニルメタンジイソシアナート、トルエン−２，’
Ｉ−ジイソシアナートなどが挙げられる。これらを用い
て担体を活性化する際、担体にジイソシアナートを先に
反応させたのち、ヒドロキシベンズアルデヒドを反応さ
せる順次的な方法を採っても９両者を同時に反応させて
もよい。通常、担体Ｆ有機溶媒（例えばジメチルホルム
アミド）で洗−ψ− 浄したのち、同溶媒中で反応を行い９次に、この活性化
された担体に酵素を水溶液中で共有結合させる。このと
き大部分の酵素はアルデヒド基に結合されるが、一部は
残存しているイソシアナート基に結合される。
ジフェニルメタンジイソシアナート、トルエン−２，’
Ｉ−ジイソシアナートなどが挙げられる。これらを用い
て担体を活性化する際、担体にジイソシアナートを先に
反応させたのち、ヒドロキシベンズアルデヒドを反応さ
せる順次的な方法を採っても９両者を同時に反応させて
もよい。通常、担体Ｆ有機溶媒（例えばジメチルホルム
アミド）で洗−ψ− 浄したのち、同溶媒中で反応を行い９次に、この活性化
された担体に酵素を水溶液中で共有結合させる。このと
き大部分の酵素はアルデヒド基に結合されるが、一部は
残存しているイソシアナート基に結合される。
本発明によって固定化することのできる酵素としては、
ペニシリンアシラーゼ、ペニシリナーゼ。
ペニシリンアシラーゼ、ペニシリナーゼ。
トリプシン、リボヌクレアーゼなどの工業的に繁用の酵
素を挙げることができるが９本発明の実施態様は、これ
らの酵素に関してのみ限定されるものではない。
素を挙げることができるが９本発明の実施態様は、これ
らの酵素に関してのみ限定されるものではない。
このようにして得られた固定化酵素は、その担体の性質
かられかるように充分な物理的強度と大きな有効表面積
を有し、工業的規模での実用化に適したものである。す
なわち９本発明の固定化酵素は、かなり手荒く取扱って
も破損・摩耗が少ない。したがって９反応液中での混合
・攪拌あるいは反応液を高速で流通させるといった操作
に長時間耐えうるものである。また９本発明の固定化酵
素を使用することにより、占有空間に対比して処理能力
の大きな装置を採用して反応を行うことができる。
かられかるように充分な物理的強度と大きな有効表面積
を有し、工業的規模での実用化に適したものである。す
なわち９本発明の固定化酵素は、かなり手荒く取扱って
も破損・摩耗が少ない。したがって９反応液中での混合
・攪拌あるいは反応液を高速で流通させるといった操作
に長時間耐えうるものである。また９本発明の固定化酵
素を使用することにより、占有空間に対比して処理能力
の大きな装置を採用して反応を行うことができる。
一方、架橋基自体が交叉結合することが少なく。
担体に対して酵素を可及的に多くの点で共有結合させる
ことができるため、担体当りの酵素活性が高い。また、
非特異的吸着が少なく、形成されるシッフ塩基も、−架
橋基に対して／ケ所に限られるから化学的に安定で、活
性低下の速度が低い。
ことができるため、担体当りの酵素活性が高い。また、
非特異的吸着が少なく、形成されるシッフ塩基も、−架
橋基に対して／ケ所に限られるから化学的に安定で、活
性低下の速度が低い。
ちなみに、グルタルアルデヒドのみを使用し、他の条件
をほぼ同一にしてペニシリンアシラーゼを固定化した酵
素を例にとり、比較試験を行った結果２本発明の固定化
酵素は約ｌｊ倍の半減期（繰返し使用可能回数）を示し
た。
をほぼ同一にしてペニシリンアシラーゼを固定化した酵
素を例にとり、比較試験を行った結果２本発明の固定化
酵素は約ｌｊ倍の半減期（繰返し使用可能回数）を示し
た。
本発明の固定化酵素は９通常、これをタンクの内に入れ
、原料物質の水溶液と混合・攪拌する回分式の反応態様
でも使用できるが、固定化酵素をカラムに充填して、原
料物質の水溶液を貯槽とカラムとの間で循環させる方式
の反応態様で使用するのに適している。原料物質の水溶
液中には通常酵素反応の結果中ずる副成物を除去または
中和する物質、あるいは緩衝剤を加え酵素活性を最適の
状態に維持することが望ましい。たとえばペニシリンア
