JPS5838152B2 - 水に不溶性酵素錯体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良酵素錯体、特にペニシリンのアミド結合を
裂開することが知られているアシラーゼ酵素から製造し
た酵素錯体に関する。

この種の酵素を本明細書ではペニシリンアシラーゼと呼
ぶ。

ペニシリンアシラーゼは天然産物質の醗酵法によって得
られるペニシリンから６−アミノペニシラン酸を製造す
るのに有用である。

すなわちペニシリンの脱アシル化またはアミド基の裂開
が起って目的とする６−アミノペニシラン酸が生成スる
ようなｐＨ条件下で酵素を使用する。

本発明はまた６一アミノペニシラン酸（以下６−ＡＰＡ
と呼ぶ）の製造に改良アシラーゼ酵素を使用することに
関する。

従って本発明によれば、メタクリル酸の水に不溶性ポリ
マーまたはコポリマーよりなる水に不溶性ポリマー基材
に吸着させ、グルタルアルデヒド，グリオキサールおよ
びホルムアルデヒドから選んだ架橋剤で交差結合させた
ペニシリンアシラーゼ酵素よりなる水に不溶性酵素錯体
が得られる。

本発明によればさらに，ペニシリンアシラーゼ酵素をメ
タクリル酸の水に不溶性ポリマーまたはコポリマーに吸
着させてから、グルタルアルデヒド、グリオキサールお
よびホルムアルデヒドから選んだ架橋剤と処理すること
よりなる，本発明の水に不溶性酵素錯体の調製法が得ら
れる。

本発明によれば，ベンジルペニシリンまたはフエノキシ
メチルペニシリンまたはその塩をｐＨ ６． ０〜９．
０の水溶液中で本発明による水に不溶性酵素錯体と処理
することにより，６−アミノペニシラン酸を製造するこ
とができる。

本発明に使用するアシラーゼ酵素は好ましくは、ベンジ
ルペニシリンから６−ＡＰＡを製造するときには大腸菌
の菌株のような細菌から，あるいはフエノキシメチルペ
ニシリンを出発原料として使用するときにはたとえば菌
類および放線菌類から得られる。

デアシラーゼ酵素の酵素活性はベンジルペニシリンから
６−ＡＰＡを製造する能力に関連してきめると便利であ
る。

従って本明細書ではデアシラーゼ酵素の活性は、ロウ’
） （Ｌｏｗｒｙ）の標準法で定量した酵素中のタン
パク質含有量１１ｒＩ９あたり１分間あたり、ｐＨ７．
８．３７℃でベンジルペニシリン溶液から生成する６−
ＡＰＡの量をミクロモルμＭとして記録した。

本発明の酵素錯体の酵素活性も同様にｐＨ７．８，３７
℃でペンシルペニシリンから１分間あたり生成する６−
ＡＰＡのμＭで表わした量を基準として測定したが、こ
の場合はｇで表わした酵素錯体の重量を基準にした。

発明者は最初に使用される酵素の純度が高いほど吸着お
よび交差結合反応の効率も、また生成する水に不溶性酵
素錯体の比活性度も向上することを知った。

しかしながらある純度を越えると、純度をある量だけ増
加したことによって得られるこれらの向上率が著しく低
下するので、酵素に望まれる純度に対しては経済的な限
界がある。

従ってデアシラーゼ酵素の純度はタンパク質含有量１ｍ
９に対して通常０．１５〜５０ミクロモル／分５ さら
に好都合には１３５〜３０ミクロモル／分である。

従って吸着および交差結合を実施する前に酵素純度を前
述の範囲内に向上させることが望ましい。

このことは酵素溶液を約５０℃で短時間たとえば３０分
間加熱することおよび（または）限外ろ過によって達成
することができる。

酵素の精製に通常使用されている他の方法たとえば分別
沈殿またはイオン交換セルロース類またはセファデツク
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）で処理する方法も使用できる。

