DE2703615A1 - Wasserunloesliche tanninzubereitungen - Google Patents

Wasserunloesliche tanninzubereitungen

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Description

28 837 u/wa
TANABE SEIYAKU CO., LTD., OSAKA/JAPAN
Wasserunlösliche Tanninzubereitungen
Die Erfindung betrifft eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, ein biologes aktives Protein, das mit der Tanninzubereitung immobilisiert ist und Verfahren zu deren Herstellung.
Enzyme und andere biologisch aktive Proteine, die aus Geweben lebender Organismen isoliert worden sind (z.B. mikrobielle
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Zellen, Pflanzen, Tiergewebe) sind in breitem Umfang als beispielsweise Nahrungsmittelzusätze, Futterzusatzstoffe, Arzneimittel, chemische Reagentien und industrielle Rohmaterialen verwendet worden. Darüberhinaus ist die Isolierung und Reinigung von Proteinen durch verschiedenartige Methoden erreicht worden. Beispielsweise wird die Isolierung und Reinigung durch Ausfällung von Proteinen mit Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder organischen Lösungsmitteln (z.B. Aceton, Äthanol) oder durch Adsorption von Proteinen auf aktivierter Kohle oder Tonerde erreicht. Die Isolierung und Reinigung kann auch durch Filtration einer Rohproteinlösung durch das Gel eines vernetzten Dextrans oder Polyacrylamides oder durch Säulenchromatografie oder durch Ionenaustauscherharze durchgeführt werden. Die angeführten Ausfällungsmethodiken bringen jedoch eine Co-Ausfällung anderer hochmolekularer Verbindungen oder anorganischer Materialien mit sich und bewirken manchmal den teilweisen oder gesamten Verlust der biologischen Aktivität der Enzyme infolge deren Denaturierung. Bei Durchführung der Adsorptions- und chromatografisehen Methodiken werden verschiedenartige organische Verbindungen zusammen mit Proteinen an den angewandten Adsorbent!en oder Ionenaustauscherharzen adsorbiert. Aus diesem Grunde sind Proteine, die durch diese Adsorptionsmethodiken oder chromatografisehen Verfahren gewonnen worden sind, üblicherweise mit von Proteinen unterschiedlichen Bestandteilen verunreinigt. Die Gelfiltration kann zur Gewinnung von Proteinen in hoher Reinheit ohne Verunreinigung durch niedermolekulare Verbindungen nützlich sein. Die Gelfiltration stellt jedoch eine arbeitsaufwendige Technik dar, wobei es schwierig ist, eine grössere Menge an Rohproteinlösung durch das Gel zu filtrieren.
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Andererseits sind immob.i lisierte Enzyme (d.h. Enzyme die an Träger gebunden worden sind) in den letzten Jahren zu Bedeutung gelangt /Annual Review of Biochemistry, Bd. 35, Teil II, P.D. Boyer, Herausgeber; Annual Review Inc. Palo Alto, Calif; S. 873-908; 19667· Die immobilisierten Enzyme können als heterogene Katalysatoren in Suspensions- oder Säulenform verwendet werden und können nach den heterogenen Reaktionen leicht aus den Reaktionsgemischen entfernt werden. Darüberhinaus können die immobilisierten Enzyme wiederholt zur Induzierung spezifischer chemischer Veränderungen in grossen Substratmengen herangezogen werden. In diesem Zusammenhang sind verschiedenartige Methodiken der Immobilisierung von Enzymen bekannt geworden, unter Einschluss von (a) einer covalenten Bindung der Enzyme an geeignete wasserunlösliche Träger, wie