シラーゼ′を用いて、ペニシリンＧから乙−アミノペニ
シラン酸（乙−ＡＰＡ ）を得る場合は反応の進行中連
続的に水酸化アルカリを補給して反応液のｐＨ値を一定
に維持する。そして、この補給が不要となる時点を反応
の終点とする。
、原料物質の水溶液と混合・攪拌する回分式の反応態様
でも使用できるが、固定化酵素をカラムに充填して、原
料物質の水溶液を貯槽とカラムとの間で循環させる方式
の反応態様で使用するのに適している。原料物質の水溶
液中には通常酵素反応の結果中ずる副成物を除去または
中和する物質、あるいは緩衝剤を加え酵素活性を最適の
状態に維持することが望ましい。たとえばペニシリンア
シラーゼ′を用いて、ペニシリンＧから乙−アミノペニ
シラン酸（乙−ＡＰＡ ）を得る場合は反応の進行中連
続的に水酸化アルカリを補給して反応液のｐＨ値を一定
に維持する。そして、この補給が不要となる時点を反応
の終点とする。
′また循環流速は毎時９反応溶液の７０〜５０倍とする
。担体はこうした高流速でカラム液が流下しても、圧力
損失があまり生じないように選ばれているため、カラム
の設計には特別の工夫はいらない。ペニシリンアシラー
ゼを例にとった場合。
。担体はこうした高流速でカラム液が流下しても、圧力
損失があまり生じないように選ばれているため、カラム
の設計には特別の工夫はいらない。ペニシリンアシラー
ゼを例にとった場合。
この循環反応は通常ペニシリンの９５係以上が計ＡＰＡ
に転換されるまで続け９反応は７０時間以内で終了する
。反応終点は上記水酸化アルカリの所要量が減少し、は
とんど要しなくなる点である。
に転換されるまで続け９反応は７０時間以内で終了する
。反応終点は上記水酸化アルカリの所要量が減少し、は
とんど要しなくなる点である。
また反応温度はユθ〜ｊθ°Ｃの間で、ペニシリンの濃
度は３〜／ ３ ｗｔ ％の範囲で使用するのがよい。
度は３〜／ ３ ｗｔ ％の範囲で使用するのがよい。
こうして得た反応終了液から、乙−ＡＰＡをとり出すた
めには９反応終了液中のカルボン酸（ベニ７− シリンＧであるとき、カルボン酸はフェニル酢酸となる
）および残存しているペニシリンを抽出により除いたの
ち、乙−ＡＰＡを晶析してもよいが。
めには９反応終了液中のカルボン酸（ベニ７− シリンＧであるとき、カルボン酸はフェニル酢酸となる
）および残存しているペニシリンを抽出により除いたの
ち、乙−ＡＰＡを晶析してもよいが。
反応終了液から乙−ＡＰＡを直接とり出す方法も用いら
れる。後者の場合９反応終了液と適当な溶媒（メタノー
ル、エタノールなど）とを混合し、乙−ＡＰＡを等電点
沈澱させることにより得られる。
れる。後者の場合９反応終了液と適当な溶媒（メタノー
ル、エタノールなど）とを混合し、乙−ＡＰＡを等電点
沈澱させることにより得られる。
以下、実施例および参考例によって本発明をより詳細に
説明する。
説明する。
実施例／ 担体の活性化
（１）ダイヤイオンＣＲ−，，ｌ、θ（商品名、三菱化
成工業（株）製）をジメチルホルムアミドで充分洗浄し
水分を除去した。この担体夕θｇ（湿重量）を２乙−ジ
イソシアナートヘキサン！；Ｏｍｌ／ジメチルホルムア
ミド３θθ耐に加え、室温で２時間攪拌した。反応後担
体を戸数し、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１０９／
ジメチルホルムアミド２θθｙｎｌを加え、さらに室温
で２時間反応する。
成工業（株）製）をジメチルホルムアミドで充分洗浄し
水分を除去した。この担体夕θｇ（湿重量）を２乙−ジ
イソシアナートヘキサン！；Ｏｍｌ／ジメチルホルムア
ミド３θθ耐に加え、室温で２時間攪拌した。反応後担
体を戸数し、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１０９／
ジメチルホルムアミド２θθｙｎｌを加え、さらに室温
で２時間反応する。
反応終了後、担体を同溶媒でよく洗浄し活性化ＣＲ−λ
θ（１）を得た。
θ（１）を得た。
４−
