JPS5867192A - ５′−リボヌクレオチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば既知方法で微生物から堰得されうるよ
うな粗製核酸の混合物からの５′−リボヌクレオチドの
製法に関する。かような粗製核酸中には他の物質と並ん
でリボ核酸およびデオキシリボ核酸が存在する。

ダーリボヌクレオチドは食料添加剤および薬剤を調製す
るための出発物質として用いられる。

その調製に知られているのはリボ核酸の酵素的加水分解
による方法である。しかしながら、これに使用される酵
素である５′−ホスポジエステ２−ゼはリボ核酸の他に
同時にデオキシリボ核酸をも加水分解し、従って所望さ
れる５′−リボヌクレオチドの他に副生物として５′−
デオキシリボヌクレオチドをも生成する。この副生物は
５′−リボヌクレオチドからの分離が非常に困難である
。それゆえ純粋なダーリポヌクレオチドの調製くけ、す
でに実際上デオキシリボ核酸を含まないリボ核酸から出
発することが必要である。

純粋なリボ核酸の調製には今やすでに一連の種々の方法
が知られている。これには、特開昭５３−２０４９３号
明細書に記載されて匹るような加熱およびそれに続く酸
処理によるリボ核酸の選択的沈殿がある。リボ核酸のも
う一つの精製法は特開昭５４−５５７９１号明細書に記
載されており、そこではリボ核酸は２価陽イオンの存在
下に酸で沈殿させることＫよ沙堆得される。

しかしながら、これらすべての既知方法では。

デオキシリボ核酸が熱処理および酸処理により分解され
ることが欠点である。その場合リボ核酸のかなりの部分
も失われる。その他リボ核酸は遠心分離によってのみ単
離され、このことは工業的製法にとって大なる欠点と結
びついている。

それゆえ、リボ核酸の予備精製およびそれと同時にデオ
キシリボ核酸の分解を不必要となす５′−９・ボヌクレ
オチドの製法を見出すという課題があった１本発明によ
・れば、加水分解に必要な酵素である５′−ホスポジエ
ステ２−ゼ（７）　反１［Ｊ性を適癌な固定化により、
デオキシリボ核酸の加水分解がもはや起り得ない程度に
高度に選択的に変えることによりこの課題が解決された
。

従って本発明の目的はリボ核酸を含有する粗製核酸の溶
液を重合体状担体に固定化された５′−ホスホジェステ
ラーゼを用いて選択的に加水分解しそして場合により氷
解物から未変化のデオキシリボ核酸および５′−リボヌ
クレオチドを既知精製法および分離法により単離するこ
とによる５′−リボヌクレオチドの製法にある。

この反応が固定化された５′−ホスホジェステラーゼを
用いてこのように高度に選択的に進行することは驚くべ
きことであった。何故ならばこの酵素は遊離の自然の形
態においておよそ同じ速度でリボ核酸およびデオキシリ
ポ核Ｗ１を分解しくｒ　Ａｇｒ、　　Ｂｉｏ’１．　　
Ｏｈｅｍ、Ｊ　　ｇ３ｓ巻第１５５５１（（１９７４年
）参照〕、そしてこの酵素はリボ核酸の選択的加水分解
については知られているのではないがすでに数種の方法
により固定化されていだからである（　［Ｊ、　５ｏ１
ｔａ−ｐｈａｓｅ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ第１巻
第１０５ｊＸ（１９７６年）参照〕。

この酵素は酵素と重合体状担体との間の共有結合生成に
より固定化される。酵素担体としてはセルロース例エバ
ＩＡＩｃセルロース（ジエチルアミノエチルセルロース
）、０Ｍセルロース（カルボキシメチルセルロース）で
あるか、アミンまたはヒドロキシル基を有する変性ポリ
アクリルアミドゲルであるかまたはアクリルアミド、メ
タクリレート、メタクリル酸エポキシプロビルエステル
、メタクリルアミドおよびマレイン酸無水物からなる種
々の有機共重合物のようにドイツ特許出願公開筒２２１
５５３９号（米国特許第へ９１０，８２５号および同第
４，０４４，１９６号）明細書およびドイツ％詐出願公
告第２７３２５０１号（米国特許第４，２４４６４３号
）明細書に記載されているような重合体状の多孔性担体
があげられる。

重合体状担体としては、直径１００　ｎｍまでおよび細
孔容量的２〜５特に約２．５ｔｓｌ／ｆを有する導管を
有するマクロ細孔性担体を選択するのが好ましい。

本発明方法における５′−ホスホジェステラーゼのため
の特に良好な担体としては、グリシジルメタクリレート
、アリルグリシジルエーテル、メタクリルアきドおよび
メチレンビスメタクリルアミドからなる共重合物である
商品名「オイにルギット（ＩＣｕｐｅｒｇｉｔ■）ＯＪ
で取引きされルエボキシド担体が良好であることが判っ
た。かかる担体はドイツ特許出願公開筒２７２２７５１
号（米国特許！４，１９０，７１３号および同第４．２
０ａ３０９号）明細書に記載されている。