本発明に使用される基材はメタクリル酸のポリマーまた
はコポリマーである。

従ってポリマーは酸性機能を付与する遊離力ルボキシル
基を含有する。

メタクリル酸のマクロ気孔性ポリマーおよびコポリマー
がメタクリル酸のゲル状ポリマーおよびコポリマーより
すぐれている。

メタクリル酸ポリマーは水に不溶性でなければならない
ので、通常交差結合したコポリマーの形，たとえばメタ
クリル酸とジビニルベンゼンとのコポリマー，たとえば
エチレングリコールビスメタクリレートを使用すること
によるメタクリル酸とグリコールとのジエステルのコポ
リマーである。

メタクリル酸エステルのような他のモノマーも本発明に
使用するコポリマーの製造に使用することができる。

本発明の利点のひとつは、他の目的，特に弱酸性カチオ
ン交換樹脂として、既に市販製品となっているポリマー
基材を使用できることである。

特に好適なものは米国のローム．アンド．ハース社から
アンバライｌ−ＩＲＣ−５０という商標名で発売されて
いるメタクリル酸とジビニルベンゼンとのコポリマーお
よび英国のパームナット社からゼオカルブ（Ｚｅｏｋａ
ｒｂ） ２ ２ ７という商標名で以前に発売されてい
たメタクリル酸コポリマーである。

ゼオカルブ２２７はある量のベンゼンスルホニル基も含
有するジビニルベンゼンとメタクリル酸とのコポリマー
である。

本発明に使用されるポリマー基材は好ましくはＡＳＴＭ
の１００メツシふるいを通過する粒度すなわち粒径０．
１ ｍｍ以下の微粒子またはビード状のものである。

しかしながら生或した酵素錯体は金網を使用するろ過法
によって反応混合物から分離できないほど、あるいはカ
ラム状反応器で使用できないほど微粉砕されていてはな
らない。

従ってポリマー基材は０．０１ｍｍ以上の粒度を持たな
ければならない。

すなわちＡＳＴＭ８００メツシふるいに実質的に全量と
どまらなければならない。

この範囲内で粒度をどのように選択するかは、使用され
る反応器の方式の性質によってきまる。

ポリマー基材と接触させようとするアシラーゼ酵素は水
溶液であり、そのイオン伝導度が通常の５〜１０ミリモ
ー（ｍ．ｍｈｏｓ）から０．１〜５ミリモー，好ましく
は約１ミリモーに低下するまで透析したものである。

酵素溶液のｐＨは好ましくは４．５〜７． ０とすべき
であり、酵素の吸着および保留酵素活性を最高にしよう
とすれば，ある程度実験をおこなってこの範囲内での最
適ｐＨ値をきめなければならない。

しかしながらこの最適値は通常５．２〜６．５である。

ポリマー基材は酵素溶液と、酵素の最高吸着が確保でき
るだけの期間接触させなければならない。

この滞留時間は通常２〜１６時間である。

酵素を基材に吸着させてから、酵素をグルタルアルデヒ
ド．グリオキサールおよびホルムアルデヒドから選んだ
架橋剤と吸着された状態で処理することによって交差結
合させる。

グルタルアルデヒドまたはグリオキサールを使用するこ
とが好ましく、特にグルタルアルデヒドは６一ＡＰＡの
製造に使用するとき最も有利な性質の酵素錯体を生じる
。

通常架橋剤は濃ｉｏ．ｉ〜１５重量％、好ましくは０．
５〜５．０重量％の濃度の水溶液にして使用される。

交差結合反応が終ってから、反応しなかった架橋剤があ
ればこれを除去するか、反応性をなくすることを確実に
おこなうことが望ましい。

たとえば過剰の架橋剤を水またはアミン化合物の溶液で
洗浄することによって除去することができ、この目的に
尿素が非常に効果的であることがわかった。

６−ＡＰＡを製造するのに使用する前に酵素錯体のｐＨ
は通常交差結合反応の終りにアルカリを添加することに
よって，６−ＡＰＡの製造法に使用されるべさｐＨ値に
慎重に調節しなければならない。

このｐＨ値は６．０〜９．０、通常好ましくは７． ０
〜８．５，さらに好ましくは７，８である。

このようなｐＨを使用するために、本発明の酵素錯体は
所定のｐＨに保たれたベンジルペニシリンまたはフエノ
キシメチルペニシリンまたはその塩の水溶液と接触させ
る。

反応温度は通常３０〜５０℃好ましくは３７℃に保たれ
る。

反応中ベンジルペニシリンからはフエニル酢酸が、また
フエノキシメチルペニシリンからはフエノキシ酢酸が遊
離するので、これらの酸は反応混合物のｐＨを所定の範
囲内に調節するために，連続的または間欠的に中和され
る。

