JPH10136994A - Ｌ−ベラトリルグリシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−ドーパの製造中間体である（Ｌ）−ベラ
トリルグリシンの新規な製造法を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ） 【化１】 で表わされるＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリ
シンを、アミダーゼが固定化された不溶性担体と接触さ
せることにより、式（ＩＩ） 【化２】 で表わされる（Ｌ）−ベラトリルグリシンを生成させ、
次いで、（Ｌ）−ベラトリルグリシンを回収することを
特徴とする（Ｌ）−ベラトリルグリシンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、Ｌ−ドーパの製
造中間体として有用な（Ｌ）−ベラトリルグリシンおよ
び／またはＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシン
の新規な製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】 Ｌ−３，４−ジオキシフェニルアラニ
ン（L-3,4-dihydroxyphenylalanine；以下「Ｌ−ドー
パ」という）は、パーキンソン病治療薬として有用な物
質である。一般にＬ−ドーパは中間体（Ｌ）−ベラトリ
ルグリシンを脱メチル化することにより製造される。さ
らに、（Ｌ）−ベラトリルグリシンは、ラセミ体である
Ｎ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシンを不斉加
水分解することにより製造することができる。この不斉
加水分解反応にあっては、基質特異性が広く、アミノ酸
のラセミ分割に利用されている酵素アミダーゼ（アシラ
ーゼ）が使用される。

【０００３】しかしながら、該酵素を反応時に毎回投入
・消費すると、製造コストが高くなるばかりでなく、反
応終了後の（Ｌ）−ベラトリルグリシンの回収工程にお
いて酵素が混入することにより、（Ｌ）−ベラトリルグ
リシンの品質の低下の原因ともなっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は、
（Ｌ）−ベラトリルグリシンの製造工程において、反応
終了後のアミダーゼを効率よく（Ｌ）−ベラトリルグリ
シンおよび反応液から分離することにより、該酵素を繰
り返し再利用することを可能にし、かつ（Ｌ）−ベラト
リルグリシンの品質を向上せしめる、（Ｌ）−ベラトリ
ルグリシンの新規製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】 本発明は、（１） 式
（Ｉ）

【０００６】

【化５】

【０００７】で表わされるＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベ
ラトリルグリシンを、アミダーゼが固定化された不溶性
担体と接触させることにより、式（ＩＩ）

【０００８】

【化６】

【０００９】で表わされる（Ｌ）−ベラトリルグリシン
を生成させ、次いで、（Ｌ）−ベラトリルグリシンを分
離・回収することを特徴とする（Ｌ）−ベラトリルグリ
シンの製造方法、（２） 式（Ｉ）

【００１０】

【化７】

【００１１】で表わされるＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベ
ラトリルグリシンを、アミダーゼが固定化された不溶性
担体と接触させることにより、式（ＩＩＩ）

【００１２】

【化８】

【００１３】で表わされるＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラ
トリルグリシンを生成させ、次いで、Ｎ−アセチル−
（Ｄ）−ベラトリルグリシンを分離・回収することを特
徴とするＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシンの
製造方法、（３） 不溶性担体がキトサン樹脂、イオン
交換樹脂、ポリビニルアルコール、光架橋樹脂、セライ
ト、ケイソウ土およびセラミックスからなる群より選択
されるものであることを特徴とする、（１）または
（２）記載の方法、（４） 不溶性担体がキトサン樹脂
であることを特徴とする、（１）または（２）記載の方
法、（５） 不溶性担体がキトパールＢＣＷ−２６１０
（商標名；富士紡績（株）社製）またはキトパールＢＣ
Ｗ−２６２０（商標名；富士紡績（株）社製）であるこ
とを特徴とする、（１）または（２）記載の方法、
（６） アミダーゼがアミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．
１．１４）またはペニシリンアミダーゼ（ＥＣ３．５．
１．１１）であることを特徴とする、（１）ないし
（５）のいずれかに記載の方法、（７） アミダーゼが
アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）であること
を特徴とする、（１）ないし（５）のいずれかに記載の
方法、（８） アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１
４）が固定化されたキトパールＢＣＷ−２６１０（商標
名；富士紡績（株）社製）またはキトパールＢＣＷ−２
６２０（商標名；富士紡績（株）社製）を用いることを
特徴とする、（１）または（２）に記載の方法、に関す
る。