酵素はその安定性が害されない条件下に重合体状担体と
結合する。結合の成果は重合体での酵素活性および洗浄
水中の酵素活性を測定することにより計測されうる。

担体と結合した酵素は本発明の方法を実施するために好
ましくは力２人中に充填され、そして加水分解すべき粗
製核酸の溶液を緩衝系の存在下にこのカラムに流す、そ
の際流下速度はリボ核酸のまさに１００チの反応が遂行
されるように調整される。

使用される核酸溶液は好ましくは微生物から脂質をアン
モニアおよび低級アルカノールで抽出しそして次に水性
流液相を後処理すること罠より取得される（米国特許第
４，２０６，２４３号明細Ｊ）。これら粗製核酸は分子
量１０へ０００以上そして好ましくは２００，０００以
上のデオキシリボ核酸、および１００．ＯＤＤより相当
低い分子量特に１０，０００〜ｓｏ、ｏａｏの分子′！
Ｉｋを有するリボ核酸を含有する。

本発明により使用される固定化された５′−ホスホジェ
ステラーゼは可溶性５′−ホスホジェステラーゼに比較
して驚くほど高いリボ核酸に対する１００％の選択性を
有するのみならず、その大いなる安定性のゆえに比較的
長時間にわたって継続的に使用されうる。例えば、１０
か月以上の期間にわたって、流下するリボ核酸を完全に
５′−リボヌクレオチドに解裂させることが可能である
。

その際取得される水解物は５ｈ−！Ｊボヌクレオチドお
よび無傷のデオキシリボ核酸の他にさらに蛋白質および
発酵塩のような不純物をも含有し、これらはそれ自体既
知の精製法により分離されうる、５′−リボヌクレオチ
ドの単離に際してはこれはイオン交換法によってかまた
はａ着りロマトグラフィー法によりなされる。デオキシ
リボ核酸のφ啼および′！−＃製には既知ｐＨ沈殿法が
良好であることが判った。その場合どの単離を最初にと
り行うかは重要ではない。

本発明の方法番でよれば工業的規模で大量の粗製核酸を
選択的に長期間にわたって酵素的に解裂させることがで
き、そしてその際純粋な５′−リボヌクレオチドならび
にまた高分子量デオキシリボ核酸が重書されうる。

なかんずく５′−アデノシンモノ燐酸をも含有している
粗製核酸の加水分解により取得される溶液は、デオキシ
リボ核酸を予め分離する必要なく直接に風味増強剤とし
て使用しうる５′−イノクンモノ燐酸の取得に使用され
うる。これには５′−アデノ７ンモノ燐１Ｉｌｔ−含有
する溶液を、足体に固定化された５′−デスアミナーゼ
を含「するカラム１で加える。その際５′−アデノシン
モノ燐酸の脱アミン化が起る。

本発明の方法を以下の例により説明する。

例　　１ ５１−ホスホジェステラーゼ〔ヌクレアーゼＲｐ、、ア
マノ商会製品）２ｆをｐＨ７，８の１ｍ燐酸塩緩衝液８
〇−中に溶′解させる。この溶液をエポキシド担体（オ
イベルギットＣ）２０ｆに加え、軽く攪拌しそして３日
間室温で放置する。

重合体樹脂をＦ　Ｊしそして下記液体を用いる洗浄工程
にかける。

１、　再蒸留水 ２、　０．１　ｍ　ＮａＨＯＯ３ ３、α５　ｍ　ＮａＱ４ ４、　再蒸留水 ５．１ミリモルＨＣＡ ＆　再蒸留水 洗浄した樹脂をｐＨ４，５のα０５ｎ酢酸塩緩衝液中に
とりそしてカラムに充填する。固定化された５′−ホス
ホジェステラーゼの活性を測定するためＫ　ｓ　ｐＨ４
，５（７）　０．０５ｍ　ｈ酸塩緩衝液中ノ０，１ミリ
モル硫酸亜、鉛および４％リボ核酸からなる基質溶液を
５５℃で流下速度（８ｖ）毎時２ｏ〜３０でカラムにポ
ンプで通す、生成するモノヌクレオチドの量は測光的に
ま九は高速液体クロマドグｒ）フィーにより測定される
。

例　　２ 粗製核酸〔リボ核酸／デオキシリボ核酸（４：１））０
．９％（ｗ／ｖ　）を有する水溶液を氷酢酸を用いてｐ
Ｈ４，５に調整しそして５５℃で例１により固定化され
た５′−ホスホジェステラーゼを含有するカラムに通す
、その際カラムの流下速度はリボ核酸のまさに１００１
が反応するようにＡ整される。５′−リボヌクレオチド
を単離するには分解された核酸溶液を、弱塩基性イオン
交換体（アセテート型）を負荷されたカラムにポンプで
通すと、そこで５′−リボヌクレオチドが吸着される。