（２）上記（１）で使用したｐ−ヒドロキシベンズアル
デヒドに代え２ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒドを用い
、その他は全く同様の操作によって活性化ＣＲ−，ｌθ
（２）を得た。
デヒドに代え２ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒドを用い
、その他は全く同様の操作によって活性化ＣＲ−，ｌθ
（２）を得た。
（３）上記（１）で用いた。洗浄・脱水法のＣＲ−２，
０担体弘６３９Ｃ湿重量）にＰ−ヒドロキシベンズアル
デヒド０７２２１１／ジメチルホルムアミドλθｍｌを
加え、同時にｌ乙−ジイソシアナ＝トヘキサン／ ｔｎ
ｌを加えざ°Ｃで１時間攪拌した。反応後担体を戸数し
、同溶媒で充分洗浄し活性化ＣＲ−２θ（３）を得た。
０担体弘６３９Ｃ湿重量）にＰ−ヒドロキシベンズアル
デヒド０７２２１１／ジメチルホルムアミドλθｍｌを
加え、同時にｌ乙−ジイソシアナ＝トヘキサン／ ｔｎ
ｌを加えざ°Ｃで１時間攪拌した。反応後担体を戸数し
、同溶媒で充分洗浄し活性化ＣＲ−２θ（３）を得た。
実施例２ ペニシリンアシラーゼの固定化実施例／（１
）で得た活性化ＣＲ−，２０（１）ｊθｇ（湿重量）を
後記参考例に従って調製したペニシリンアシラーゼ溶液
２ｊθｔｓｌおよびθ／Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨＪ’）’
、２ｊθｍｌ中に分散させ、室温で約グ時間反応させた
。反応終了後担体を戸数し、０／Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
ｊ）およびθｊＭＮａｃｌ含有θ７Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７５）で順次洗浄し。
）で得た活性化ＣＲ−，２０（１）ｊθｇ（湿重量）を
後記参考例に従って調製したペニシリンアシラーゼ溶液
２ｊθｔｓｌおよびθ／Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨＪ’）’
、２ｊθｍｌ中に分散させ、室温で約グ時間反応させた
。反応終了後担体を戸数し、０／Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
ｊ）およびθｊＭＮａｃｌ含有θ７Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７５）で順次洗浄し。
固定化ペニシリンアシラーゼを得た。（湿潤担体の活性
、グ３Ｕ／’Ｊ 、ただし／Ｕを２ざ°Ｃ、ｐｌ（７Ｊ
において７分間に７ｇモルの乙−ＡＰＡを生成する酵素
量とする。以下同じ）。
、グ３Ｕ／’Ｊ 、ただし／Ｕを２ざ°Ｃ、ｐｌ（７Ｊ
において７分間に７ｇモルの乙−ＡＰＡを生成する酵素
量とする。以下同じ）。
同様な操作を実施例／（２）で得た活性化ＣＲ−２０（
２）に施して得た固定化ペニシリンアシラーゼの湿潤担
体活性はグθＵ／ｆ！であった。
２）に施して得た固定化ペニシリンアシラーゼの湿潤担
体活性はグθＵ／ｆ！であった。
また、実施例／（３）で得た活性化ＣＲ−，ｌθ ｌｙ
（ｍ重量）に上記ペニシリンアシラーゼ溶液ｊｍｅおよ
び０ｌＭホウ酸緩衝液（ｐＴ（＆θ） ３ ｍｌを加え
、室温で約３時間反応させたのち同様の処理を経て得た
固定化ペニシリンアシラーゼ／Ｉ（湿重量）の活性は４
ｔｊＵであった。
（ｍ重量）に上記ペニシリンアシラーゼ溶液ｊｍｅおよ
び０ｌＭホウ酸緩衝液（ｐＴ（＆θ） ３ ｍｌを加え
、室温で約３時間反応させたのち同様の処理を経て得た
固定化ペニシリンアシラーゼ／Ｉ（湿重量）の活性は４
ｔｊＵであった。
参考例／ ペニシリンアシラーゼ溶液の調製バチルス・
メガテリウム・ＡＴＣＣ／１ｌ−９１Ｉｊをグルコース
θ／チ、コース・ステイープ・リカーθ５チ、総合アミ
ノ酸粉末（味の素（株）製）０３係、リン酸−カリウム
０７３％およびＮａＣ１θ２ｊ％の組成の培地で２ｇ°