【００１４】本発明者らは、アミダーゼを不溶性担体に
吸着させた後、多官能試薬で架橋補強をしたものを用い
て、Ｎ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシンを立
体選択的に不斉加水分解して光学分割すると、（Ｌ）−
ベラトリルグリシンおよびＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラ
トリルグリシンを効率よく製造できることを見出し、本
発明を完成させた。一般には、酵素を担体に固定化する
と、活性および反応速度が低下する傾向がある［Ｂ．ア
トキンソン著、福井三郎ら訳、バイオリアクター／微生
物・生化学の反応器 第９章 産業図書刊］が、本発明
の方法では従来法よりも短い時間で（Ｌ）−ベラトリル
グリシンを効率よく製造することが可能である。

【００１５】本発明において、「アミダーゼが固定化さ
れた不溶性担体」または「アミダーゼ固定化担体」と
は、アミダーゼを不溶性担体に吸着させた後、多官能試
薬で架橋補強をしたものをいう。

【００１６】アミダーゼは、アミド基のＣ−Ｎ結合を加
水分解する酵素の総称であり、アシルアミダーゼ、アシ
ラーゼまたはデアミダーゼ等とも呼ばれるが、本発明に
おいては特に、光学特異性が高く、Ｌ−アミノ酸のみに
作用するアミダーゼを「アミダーゼ」という。そのよう
なアミダーゼとして好適なものはアミノアシラーゼ（Ｅ
Ｃ３．５．１．１４）およびペニシリンアミダーゼ（Ｅ
Ｃ３．５．１．１１）であり、中でもアミノアシラーゼ
が最も好適であるが、本発明の方法において使用される
アミダーゼはこれらに限定されず、光学特異性が高く、
Ｌ−アミノ酸のみに作用するアミダーゼであればいずれ
も使用することができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】 アミダーゼが固定化された水不
溶性の担体は、例えば水不溶性の担体とアミダーゼを水
中で接触させることによりアミダーゼを担体に吸着さ
せ、担体をろ過、洗浄後、２〜１３％の架橋剤を含む水
溶液中で、２〜５時間架橋補強を行なってから、担体を
再度濾過・洗浄して架橋剤を除去することにより調製す
ることができる。

【００１８】本発明の方法において用いるアミダーゼと
しては、具体的には例えばアミノアシラーゼ（天野製薬
（株）社製）、アミノアシラーゼ（ナガセ産業（株）社
製）、アシラーゼＩ（ブタ腎由来；シグマ社製）、ペニ
シリンアミダーゼ（シグマ社製）、アシラーゼＩ（アス
ペルギルス・メレウス由来；シグマ社製）を挙げること
ができる。これらのうち、アミノアシラーゼ（３万単位
／ｇ；天野製薬 (株)社製）が最も好適である。

【００１９】また、担体としては、水に不溶性の担体、
例えばセライト、ケイソウ土、多孔質ガラス、セラミッ
クス等の無機担体；ポリビニルアルコール、キトサン、
イオン交換樹脂、吸着樹脂、光架橋樹脂等の有機高分子
のような、アミダーゼ活性に影響を与えず、かつ本発明
の工程において物理的、化学的に安定なものであればい
ずれも使用することができる。特に、不溶性担体内に
１、２または３級アミンを持つイオン結合モードの担体
が、酵素の吸着性や基質との相性からも好ましい。

【００２０】担体の形状としては、例えば粉末状、顆粒
状、スポンジ状等、種々のものがあるが、そのいずれで
も使用できる。工程および操作上の面からは、３００な
いし２５００μｍの粒径を有する、比表面積２０ないし
２００ｍ² ／g の多孔性の担体が好適である。特に好適
な担体としては、例えばキトサン樹脂、より具体的に
は、孔径０．１〜０．２μｍの多孔性樹脂であるキトパ
ールＢＣＷ−２６１０または同ＢＣＷ−２６２０（商標
名；富士紡績 (株) 社製）を例示できる。