前述の如く、この中和に使用するアルカリを何にするか
は重要でないように思われる。

従って場合によってはアンモニアまたはトリエチルアミ
ンのような揮発性アミン塩基を使用することができるが
，水酸化ナトリウムが最も簡易に使用される。

本発明の水に不溶性酵素錯体は機械的にもまた生物学的
にも充分に安定なことが多く、回分式反応器で少なくと
も４０回連続してペニシリンの裂開に使用できる。

次に本発明を次の実施例によって説明する。

これらの実施例で犬腸菌ＮＣＩＢ８７３４のアシラーゼ
生産菌株の細胞をホモジナイザー中で機械的方法によっ
て酵素を遊離することによって調製したアシラーゼ酵素
の部分精製製剤を使用した。

細胞の残留物のｐＨを５．０に調節してからろ過によっ
て除去し、酵素溶液を必要に応じてさらに精製して比活
性度を所要範囲，すなわちタンパク質１ｒｎ９に対して
１．５〜３０ミクロンモル／分とした。

次に酵素溶液をその伝導度が約１ミリモーになるまで透
析した。

実施例 １ 後述のような市販のカチオンおよびアニオン交換樹脂２
０〜２５ｇまたは５０ｇを蒸留水約１００〜５００７７
１ｌに懸濁し、カチオン交換樹脂の場合にはそのｐＨ値
を４．４〜６．３に、またアニオン交換樹脂の場合には
そのｐＨ値を６．５〜９．０に激しくかきまぜながら水
酸化ナトリウムまたは塩酸を加えることによって調節す
る。

樹脂をろ過によって回収し、蒸留水でよく洗い，タンパ
ク質１■に対して比活性度３．８５〜６．７５／／Ｍ／
分、該当するｐＨ値に調節したときの伝導度１ミリモー
以下の部分精製ペニシリンアシラーゼの溶液６０〜１０
０ＴＬｌ、２５０ｍｌまたは５００ｍｌに再懸濁する。

樹脂に加えた酵素の量は樹脂１ｇに対して７１〜３０８
μＭ／分である。

酵素は滴定剤を加えてｐＨを所定値に保ちながら静かに
約１６時間かきまぜて樹脂に吸着させてから、ろ過によ
って樹脂を回収し、水にとかしたグルタルアルデヒドの
０．８２５〜３．３％（ｗ／ｖ）溶液１００ｌ７１ｌに
再懸濁し、滴定剤を加えてｐＨを所定値に保ちながら約
１６時間反応させる。

生成した酵素一樹脂錯体を回収し，蒸留水で３回洗浄し
、水またはｐＨ ７． ８の０． ２ Ｍ ＩＪン酸塩
緩衝液に再懸濁し、ｐＨを７．８に調節し、ｐＨ ７．
８の尿素の０． １ Ｍ水溶液１００ｍｌと１時間処
理し，最後に３回蒸留水で洗浄する。

このようにして調製した各酵素錯体を使用してｐＨ ７
． ８および３７℃の標準条件でベンジルペニシリンか
ら６−ＡＰＡを製造した。

酵素錯体の活性度を第１表に示す。

活性度は酵素の吸着および酵素活性を保持するのに最適
なｐＨで調製した錯体に対するものである。

表中ビオーレツクス（Ｂｉｏ−Ｒｅｘ）およびチェレツ
クス（ Ｃｈｅｌｅｘ）樹脂は米国力リホルニャ州のビ
オーラツド．ラボラトリース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｒａｂ
ｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）の市販品であり、レワチット（
Ｌｅｗａｔｉｔ）樹脂はドイツ連邦共和国のバイヤー社
の市販品であり，ゼオカルブ（Ｚｅｏｋａｒｂ）および
ゼロライト（Ｚｅｒｏｌ ｉｔｅ）樹脂は英国ノハーム
チット社（Ｔｈｃ Ｐｅｒｍｕｔｉｔ Ｃｏ Ｌｔｄ）
の市販品であり，アンバライト（ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ
）樹脂は米国フィラデルフィア州のローム．アンド６ハ
ース社（ Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ）の市販品である。