Halogenacetyl-Polysaccharide; (b) ionische Bindung an Träger wie DEAE-Zellulose oder DEAE-Sephadex; (c) physikalische Adsorption an inerte Träger oder synthetische Ionenaustauscherharze; (d) covalente Vernetzung der Enzyme durch bifunktionelle Agentien; (e) Einschluss innerhalb des Gelgitters von Polyacrylamiden; und (f) Mikroumkapselung der Enzyme mit semipermeablen Nylonmembranen. Zur spezifischen Veranschaulichung der vorstehend erwähnten Methodik (c) wird darauf hingewiesen, dass diese durch physikalische Adsorption von Enzymen auf Aktivkohle oder porösem Glas durchgeführt worden ist /ÜS-PS 271 785 Enzymologia, 3^, 12 (197Ο]_7·
Diese bekannten Verfahren erreichen durch einfache Vorgänge, dass die immobilisierten Zubereitungen eine hohe enzymatische Aktivität aufweisen. In den bekannten Fällen wird jedoch eine teilweise oder totale Desorption der Enzyme selbst unter milden Bedingungen erreicht, beispielsweise durch Veränderung des
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pH-Wertes oder der Temperatur oder durch Zufügung des Substrates -
Es ist nunmehr gefunden worden/dass eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, d.h. Tannin, das an einen Träger durch covalente Bindung oder durch physikalische Adsorption gebunden ist, die ausgeprägte Eigenschaft zur spezifischen und reversiblen Bindung von Proteinen besitzt und als Adsorbens zur Konzentration verdünnter Proteinlösungen verwendet werden kann. Die wasserunlösliche Tanninzubereitung kann auch als Adsorbens zur Trennung von Proteinen aus Rohproteinlösung oder selbst zur selektiven Entfernung von Protein-Verunreinigungsstoffen aus einem Gemisch verschiedenartiger Verbindungen verwendet werden. Darüberhinaus ist gefunden worden, dass eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, auf der ein katalytisch aktives Enzym adsorbiert worden ist, als heterogener Katalysator zur Induzierung chemischer oder enzymatischer Reaktionen nützlich ist. Enzyme werden auf der Tanninzubereitung ohne wesentliche Denaturierung fest gebunden und es wird selbst unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktionen oder selbst bei Zufügung einer überschüssigen
Menge an Substraten, keine feststellbare Desorption der Enzyme erreicht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine wasserunlösliche Tanninzubereitung zu schaffen, die eine spezielle und einzigartige Affinität gegenüber Proteinen besitzt und als
Adsorbens für Proteine verwendbar ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung wird in der Schaffung eines Adsorbenses gesehen, welches für die selektive Isolierung, Reinigung oder Trennung
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von Proteinen und selbst für die selektive Entfernung von Proteinverunreinigungsstoffen aus einem Gemisch von Verbindungen verwendet werden kann. Eine weitere Aufgabe besteht in der Schaffung einer Methodik der Herstellung der unlöslichen Tanninzubereitung. Weitere Aufgaben werden in der Schaffung eines neuartigen immobilisierten Enzyms gesehen, welches eine hohe enzymatische Aktivität während eines langen Zeitraums ergibt und gleichzeitig die Wiederverwendung in einer Reihe nachfolgender Vorgänge gestattet. Weitere, der Erfindung zugrundeliegende Aufgaben ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
Im folgenden Abschnitt werden die beigefügten Zeichnungen erläutert.