【００２１】アミダーゼを担体に吸着させる際の温度
は、アミダーゼの失活が起こらない温度であればよく、
０ないし５０℃、好ましくは２０ないし４０℃である。
またアミダーゼ溶液のｐＨは、アミダーゼの変性が起こ
らないような範囲であればよく、ｐＨ３ないし９であれ
ばよい。特に最大活性を得るにはｐＨ５ないし８の範囲
内が好適である。アミダーゼ溶液に用いる溶媒の種類
は、特に規定しないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等の
緩衝液、または精製水等、アミダーゼの変性が起こらな
いような溶媒であればよい。また、溶媒中のアミダーゼ
濃度は特に限定されないが、固定化効率の点から、アミ
ダーゼの溶解度以下で、かつ充分な濃度であることが望
ましい。アミダーゼと担体の使用割合は、担体１重量部
に対して、アミダーゼ０．００５ないし０．２重量部、
特に０．０１６ないし０．０５重量部が好適であるが、
特にこの範囲に限定されるものではない。

【００２２】アミダーゼを担体に吸着させた後、以下に
記載する方法を用いて架橋補強を行う。架橋剤として
は、エチレングリコール・ジグリシジルエーテル、ネオ
ペンチルグリコール・ジグリシジルエーテル、１，６−
ヘキサンジオール・ジグリシジルエーテル、１，４−ブ
タンジオール・ジグリシジルエーテル等のジグリシジル
エーテル類またはグルタルアルデヒドが好適であるが、
最も好適なものとしてはエチレングリコール・ジグリシ
ジルエーテルを挙げることができる。架橋剤の２ないし
１３％水溶液に、上記のごとく作製したアミダーゼ吸着
担体を懸濁し、攪拌しながら０ないし５０℃（好適には
２５ないし４０℃）で２ないし５時間保温する。次い
で、担体を水で洗浄して未反応の架橋剤を除去すること
により、アミダーゼ固定化担体を得る。

【００２３】上記のごとくして調製されたアミダーゼ固
定化担体は、（Ｌ）−ベラトリルグリシンおよび／また
はＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシンの製造に
おいて、繰り返し使用することができる。

【００２４】まず、本発明の方法における原料化合物、
すなわち（Ｄ）体と（Ｌ）体の等量混合物であるラセミ
体のＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシンは、
例えば以下に記載するような方法で合成することができ
る［江井仁ら、平成７年度バイオエンジニアリング講演
会講演要旨集（（財）バイオインダストリー協会）１頁
参照］。まず、バニリンおよびヒダントインを出発原料
として、常法に従ってメチル化、脱水縮合反応をさせる
ことによりベラトリルヒダントインを合成する。次い
で、ベラトリルヒダントインに水素添加し、加水分解を
行った後、生成した（ＤＬ）−ベラトリルグリシンをア
セチル化することによりＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラ
トリルグリシンを得る。

【００２５】以下、本発明の方法を具体的に説明する
が、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。

【００２６】１）バッチ法： 水１重量部に対して、溶解度以下（好ましくは０．２な
いし０．３重量部）のＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラト
リルグリシン、０．０９ないし０．３重量部（好ましく
は０．１５ないし０．１８重量部）のアミダーゼ固定化
担体および０．００２ないし０．００４重量部（好まし
くは０．００２５ないし０．００３重量部）のリン酸水
素２ナトリウムを加えて反応液を調製する。反応液のｐ
Ｈは、リン酸水素２ナトリウムにより５ないし８、好適
には７．０ないし７．２に調整する。また、該反応液に
は塩化コバルトを０．０００１ないし０．０００１５重
量部および／または３７％ホルマリンを０．０００６な
いし０．０００８重量部添加することもできる。

【００２７】反応温度は２０ないし５０℃、好適には３
８ないし４０℃である。一回の反応は２．５ないし９６
時間行われる。

【００２８】酵素固定化担体と基質との接触機会を増大
させることにより反応効率を高めるためには、反応液を
機械的に攪拌することが好ましい。その際、容器ごと回
転させる方法（ロータリー法）の場合の回転数としては
１００ないし４００ｒｐｍ、容器中に攪拌羽根を入れる
方法の場合の回転数としては５０ないし４００ｒｐｍが
好適である。反応終了後のアミダーゼ固定化担体は、例
えば、晶出する（Ｌ）−ベラトリルグリシンを通過さ
せ、アミダーゼ固定化担体を通過させないような金網等
の濾別器具を使用して回収し、次の反応へ繰り返し使用
することができる。晶出した（Ｌ）−ベラトリルグリシ
ンは、濾別により溶解液中のＮ−アセチル−（Ｄ）−ベ
ラトリルグリシンと分離し、回収することができる。