第１表からわかるように，本発明の利点は樹脂基材がメ
タクリル酸のポリマーまたはコポリマーである場合に限
られる。

実施例 ２〜５ これらの実施例は吸着工程中のアシラーゼ酵素の純度を
変えたときの影響を示す。

使用方法は実施例１に記載した方法である。

酵素はｐＨ ５． ７で吸着させ，酵素一樹脂錯体は３
，３％（ｗ／ｖ）のグルタルアルデヒドで処理した。

使用樹脂はアルカリ洗浄し、次に酸洗浄したアンバライ
｝ＩＲＣ−５０である。

このようにして得た酵素錯体の比活性度を第２表に示す
。

第２表の結果は表示の範囲内で原料酵素の純度が増すと
酵素錯体の比活性度が増加することを示す。

実施例 ６〜１５ 酵素を樹脂に吸着させるときｐＨが重要であることをこ
れらの実施例に示す。

これらの実施例で、（ａ） アンバライトＩＲＣ−５
０樹脂５０＆ずつの５試料をそれぞれｐＨ４．９ ，
５．１ ， ５．３ ， ５．５および５．７に調節し
、乾燥してから、タンパク質１６．８ｍｇ／Ａを含有し
，活性度６ ０．９μＭＡＭｒｎｌ伝導度０．５５ミｌ
Ｊモーの部分精製ペニシリンアシラーゼの溶液９５ｍｌ
に加え、水を加えて最終容積２００ｍｌとし、該当ｐＨ
で１６時間吸着させて得られる酵素錯体を実施例１に記
載の方法で処理するか、あるいは （ｂ） 同一種類の別の５試料を、吸着工程をｐＨ
５．７〜６．５の範囲で行なうこと以外は前記同様に処
理し、樹脂に対して使用した酵素はタンパク質９− ０
３ ｊｉ ／ｍｌ，活性度５４．７ｔｔＭ／分／ｙｎ
ｌ，伝導度０．７５ミリモー１０５ｍｌとした。

これらの実験の結果を第３表に示す。

これらの結果は吸着工程に対する最適ｐＨが５．２〜５
．８であることを示している。

実施例ｌ６および１７ これらの実施例は粒度を相違する同一樹脂の影響を示す
。

従ってアンバライｔ−ＩＲＣ−５０のクロマトグラフ用
品位のもの，すなわちＡＳＴＭＩＯＯメツシふるいを通
過し、２００メツシふるいにとまる粒度すなわち０．０
７４〜０．１４９ｍｍのね度のアンバライトＣＧ−５０
ＯＩ型を使用した。

樹脂１５ｇを活性度２３．７μＭ／分／ｒｒｔｌ、３．
８６μＭ／ｍｉｔｔ／タンパク質■の酵素溶液２００ｍ
ｌをｐＨ６．３で３時間吸着させ，酵素錯体を回収し、
グルタルアルデヒドの０．８２５％（ Ｗ／ ｖ ）の
溶液２００ｍｌで１６時間処理し．実施例１記載のよう
に回収し、洗浄する。

生成物２１Ｊは湿潤重量基準で１１４、５μＭ／７１Ｔ
ｉ！ｌ／ｇの活性を持つ。

この数字はＡＳＴＭ１４メツシふるいを通過し、５０メ
ツシふるいにとまる粒度すなわち粒径０．２９７〜１．
４１７１１７１ＬのアンバライトＩＲＣ−５０を使用し
た実施例の活性度と比較すると、樹脂が小さいね度を有
するとき、結果が向上することを示す。

調薬用品位のアンバライトすなわちＡＳＴＭの１００メ
ツシふるいを通り５００メツシふるいにとまる粒度すな
わち粒径０．０３７以上ないし０．１４９のアンバライ
トＩＲＰ−６４を使用して実験を反復する。

樹脂に活性度３９２０μＭ／分／樹脂ｇ比活性度１ ７
． ４ ／／Ｍ／分／タンパク質ｇの酵素をｐＨ ５．
３で吸着させ、次に酵素錯体を３．３％（ｗ／Ｖ）の
グルタルアルデヒド溶液と反応させ、実施例１記載の如
く処理する。