Die Fig. 1 bis 6 zeigen die Aktivierungsreaktionen der Hydroxy- und Amino-Polymeren. Die Fig. 7 bis 9 zeigen die Aktivierungsreaktion von Tannin. Die Synthese von Hydroxy-Polymeren, Amino-Polymeren und Carboxyl-Polymeren ist in den Fig. 10 bis 11, 12 bis 15 und 16 bis 18 jeweils gezeigt. Die Fig. 19 bis 27 zeigen die Synthese wasserunlöslicher Tanninzubereitungen-Darüberhinaus zeigen die Fig. 28 bis 30 und Fig. 31 die Synthese von Alkylpolymeren und Phenoxyalkyl-Polymeren. In der
•—ν —OH
Beschreibung und in deren Zeichnungen bedeuten (T) und
(T)-OH Tannin, (?) ~°^, (p)Iq^/ (?)-OH und (p) -OH Hydroxy-Polymeren, (P)-NH2 und (g)-NH- bedeuten Amino-Polymeren und (?) -COOH und (g) -COOH bedeuten Carboxyl-Polymeren.Darüberhinaus bedeuten in der Beschreibung und in den Zeichnungen jeweils η und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 und A stellt eine Gruppe der Formel -(CH2) - oder -0(CH2) 0- dar, worin q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
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Nachstehend wird nun die Erfindung unter Einschluss von bevorzugten Ausführungsformen hiervon beschrieben. Gemäss der Erfindung kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung durch covalente Bindung oder physikalische Adsorption von Tannin auf einem wasserunlöslichen, hydrophilen Träger hergestellt werden. Insbesondere wird die Tanninzubereitung entweder durch Bindung von Tannin und des wasserunlöslichen hydrophilen Trägers durch zumindest eine divalente funktioneile Gruppe oder durch einfache Kontaktierung des Tannins mit dem wasserunlöslichen hydrophilen Träger hergestellt. Durch die Bezeichnung "hydrophil", die hier verwendet wird, wird angegeben, dass das Polymere in Wasser benetzbar oder quellbar gemacht ist, hierin im wesentlichen jedoch nicht löslich ist. Verschiedenartige Polymeren, die diese Eigenschaften aufweisen, können in der Erfindung verwendet werden. Derartige Polymeren schliessen beispielsweise Polymeren ein, die Hydroxy-, Amino-, Carboxyl-, Alkyl- oder Phenoxyalkyl-Gruppen (d.h. Hydroxy-Polymere, Amino-Polymere, Carboxy-Polymere, Alkyl-Polymere und Phenoxyalkyl-Polymere) aufweisen. Polysaccharide, wie Zellulose, Agarose und vernetztes Dextran (z.B. Dextran vernetzt mit Epichlorhydrin oder Divinylsulfon) sind als Hydroxypolymeren geeignet. Gemäss der Erfindung können jedoch derartige Hydroxypolmeren vor der Bindung des Tannins hieran mit zumindest einem bifunktionellen Reagens unter Erhalt weiterer geeigneter Hydroxy-Polymeren modifiziert werden. Beispielsweise werden die Hydroxypolymeren, wie die Polysaccharide mit Cyanhalogenid (z.B. Bromcyan) oder Epihalogenhydrin (z.B. Epichlorhydrin) behandelt, wobei die erhaltenen Cyanhalogenid- oder Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxy-Polymeren sodann mit Aminoalkanolen (z.B. Aminomethanol, Aminoäthanol, Aminopropanol oder Alkylendiol (z.B. Methylenglykol, Xthylenglykol,
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Tetramethylenglykol, Hexamethylenglykol) jeweils umgesetzt werden. Die hierdurch erhaltenen Hydroxyalkyl-Polymeren, wie Hydroxyalkyl-Polysaccharide, können auch als die Hydroxy-Polymeren der Erfindung verwendet werden. Die Aktivierungsreaktion der Hydroxy-Polymeren mit Cyanhalogenid oder Epihalogenhydrin /Fig. (1) oder (2)J kann bei 4 bis 4O°C bei pH 8 bis (im Fall der Verwendung von Cyanhalogenid) oder bei 30 bis 100°C bei pH 9 bis 14 (im Fall der Verwendung von Epihalogenhydrin) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Wenn Zellulose als Hydroxy-Polymeres herangezogen wird, ist es bevorzugt, dieses Polymere mit einem Alkalimetallhydroxid (z.B. Natriumhydroxid) vor der Reaktion mit Cyanhalogenid oder Epihalogenhydrin zu behandeln. Andererseits kann die Reaktion der Cyanhalogenid-aktivierten Hydroxy-Polymeren mit Aminoalkanolen /Fig. (10)7 bei 8 bis 40°c bei PH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Die Reaktion des Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxy-Polymeren mit Alkylendiolen /Fig. (112.7 kann bei bis 1000C bei pH 9 bis 14 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden.