【００２９】２）流動化装置を使用する方法［白井隆
(1965) 化学装置便覧（丸善刊）７８頁参照］： 水１重量部に対して、０．３重量部以下のＮ−アセチル
−（ＤＬ）−ベラトリルグリシン、０．０９ないし０．
３重量部のアミダーゼ固定化担体および０．００２ない
し０．００４重量部のリン酸水素２ナトリウムを加えて
反応液を調製する。反応液のｐＨは、リン酸水素２ナト
リウムにより５ないし８、好適には７．０ないし７．２
に調整する。反応液を攪拌するために、空気または窒素
を、１分間当たり反応液量の０．１ないし１０容、反応
液中に送り込む。反応温度は２０ないし５０℃、好適に
は３８ないし４０℃である。一回の反応は２ないし９６
時間行われる。その間に蒸発する水分は適宜補充する。
反応終了後のアミダーゼ固定化担体は、例えば上記１）
に記載した方法で回収することにより、繰り返し使用す
ることができる。晶出した（Ｌ）−ベラトリルグリシン
は、濾別により溶解液中のＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラ
トリルグリシンと分離し、回収することができる。

【００３０】３）カラム法： カラムを使用して反応を行う場合は、逆流式（アップフ
ロー式）でＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシ
ンを含む溶媒を循環させることによりカラム内に繰り返
し送液する方法が好適である。水１重量部に対し、０．
２５重量部以下のＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリル
グリシン、０．０９ないし０．３重量部のアミダーゼ固
定化担体および０．００２ないし０．００４重量部のリ
ン酸水素２ナトリウムを加えて反応液を調製し、カラム
内に入れる。反応液のｐＨは、リン酸水素２ナトリウム
により５ないし８、好適には７．０ないし７．２に調整
する。流速は１分間当たり総反応液量の３倍量以下に調
節する。反応温度は２０ないし５０℃、好適には３８な
いし４０℃である。一回の反応は２．５ないし１２０時
間行われる。反応終了後のアミダーゼ固定化担体は、例
えば上記１）に記載した方法で回収することにより、繰
り返し使用することができる。晶出した（Ｌ）−ベラト
リルグリシンは、濾別により溶解液中のＮ−アセチル−
（Ｄ）−ベラトリルグリシンと分離し、回収することが
できる。

【００３１】反応中、または反応終了後のＮ−アセチル
−（ＤＬ）−ベラトリルグリシンから（Ｌ）−ベラトリ
ルグリシンへの不斉加水分解率は、反応液の一部を採取
して、アミダーゼ固定化担体および晶出した（Ｌ）−ベ
ラトリルグリシンを濾別により除去した後、高速液体ク
ロマトグラフィー法により反応液中の溶解成分を定量す
ることにより調べることができる。

【００３２】例えば、定量機器として高速液体クロマト
グラフィー装置Ｌ−６２５０型（日立（株）社製）を用
い、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーを実施す
る。

【００３３】カラム：キラルセル−ＯＤ（CHIRALCEL-O
D；ダイセル化学工業 (株) 社製） カラムサイズ：φ０．４６×２５ｃｍ 移動相：（ヘキサン：イソプロピルアルコール：ギ酸）
＝（７５：２５：１） 流速 ： ０．３ｍｌ／分 温度 ： ２３℃ 検出 ： ２７７ｎｍ チャート速度 ： １．０ｍｌ／分 Ｎ−アセチル−（Ｌ）−ベラトリルグリシンの保持時
間： 約３２分 Ｎ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシンの保持時
間： 約３８分。