Ｃ，３日間培養して得た遠沈上澄液から酵素をセライト
（ジョーンズ・マンビル・セールズ社製、Ｎａｊ！ｊ）
に吸着させ、これの溶離・透析を行うことによってペニ
シリンアシラーゼ部分精製酵素液（２θＵ／ｍ／）を得
た。
メガテリウム・ＡＴＣＣ／１ｌ−９１Ｉｊをグルコース
θ／チ、コース・ステイープ・リカーθ５チ、総合アミ
ノ酸粉末（味の素（株）製）０３係、リン酸−カリウム
０７３％およびＮａＣ１θ２ｊ％の組成の培地で２ｇ°
Ｃ，３日間培養して得た遠沈上澄液から酵素をセライト
（ジョーンズ・マンビル・セールズ社製、Ｎａｊ！ｊ）
に吸着させ、これの溶離・透析を行うことによってペニ
シリンアシラーゼ部分精製酵素液（２θＵ／ｍ／）を得
た。
参考例２ 乙−アミノペニシラン酸の生成（１）活性
化ＣＲ−，２０（１）を用い、実施例２に従っテ調製し
た固定化ペニシリンアシラーゼ２乙ｇ（湿重量）をカラ
ム（内径氾、３；ｘｌ！；ｔｙｎ）に充填し。
化ＣＲ−，２０（１）を用い、実施例２に従っテ調製し
た固定化ペニシリンアシラーゼ２乙ｇ（湿重量）をカラ
ム（内径氾、３；ｘｌ！；ｔｙｎ）に充填し。
これにペニシリンＧカリウム溶液・（ペニシリンＧカリ
ウム／θｇを００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＆θ。
ウム／θｇを００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＆θ。
（）、 ３ｍＭ ノＣａＣ１，２を含む）ｙｌｌ−θｒ
ａｔに溶解し、 ｐＴ（１３に調節したもの）を５０ｍ
１１分で流し、熱交換器を用いて反応液を２ｆ’Ｃに調
節した。カラム流出液は、ｐＨが下がって出てくるため
反応液貯槽内でｉ３Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐｌ（
、ｙｌｌ、〜２に調節した。この操作を３時間継続して
水酸化ナトリウムの添加をほとんど要しなくなった時点
を反応の終点とした。この反応液及びカラムの洗浄ｆｉ
／１３ｍ１に等量のメタノールを加え、／θ°ｃまで冷
却、６Ｎ塩酸でｐＨｌＡ３まで低下させた。この液を冷
蔵庫で一夜熟成し、析出した結晶を戸数し。
ａｔに溶解し、 ｐＴ（１３に調節したもの）を５０ｍ
１１分で流し、熱交換器を用いて反応液を２ｆ’Ｃに調
節した。カラム流出液は、ｐＨが下がって出てくるため
反応液貯槽内でｉ３Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐｌ（
、ｙｌｌ、〜２に調節した。この操作を３時間継続して
水酸化ナトリウムの添加をほとんど要しなくなった時点
を反応の終点とした。この反応液及びカラムの洗浄ｆｉ
／１３ｍ１に等量のメタノールを加え、／θ°ｃまで冷
却、６Ｎ塩酸でｐＨｌＡ３まで低下させた。この液を冷
蔵庫で一夜熟成し、析出した結晶を戸数し。
−／／−
メタノールで洗浄、乾燥してｇ−ＡＰＡの結晶よθ／（
ＩＣ収率ざ乙係、純度９９チ）を得た。この反応を７０
０回くり返したところ、固定化ペニシリンアシラーゼの
活性は、初発活性の約にθ係を保持しており、乙−ＡＰ
Ａの収率及び純度の低下は認められなかった。
ＩＣ収率ざ乙係、純度９９チ）を得た。この反応を７０
０回くり返したところ、固定化ペニシリンアシラーゼの
活性は、初発活性の約にθ係を保持しており、乙−ＡＰ
Ａの収率及び純度の低下は認められなかった。
（２）活性化ＣＲ−，ｌθ（２）を用い調製した固定化
ペニシリンアシラーゼスθｇ（湿重量）をカラム（内径
２．！；ｘ乙ｊｆｆ）に充填し、ペニシリンＧカリウム
溶液（ペニシリンＧカリウムとθｇを００２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ，！ｒ、θ、θ３ｍＭＣａＣ１，２含有）ｙ
ｌｌ１．ｍｔに溶解し、 ｐＨざｊに調節）を弘θ耐／
分で流し、前記（１）記載の操作と同様の操作を行った
ところ、乙−ＡＰＡの結晶’Ａ／ｇを得た。（収率１＃
襲、純度？ざチ） この反応を７０回くり返したが、収率、純度の低下はみ