Geeignete Beispiele der Amino-Polymeren schliessen Aminobenzyl-Polysaccharide (z.B. p-Aminobenzyl-zellulose), vernetzte Polyacrylamide (z.B. Polyacrylamid vernetzt mit N,N1-Methylenbis-acrylamid), vernetztes p-Aminophenyl-polyacrylamid (z.B. p-Aminophenyl-polyacrylamid vernetzt mit Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid), vernetztes p-Aminobenzamidoäthyl-polyacrylamid (z.B. p-Aminobenzamidoäthyl-polyacrylamid vernetzt mit Ν,Ν1-Methylen-bis-acrylamid), p-Aminobenzamido-poröses Glas, p-Aminophenylalanin-Leucin-Copolymere, p-Aminopolystyrol, Methacrylsäure-m-Aminostyrol-Copolymere, Aminoalkyl-scleroprotein
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-y- is
(z.B. Aminohexyl-Wolle, Aminohexyl-Seide) und vernetzte Aminoalkyl-polymethacrylsäure (z.B. Aininohexy!.polystyrol vernetzt mit Divinylbenzol) ein. Amino-Polymere,die aus Hydroxy-Polymeren durch Anwendung geeigneter bifunktioneller Reagentien hergestellt worden sind, können auch in der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise ergibt die Reaktion von Alkylend!aminen mit den Cyanhalogenid-aktivierten Hydroxy-Polymeren oder die Reaktion von Alkylen-diaminen mit den Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxy-Polymeren die entsprechenden Aminoalkyl-Polymeren, wobei diese Aminoalkyl-Polymeren als dlßAmino-Polymeren der Erfindung Verwendung finden können. Bevorzugte Beispiele derartiger Aminoalkyl-Polymeren schliessen Aminoalkyl-Polysaccharide wie Aminoäthyl-Zellulose, Aminobutyl-Zellulose, Aminohexyl-Zellulose, Aminooctyl-Zellulose, Aminododecyl-Zellulose, Aminoäthyl-Agarose und Aminohexyl-Agarose ein. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Cyanhaiogenid-aktivierten Hydroxy-Polymeren /Fig. (12)7 kann bei 4 bis 400C bei pH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden, wobei verschiedenartige Alkylendiamine, wie Äthylendiamin, Tetramethylendiamin, Hexamethylendiamin, Octamethylendiamin, Decamethylendiamin und Dodecamethylendiamin für diese Reaktion Verwendung finden körinen. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxy-Polymeren /Fig. (13)7 kan" bei 30 bis 1000C bei pH 9 bis 14 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Darüberhinaus können die Amino-Polymeren der Erfindung durch Reaktion von Alkylendiamin mit diazotierten Aminopolymeren, wie diazotierter p-Aminobenzyl-Zellulose oder diazotiertem p-Aminophenyl-Polyacrylamid vernetzt mit N,N'-Methylen-bisacrylamid oder durch Umsetzung von Alkylendiaminen mit
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Carboxyl-Polymeren, wie Carboxymethyl-Polysaccharid, hergestellt werden. Durch diese Reaktion kann ein Aminoalkyl-Polysaccharid der Formel (p)-OCH2CONK (CH2) mNH2 aus dem Carboxymethyl-Polysaccharid erhalten werden. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit diazotierten Amino-Polymeren ^Fig. (14^7 kann bei 4 bis 20°C bei pH 7,5 bis 10 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Andererseits kann die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Carboxyl-Polymeren ^Fig. (15^.7 durch deren Behandlung bei 4 bis 40 C in Gegenwart eines Carbodiimid-Reagenses (z.B. 1-Äthyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid, i-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid oder eines Woodward-Reagenses (d.h. 2-Äthyl-5-m-sulfenyl-isooxazolium-hydroxid) in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt werden. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Carboxyl-Polymeren kann auch durch Umwandlung der Carboxyl-Polymeren in die entsprechenden reaktiven Derivate (z.B. Säureacid, Säurehalogenid, N-Hydroxy-succinimidester) und sodann der reaktiven Derivate mit den Alkylendiaminen durchgeführt werden.