【００３４】晶出した（Ｌ）−ベラトリルグリシンは、
反応液から濾別により除去してあるので、この方法で直
接定量することはできないが、以下の計算式により不斉
加水分解率を算出することができる： 不斉加水分解率（％）＝１００×（Ａ₀ −Ａ_t ）／Ａ_o （式中、Ａ₀ およびＡ_t はそれぞれ反応開始時および反
応開始から時間ｔ経過後の一定量の反応液中のＮ−アセ
チル−（Ｌ）−ベラトリルグリシン量を表わす）。

【００３５】なお、濾別後の反応液中に溶解しているＮ
−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシンは、例えば無
水酢酸とともに加熱することによりラセミ化してＮ−ア
セチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシンとし、再利用す
ることができる。本発明の方法においては反応液中に酵
素が残留しないため、Ｎ−アセチル−（ＤＬ）−ベラト
リルグリシンの製造中間体であるＮ−アセチル−（Ｄ）
−ベラトリルグリシンも混入物の少ない状態で回収する
ことができる。

【００３６】

【実施例】 以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００３７】実施例１．市販のキトサン樹脂（キトパー
ルＢＣＷ−２６２０；富士紡績（株）社製）３ｇを５０
ｍｌのイオン交換水にてろ過洗浄を３回行い、付着水を
除去した。

【００３８】アミノアシラーゼ（３万単位／ｇ；天野製
薬（株）社製）１００ｍｇをイオン交換水２０ｍｌに加
え、室温にて２０分間撹拌した。この溶液にキトサン樹
脂を全量加え、ロータリー振盪機を用いて１５０ｒｐｍ
で攪拌しながら４０℃で２．５時間保温した。

【００３９】次に、該懸濁液よりキトサン樹脂を濾別し
水で洗浄した。なお、この時、濾液中のアミノアシラー
ゼ活性を測定した結果、使用したアミノアシラーゼのほ
とんどがキトサン樹脂に吸着されていることが判明し
た。

【００４０】次いで、エチレングリコール・ジグリシジ
ルエーテルの６％水溶液にアミノアシラーゼ吸着樹脂を
全量加え、ロータリー振盪機を用いて１５０ｒｐｍで攪
拌しながら４０℃で２．５時間保温した。その後、樹脂
を水で洗浄して濾別する操作を、濾液の吸光度（２８０
ｎｍ）が０．０１以下になるまで繰り返し、アミノアシ
ラーゼ固定化キトサン樹脂を得た。

【００４１】原料化合物であるＮ−アセチル−（ＤＬ）
−ベラトリルグリシンは、以下に記載する方法に従って
調製した。

【００４２】バニリン１５２ｇを８５℃で溶融し、攪拌
しながらジメチル硫酸１８９ｇと３４％水酸化ナトリウ
ム水溶液とを同時に、この反応液が常にアルカリ性を保
つように滴下した後、１００℃で１時間加熱した。この
反応混合物を冷却し、１０％硫酸を用いて中和した後、
ヒダントイン１２５ｇおよびジエタノールアミン３１．
５ｇを加え、１００℃で１５時間加熱した。この反応混
合物を冷却することにより、析出したベラトラルヒダン
トインを得た。このベラトラルヒダントインをメタノー
ルに溶解し、パラジウムカーボン触媒を５％（ｗ／ｖ）
となるように加えたものに、常圧下で水素を２日間送り
込むことにより、ベラトリルヒダントインを得た。この
ベラトリルヒダントインをアルカリ溶液中で１３０℃で
３時間加水分解することにより、（ＤＬ）−ベラトリル
グリシンを得た。さらに、この（ＤＬ）−ベラトリルグ
リシンをアルカリ溶液に溶解し、無水酢酸を添加して常
温で３時間反応させることにより、Ｎ−アセチル−（Ｄ
Ｌ）−ベラトリルグリシンを得た。

【００４３】アミノアシラーゼ固定化キトサン樹脂３ｇ
を、Ｎ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリシン
（３．５３ｇ）、ｐＨ調整液１６．７ｍｌ（リン酸水素
２ナトリウム４７ｍｇ、塩化コバルト１．７７ｍｇを含
む）と混合し、ロータリー振盪機を用いて１５０ｒｐｍ
で４０℃にて２４時間撹拌しながら不斉加水分解反応を
行なった。