デオキシリボ核酸を精製および単離するにはカラムから
の溶出液をホール７アーゼル（Ｈｏｈｌｆａθｅｒ）膜
によって濃縮しそして脱塩水で透析する。その場合５０
，０００以下の分子量を有する分子は膜を通過する。デ
オキシリボ核酸は溶液のｐＨを２゜０ＫＫ４整すること
により析出しそして乾燥後に白色粉末の形態で単離され
る。４種類の異なる５′−リボヌクレオチドの分離およ
び精製は既知方法で増大する濃度のアセテート溶液を用
いて選択的に脱着することにより遂行される。

例　　３ ３チ（ｗ／ｖ　）粗製核酸〔リボ核酸／デオ中シリボ核
酸（４：１）］の水溶液を氷酢酸を用いてｐＨ４，５に
調整しそして５５℃で例１記載の固定化された５′−ホ
スホジェステラーゼを有するカラムに流す。カラムの流
下速度はリボ核酸のまさに１００チが反応するように調
整する。かくして得られた溶液中にはなかんずく５′−
アデノシンモノ燐酸も含有される。これから５′−イノ
シンモノ燐酸を、、１．１１製するために、この溶液を
固定化された５′−デスアミナーゼを含有する第２のカ
ラムに加える。このカラムの溶出液を例２に記載のホー
ルファーゼル膜で継続的に透析する。

透過物を濃塩酸を用いてｐＨ１，５〜２．ＯＫ調整しそ
して顆粒什された活性炭を充填したカラムにポンプ送り
すると、５′−リボヌクレオチドが吸着される。滞留物
からｐＨを２．０に調整することによりデオキシリボ核
酸を沈殿させそして次に乾燥させる。種々の５′−リボ
ヌクレオチドの単離および分ｌＩＩＭは既知方法でアル
カリ性の水性メタノール溶液を用いる選択的脱着により
遂行される。

例　　４ 粗製核酸〔リボ核酸／デオキシリボ核酸（１：１）〕の
２チ（ｗ／ｖ　）水溶液を例２に記載のようにして子備
処理しそして分解させるために固定化された５′−ホス
ホジェステラーゼヲ含有するカラムに流す、溶出液をＮ
ａＯＨを用いてｐＨａ５に調整しそしてヌクレオチドを
吸着させる目的で強塩基性アニオン交換体重ＲＡ　４０
０　（クロライド型）を負荷されたカラムに流す、イオ
ン交換体カラムの溶出液を例２に記載のホールファーゼ
ル膜で濃縮しそして濃塩酸を用いてｐＨ２，０に調整す
る。析出したデオキシリボ核酸を′ＦＡしそして乾燥す
る。脱塩水でイオン交換体カラムを強力に洗ったのち個
々のヌクレオチド金高度に純粋な形態で増大してゆくク
ロライド譲度を甘する溶成で脱着しそして結晶化させる
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）リボ核酸を含有する粗製ｉ１１酸の溶液を重合体状
   担体に固定化された５′−ホスホジェステラーゼを用い
   て選択的に加水分解することを特徴とする、５′−リボ
   ヌクレオチドの製法。 ２）重合体状担体として１０１００ｎでの直径および約
   ２〜３ｒｄ／ｆの細孔容量を有する導管を有するマクロ
   細孔性担体が選択されることを特徴とする、前記特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３）重合体状担体が細孔容量的２．５ｄ／ｙを有するこ
   とを特徴とする、前記特許請求の範囲第２項記載の方法
   。 ４）担体がグリシジルメタクリレート、アリルグリシジ
   ルエーテル、メタクリルアきドおよびメチレン−ビス−
   メタクリルアミドからなる共重合物であることを特徴と
   する、前記特許請求の範囲第１〜３項記載の方法。 ５）粗製核酸溶液がアンモニアおよび低級アルカノール
   を用いる脂質の抽出および続く水性抽出により微生物か
   ら得られることを特徴とする、前記特許請求の範囲第１
   〜４項記載の方法。 ６）粗製核酸が分子量１０α０００以上のデオキシリボ
   核酸および１００，０００より相当低い分子量を有する
   リボ核酸を含有することを特徴とする、前記特許請求の
   範囲第１〜５項記載の方法。 ７）粗製核酸が分子量２００，０００以上のデオキシリ
   ボ核酸および分子量１０，０００〜５０．ＯＤＤのリボ
   核酸を含有することを特徴とする、前記特許請求の範囲
   第１〜６項記載の方法。 ８）氷解物から５′−リボヌクレオチドをイオン−交換
   体を用いて率敵することを特徴とする、前記特許請求の
   範囲第１〜７項記載の方法。 ９）氷解物から５′−リボヌクレオチドを吸着クロマド
   グ２フイーにより単離することを特徴とする、前記特許
   請求の範囲第１〜７項記載の方法。 １０）前記特許請求の範囲第１項記載の方法により得ら
   れた氷解物を５１−イノシンモノ燐酸の調製に使用する
   に当り、その中に含有される５′−アデノシンモノ燐酸
   から担体に固定された５′−デスアミナーゼを用いてア
   ンモニアを解裂させることを特徴とする方法。