生成酵素錯体は湿潤重量基準で４７８．４μＭ／分／ｇ
の比活性度を有する。

参考例 １ アンバライトＩＲＣ−５０のｐＨをｐＨ ５． ５の０
．２Ｍのリン酸塩緩衝液で洗浄するか、あるいは蒸留水
でスラリー状にし水酸化ナトリウム溶液を加えることに
よって５．５に調節し、さらに水の伝導度に変化が認め
られなくなるまで蒸留水で洗う。

ｐＨ ５． ５の０．０２Ｍリン酸塩緩衝液５００虎ｌ
中の活性度５．２５μＭ／分／タンパク質ｇのペニシリ
ンマシラーゼにこの湿潤樹脂を加え、室温で２０時間か
きまぜる。

固体をろ過によって回収し，前記リン酸塩緩衝液にとか
したグルタルアルデヒドの０．２５％（ｗ／ｖ）溶液５
００１ｒＬｌ中に再懸濁し、さらに２０時間室温でかき
まぜる。

次に生或酵素錯体をろ過によって回収し、樹脂がｐＨ
７． ８で平衡するまでｐＨ ７． ８の０． ２ Ｍ
リン酸塩緩衝液で洗う。

このようにして調製した酵素錯体１５ｇを使用して、ｐ
Ｈ ７． ８の０．０２Ｍのリン酸塩緩衝液中の６．２
５％（ｗ／Ｖ）のベンジルペニシリン溶液２００ｍｌを
３７℃で２時間反応させて６−ＡＰＡに裂開した。

酵素錯体は容易に回収して再使用できること、およびそ
の機械的および生物学安定性が錯体を少なくとも２５回
再使用できる程度に保持できることがわかった。

参考例 ２ 参考例１は本発明の酵素錯体が６−ＡＰＡの大規模な製
造に使用できることおよびこのような条件で錯体の再使
用が優秀であることを示すものである。

アンバライ｝ＩＲＣ−５０を使用して２６．３μＭ／分
／ｇの活性度を有する酵素錯体を作り、０．０２Ｍのリ
ン酸塩緩衝液で調製した濃度６、５％（Ｗ／Ｖ）のベン
ジルペニシリン溶液４０１３を裂開して６−ＡＰＡを製
造した。

酵素錯体は金網を使用して反応器に保持しているので１
回分の反応が終ったら６−ＡＰＡ製品の溶液をろ過し、
錯体を水洗し、次回の反応を行なった。

１回分６時間ずつで５０回連続再使用したときの６−Ａ
ＰＡ転化の平均効率は９５％であった。

比較例 １ 実ｍ例”２０はアンバライトＩＲｃ−５０から実施例１
記載のごとく調製した本発明の酵素錯体の機械的安定性
を、中性のポリマー基材すなわち米国のローム．アンド
．ハース社から市販されている交差結合アクリルエステ
ルであるＸＡＤ−７樹脂から同様に調製した酵素錯体の
安定性との比較を示す。

酵素錯体の各試料１．６ｋｇをｐＨ７．８．３７℃の０
． ２ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液８ｅに懸濁し、各混合物
を仕切板付きのニュー．プランスウイツク、マグナファ
ーム培養器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｍａｇｎａ
ｆｅｒｍｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）で２ｏｏｒｐｍで７２時
間かきまぜる。

ＸＡＤ−７ビードの破砕はＩＲＣ−５０ビードの破砕よ
りかなり高く、ＩＲＣ−５０ビードを６４時間かきまぜ
たときの試料は８時間後に取出したＡＤ−７樹脂の試料
に類似している。

この結果はＩＲＣ−５０樹脂の機械的強度が大きいこと
を明示している。

参考例 ３ 実施例１に記載のごとくアンバライトＩＲＣ５０から調
製した活性度３９．４μＭ／分／ｇの酵素錯体を使用し
，１０回の連続使用してカリウムベンジルペニシリンＧ
の６．２５％（ Ｗ／ Ｖ ） 溶液を裂開して６−Ａ
ＰＡを製造した。