られなかった。
ペニシリンアシラーゼスθｇ（湿重量）をカラム（内径
２．！；ｘ乙ｊｆｆ）に充填し、ペニシリンＧカリウム
溶液（ペニシリンＧカリウムとθｇを００２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ，！ｒ、θ、θ３ｍＭＣａＣ１，２含有）ｙ
ｌｌ１．ｍｔに溶解し、 ｐＨざｊに調節）を弘θ耐／
分で流し、前記（１）記載の操作と同様の操作を行った
ところ、乙−ＡＰＡの結晶’Ａ／ｇを得た。（収率１＃
襲、純度？ざチ） この反応を７０回くり返したが、収率、純度の低下はみ
られなかった。
（３）活性化ＣＲ−２０＜３）を用い調製した固定化ペ
ニシリンアシラーゼ２θｇ（湿重量）をカラム（内径λ
Ｊ、Ｘ乙、５ｚ）に充填し前記（２）記１２− 載の操作と同様の操作を行ったところｇ−ＡＰＡの結晶
ｔθｇを得た。（収率ｇ乙チ、純度’ｉｉ’ｆ％）実施
例３ リボヌクレアーゼの固定化 実施例１（３）に従って得た活性化ＣＲ−，：ｌθ（３
）７ｇ（湿重量）に、リボヌクレアーゼｓｑ（牛膵臓起
源・ウオージントン・バイオケム社製）１０１酵素／ｆ
ｃ湿重量）当りの活性は、／３Ｕであった。ここで／Ｕ
とは、ＲＮＡ（パン酵母）を分解して、 、２ ｔ′ｃ
、 ｐｌにおいてλ乙θｎｍの吸光値を７０７分で増
加させる酵素量を示す。
ニシリンアシラーゼ２θｇ（湿重量）をカラム（内径λ
Ｊ、Ｘ乙、５ｚ）に充填し前記（２）記１２− 載の操作と同様の操作を行ったところｇ−ＡＰＡの結晶
ｔθｇを得た。（収率ｇ乙チ、純度’ｉｉ’ｆ％）実施
例３ リボヌクレアーゼの固定化 実施例１（３）に従って得た活性化ＣＲ−，：ｌθ（３
）７ｇ（湿重量）に、リボヌクレアーゼｓｑ（牛膵臓起
源・ウオージントン・バイオケム社製）１０１酵素／ｆ
ｃ湿重量）当りの活性は、／３Ｕであった。ここで／Ｕ
とは、ＲＮＡ（パン酵母）を分解して、 、２ ｔ′ｃ
、 ｐｌにおいてλ乙θｎｍの吸光値を７０７分で増
加させる酵素量を示す。
実施例１ トリプシンの固定化
実施例１（３）に従って得た活性化ＣＲ−，ｌθ（３）
１ｇ（湿重量）にトリプシン（牛膵臓起源、生化学工業
（株）製）！；Ｑ１０／Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨとｊ。
１ｇ（湿重量）にトリプシン（牛膵臓起源、生化学工業
（株）製）！；Ｑ１０／Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨとｊ。
（２２ＭＮａＣ１含有）／θｍｌを室温・３時間反応さ
せて固定化トリプシンを得た。この固定化酵素／ｇ（湿
重量）当りの活性は／／Ｕであった。ここで／Ｕ、とは
Ｎａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルを２
！；°Ｃ，ｐＨざにおいて／μモル／分で加水分解する
酵素量を示す。（ただし、トリプシン／ ｍ９は乙ざＵ
に相当する。）実施例ｊ ペニシリナーゼの固定化 実施例／（３）に従って得た活性化ＣＲ−λθ（３）７
ｇＣ１ｆｌ、重量）にペニシリナーゼ（カルビオケム社
製）２θ〜／θ／Ｍホウ酸緩衝液（１）Ｈ，ｆ、５−）
／θｍｌを室温、２時間反応させて固定化ペニシリナー
ゼを得た。この固定化酵素／ｇ（湿重量）当りの活性は
／θＵであった。ここで／Ｕとは、ペニシリンＧカリウ
ムを、、２．ｆ’Ｃ，ｐＨ７，！；において／μモル／
分で分解する酵素活性を示す。
せて固定化トリプシンを得た。この固定化酵素／ｇ（湿
重量）当りの活性は／／Ｕであった。ここで／Ｕ、とは
Ｎａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルを２
！；°Ｃ，ｐＨざにおいて／μモル／分で加水分解する
酵素量を示す。（ただし、トリプシン／ ｍ９は乙ざＵ
に相当する。）実施例ｊ ペニシリナーゼの固定化 実施例／（３）に従って得た活性化ＣＲ−λθ（３）７
ｇＣ１ｆｌ、重量）にペニシリナーゼ（カルビオケム社