【００４４】反応終了後、アミノアシラーゼ固定化キト
サン樹脂を３２メッシュ（タイラー標準ふるい）の金網
にて濾別・回収し、新たにＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベ
ラトリルグリシンおよびｐＨ調整液を加えて、上記の条
件で反応を行った。以上の操作を計２０回繰り返した。

【００４５】反応により生成・晶出した（Ｌ）−ベラト
リルグリシンは、濾別により反応液から分離・回収し
た。

【００４６】反応液の一部を採取し、以下に記載する条
件で高速液体クロマトグラフィーを行なった。

【００４７】機器 ：高速液体クロマトグラフィー装置
Ｌ−６２５０型（日立（株）社製） カラム：キラルセル−ＯＤ（CHIRALCEL-OD；ダイセル化
学工業 (株) 社製） カラムサイズ：φ０．４６×２５ｃｍ 移動相：（ヘキサン：イソプロピルアルコール：ギ酸）
＝（７５：２５：１） 流速 ： ０．３ｍｌ／分 温度 ： ２３℃ 検出 ： ２７７ｎｍ チャート速度 ： １．０ｍｌ／分 保持時間： Ｎ−アセチル−（Ｌ）−ベラトリルグリシ
ン ３２分 Ｎ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシン ３８分 上記各成分のピーク面積から反応液中の各成分の含量を
計算し、さらに以下の計算式により（Ｌ）−ベラトリル
グリシンへの不斉加水分解率を算出した： 不斉加水分解率（％）＝１００×（Ａ₀ −Ａ_t ）／Ａ_o （式中、Ａ₀ およびＡ_t はそれぞれ反応開始時および反
応開始から時間ｔ経過後の一定量の反応液中のＮ−アセ
チル−（Ｌ）−ベラトリルグリシン量を表わす）。

【００４８】その結果、１回目の反応における、反応開
始２４時間後の不斉加水分解率は９８．３％であった。
また、２０回目の反応における、反応開始４８時間後の
不斉加水分解率は９７．４％であった。すなわち、濾別
後の反応液中にはＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグ
リシンが高い光学的純度で回収された。

【００４９】上記と同様の操作を、別のキトサン樹脂
（キトパールＢＣＷ−２６１０；富士紡績 (株) 社製）
を用いて実施した結果、１回目の反応における反応開始
２４時間後の不斉加水分解率は９８．６％であった。ま
た、１９回目の反応における反応開始７２時間後の不斉
加水分解率は８８．７％であった。

【００５０】実施例２．実施例１と同様の方法で調製し
たアミノアシラーゼ固定化キトサン樹脂（ＢＣＷ−２６
１０を用いて調製）１６ｇを、２０ｇのＮ−アセチル−
（ＤＬ）−ベラトリルグリシンおよび塩化コバルト１×
１０^-4Ｍを含む溶液１００ｍｌを混合し、ロータリー振
盪機を用いて１１０ｒｐｍで攪拌しながら４０℃で２４
時間不斉加水分解反応を行った。反応終了後のアミノア
シラーゼ固定化キトサン樹脂は、実施例１と同様の方法
で回収し、繰り返し使用した。また、反応により生成・
晶出した（Ｌ）−ベラトリルグリシンは、濾別により反
応液から分離・回収した。以上の操作を１５回繰り返し
た。

【００５１】実施例１と同様にして反応液中の溶解成分
の定量を行い、不斉加水分解率を算出した結果、１回目
の反応の不斉加水分解率は１００％、１５回目の反応の
不斉加水分解率は７２．４％であった。

【００５２】参考例．アミノアシラーゼ（３万単位；天
野製薬製）５５ｍｇを、２０ｇのＮ−アセチル−（Ｄ
Ｌ）−ベラトリルグリシンを含むｐＨ調整液１００ｍｌ
（リン酸水素２ナトリウム ２８２ｍｇおよび塩化コバ
ルト１×１０^-4Ｍを含む）を混合し、１１０ｒｐｍで攪
拌しながら４０℃で不斉加水分解を行った。反応により
生成・晶出した（Ｌ）−ベラトリルグリシンは、濾別に
より反応液から分離・回収した。