各実験はカリウムベンジルペニシリンＧ溶液１ｅを使用
し３７’Ｃ ， ｐＨ ７． ８で実施した。

アンバライトＩＲＣ５０の酵素錯体を各実験後毎にろ過
分離し、蒸留水で洗う。

ろ液と洗浄廃水とを回転式真空蒸発器で濃縮し，濃縮混
合物を等容積のメチルイソブチルケトンと混合し、４〜
１０℃に冷却し、最後に酸性にして６−アミノペニシラ
ン酸を沈殿させる。

６−アミノペニシラン酸を少量の蒸留水で洗い、アセト
ンで洗い，乾燥炉で乾燥する。

１０回の実験から得られた６−アミノペニシラン酸の平
均重量収率は９１．３％であった。

比較例 ２ ウレタン被覆ポリエチレンに対するアシラーゼ酵素の吸
着 ４００ミクロン以下の粒径の低密度ポリエチレン粒子を
クレー．バレー．プロダクツ社（ＣｒａｙＶａｌｌｅｙ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）製ウレタン（
Ｕｒｉｔｈａｎｅ） ６ ４ １Ｗというウレタンポリ
マーで被覆し、１０日間乾燥した。

被覆粒子を次に１時間２０％（ｗ／ｖ）のアセトン水溶
液で洗い、次に多量の蒸留水であらい、５ｇの試料に活
性度５４０μＭ／分／ｍｌ， ３．８０μＭ／分／タ
ンパク質ｇの酵素溶液１２５ｍｌをｐＨ ４． ８ 〜
９． ０で５時間吸着させた。

ウレタン被覆粒子をろ過分離し，３％（ｗ／ｖ）グルタ
ルアルデヒドで３時間処理し、実施例１に記載の如く、
ｐＨ ７． ８に平衡させた。

ウレタン被覆粒子はＩＲＣ−５０樹脂より平均して小さ
な粒度を有するのにもかかわらず、得られた比活性度は
ＩＲＣ−５０を使用したものより２〜３倍低かった。

ｐＨ 湿潤錯体の活性度、μＭ／分／ｇ４．８
１１．３５．２
１４．０５，６ １６
．４６．０ １３．２６．４
１３．６７．０
１２．３７． ５
７． ８ｓ．ｏ ｉｏ．ｏ８
． ５ ９． ０９．０
１２．２比較例 ３ ナイロンに対するアシラーゼ酵素の吸着 英国アト．シミー社（ Ａｔｏ Ｃｈｉｍｉ ｅ（Ｕ．
Ｋ． ）Ｌｉｍｉｔｅｄ） の粒径３０ミクロン以下
の粉末ナイロン−６であるオルゴラツク（Ｏｒｇｏｌａ
ｃｑ）を６５％（Ｗ／ｖ）ギ酸で洗い，多量の水でゆす
ぎ、その１０ｇに活性度ｓｏ．９μＭ／分／ｍｌ，４．
７μＭ／分／タンパク質ｇの酵素溶液をｐＨ ４． ８
〜９，０で１６時間吸着させ、粉末ナイロンをろ過分離
し、３，３％（ｗ／Ｖ）のグルタルアルデヒドと３時間
処理し、実施例１に記載の如く洗浄する。

ｐＨ ４． ８で得られた最高活性度は湿潤重量基準で
４１．７μＭ／分／ｇで、ＩＲＣ−５０を使用した代表
的な製剤に匹敵するが、ナイロンとＩＲＣ−５０の粒度
の差を顧慮するとき、ＩＲＣ−５０の方が優れているこ
とがわかる。

従って調薬用品位のＩＩＲＣ−５０で粒度３７〜１４９
μＭをアシラーゼと結合させると、前記ナイロン調剤よ
りも１１倍以上も大きな湿潤重量基準の比活性度４７８
μＭ／／；ｖｆｌを得ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 水に不溶性のポリマー基材に吸着させ、グルタルア
   ルデヒド，グリオキサールおよびホルムアルデヒドから
   選んだ架橋剤で交差結合させたペニシリンアシラーゼ酵
   素よりなり，該ポリマー基材がメタクリル酸の水に不溶
   性ポリマーまたはコポリマーであることを特徴とする水
   に不溶性酵素錯体。