製）２θ〜／θ／Ｍホウ酸緩衝液（１）Ｈ，ｆ、５−）
／θｍｌを室温、２時間反応させて固定化ペニシリナー
ゼを得た。この固定化酵素／ｇ（湿重量）当りの活性は
／θＵであった。ここで／Ｕとは、ペニシリンＧカリウ
ムを、、２．ｆ’Ｃ，ｐＨ７，！；において／μモル／
分で分解する酵素活性を示す。
−／ｊ−
５３９−
Claims (2)
- （１） ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニ
ルベンゼン共重合体多孔質イオン交換樹脂担体に、ジイ
ソシアナートおよびヒドロキシベンズアルデヒドによっ
て酵素を結合したことを特徴とする固定化酵素。 - （２） ポリアミン交換基を有するスチレン／ジビニ
ルベンゼン共重合体多孔質イオン交換樹脂担体を、ジイ
ソシアナートおよびヒドロキシベンズアルデヒドを用い
て処理したのち、形成された末端活性基に酵素を結合さ
せることを特徴とする固定化酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17179782A JPH0246197B2 (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | Koteikakosooyobisonoseizoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17179782A JPH0246197B2 (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | Koteikakosooyobisonoseizoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5959191A true JPS5959191A (ja) | 1984-04-04 |
| JPH0246197B2 JPH0246197B2 (ja) | 1990-10-15 |
Family
ID=15929873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17179782A Expired - Lifetime JPH0246197B2 (ja) | 1982-09-29 | 1982-09-29 | Koteikakosooyobisonoseizoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0246197B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2546234A (en) * | 2015-10-18 | 2017-07-19 | Zhong Qiyun | Enzyme cross-linking immobilisation on polyamide |
-
1982
- 1982-09-29 JP JP17179782A patent/JPH0246197B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2546234A (en) * | 2015-10-18 | 2017-07-19 | Zhong Qiyun | Enzyme cross-linking immobilisation on polyamide |
| GB2546234B (en) * | 2015-10-18 | 2020-05-27 | Zhong Qiyun | Immobilisation of Lysozyme and Glucose Oxidase on a Polyamide Surface Using a Peptide Spacer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0246197B2 (ja) | 1990-10-15 |
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