【００５３】実施例１と同様にして反応液中の成分の定
量を行ない、不斉加水分解率を算出した結果、反応開始
２４時間後の不斉加水分解率は７５．９％、反応開始４
８時間後の不斉加水分解率は９７．２％であった。

【００５４】試験例．上記参考例の反応後に（Ｌ）−ベ
ラトリルグリシンを濾別した濾液、および実施例２の第
５回目と第１５回目の反応後に（Ｌ）−ベラトリルグリ
シンを濾別した濾液中のアミノ酸分析を行った。

【００５５】その結果を表１に示した。

【００５６】

【表１】

【００５７】参考例の反応系では濾液中の各アミノ酸値
が高く、反応液中にアミノアシラーゼが多量に残留して
いることが明らかである。一方本発明の反応系では、ア
ミノアシラーゼ固定化キトサン樹脂を繰り返し再利用し
た場合でも、濾液中にグリシンのピーク以外はほとんど
検出されなかった。グリシン以外のアミノ酸がほとんど
検出されなかったことから、本発明の反応系の濾液中で
高値を示すグリシンのピークは少なくともアミノアシラ
ーゼ由来のものではないことが明らかであり、反応液中
にアミノアシラーゼが遊離していないことが判明した。

【００５８】

【発明の効果】 本発明の方法により、（Ｌ）−ベラト
リルグリシンの製造工程においてアミダーゼの反復使用
が可能になった。また、反応終了後のアミダーゼ固定化
担体と反応液との分離が容易になり、さらに反応液中の
酵素の混入がなくなったことにより、（Ｌ）−ベラトリ
ルグリシンおよび／またはＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラ
トリルグリシンの品質向上が実現した。そのうえ、従来
法よりも短い反応時間で効率よく（Ｌ）−ベラトリルグ
リシンを製造することが可能となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 孝 神奈川県平塚市西八幡４丁目４番８号 三 共化成工業株式会社研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 で表わされるＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリ
   シンを、アミダーゼが固定化された不溶性担体と接触さ
   せることにより、式（ＩＩ） 【化２】 で表わされる（Ｌ）−ベラトリルグリシンを生成させ、
   次いで、（Ｌ）−ベラトリルグリシンを分離・回収する
   ことを特徴とする（Ｌ）−ベラトリルグリシンの製造方
   法。
2. 【請求項２】 式（Ｉ） 【化３】 で表わされるＮ−アセチル−（ＤＬ）−ベラトリルグリ
   シンを、アミダーゼが固定化された不溶性担体と接触さ
   せることにより、式（ＩＩＩ） 【化４】 で表わされるＮ−アセチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシ
   ンを生成させ、次いで、Ｎ−アセチル−（Ｄ）−ベラト
   リルグリシンを分離・回収することを特徴とするＮ−ア
   セチル−（Ｄ）−ベラトリルグリシンの製造方法。
3. 【請求項３】 不溶性担体がキトサン樹脂、イオン交換
   樹脂、ポリビニルアルコール、光架橋樹脂、セライト、
   ケイソウ土およびセラミックスからなる群より選択され
   るものであることを特徴とする、請求項１または２記載
   の方法。
4. 【請求項４】 不溶性担体がキトサン樹脂であることを
   特徴とする、請求項１または２記載の方法。
5. 【請求項５】 不溶性担体がキトパールＢＣＷ−２６１
   ０（商標名；富士紡績（株）社製）またはキトパールＢ
   ＣＷ−２６２０（商標名；富士紡績（株）社製）である
   ことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
6. 【請求項６】 アミダーゼがアミノアシラーゼ（ＥＣ
   ３．５．１．１４）またはペニシリンアミダーゼ（ＥＣ
   ３．５．１．１１）であることを特徴とする、請求項１
   ないし５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 アミダーゼがアミノアシラーゼ（ＥＣ
   ３．５．１．１４）であることを特徴とする、請求項１
   ないし５のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１
   ４）が固定化されたキトパールＢＣＷ−２６１０（商標
   名；富士紡績（株）社製）またはキトパールＢＣＷ−２
   ６２０（商標名；富士紡績（株）社製）を用いることを
   特徴とする、請求項１または２に記載の方法。