Beispiele von Polymeren, die Carboxylgruppen aufweisen (d.h. Carboxyl-Polymeren) schliessen vernetzte Polymethacrylsäure, wie Polymethacrylsäure vernetzt mit Divinylbenzol; vernetztes Carboxymethyl-Polyacrylamid, wie Carboxymethyl-Polyacrylamid vernetzt mit N,N'-Methylen-bis-acrylamid; und Carboxyalkyl-Polysaccharid,wie Carboxymethyl-Zellulose, Carboxyäthyl-Zellulose, Carboxybutyl-Zellulose, Carboxyhexyl-Zellulose, Carboxymethyl-Agarose, Carboxyäthyl-Agarose, Carboxybutyl-Agarose oder Carboxyhexyl-Agarose ein. Die Carboxyalkyl-Polysaccharide können durch Umsetzung der Cyanhalogenid- oder Epinalogenhydrid-aktivierten Polysaccharide
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mit Aminoalkansäuren, wie Aminoessigsäure, Aminopropionsäure, Aminohexansäure oder Aminoheptansäure, hergestellt werden. Die Reaktion ^Fig. (16) oder (17? kann leicht bei 4 bis 4O°C bei pH 8 bis 12 (im Fall der Verwendung von Cyanhalogenid-aktiviertem Polysaccharid) oder bei 30 bis 100°C bei pH 9 bis 14 (im Fall der Verwendung von Epihalogenhydrinaktiviertem Polysaccharid) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.H. Wasser) durchgeführt werden. In alternativer Weise können die Carboxyalkyl-Polysaccharide durch Umsetzung von Amino-Polymeren mit Bernsteinsäureanhydrid ^Fig. (182.7 hergestellt werden. Diese Reaktion kann bei 4 bis 4O°C bei pH 4,5 bis 6 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Andere Beispiele der wasserunlöslichen hydrophilen Träger, die gemäss der Erfindung verwendet werden können, umfassen faserförmige Scleroproteine, wie Wolle oder Seide. Diese Scleroproteine enthalten sowohl Aminogruppen als auch Carboxylgruppen in ihren Molekülen und können entweder als Amino-Polymeres oder als Carboxyl-Polymeres Verwendung finden.
"Tannin" stellt die allgemeine Bezeichnung für astringierende, aromatische, saure Glukoside oder Polyphenole dar, die in verschiedenen Pflanzen und Bäumen gefunden und in Abhängigkeit von ihrer Struktur in zwei Gruppen unterteilt werden können: (a) Pyrogallol-Tannin (d.h. Mono-, Di- und/oder Trigalloylmonosaccharide, Mono-, Di- und/oder TrLgalloyl-disaccharoide und Mono-, Di- und/oder Trigalloyl-trisaccharide); (b) Catechol-Tannin (d.h. Polyhydroxy-Phenolkondensate und Polyhydroxy-Flavankondensate). Beispiele des Pyrogallol-Tannines umfassen Gallo-Tannin, Penta-GalloyIglukose, Hamameli-Tannin und
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Acetannin. Beispiele von Catechol-Tannin schliessen PoIycatechol, Polyepicatechol, Polycatechin, Poly(pistaciacatechol) und Poly(galloyl-epicatechol) ein. Alle diese Pyrogallol und Catechol-Tannine können in der Erfindung Anwendung finden. Zur Herstellung der wasserunlöslichen Tanninzubereitung müssen diese Tannine jedoch nicht notwendigerweise in reinen Formen vorliegen, weshalb aus Pflanzen und Bäumen erhaltene rohe Produkte ohne Reinigung Verwendung finden können. Beispielsweise können rohe Pyrogallol-Tannine, wie chinesisches Gallo-Tannin oder Nussgallen-Tannin und rohe Catechol-Tannine, wie Persimon-Tannin, vorzugsweise für die erfindungsgemässen Zwecke verwendet werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung durch Umsetzung von entweder Tannin oder des wasserunlöslichen hydrophilen Trägers (wobei der Träger entweder ein Hydroxy-Polymeres oder ein Amino-Polymeres darstellt) mit zumindest einem bifunktionellen Reagens unter Erhalt eines aktivierten Tannins oder Trägers und anschliessende Umsetzung des aktivierten Tannins oder Trägers mit dem Träger oder Tannin hergestellt werden. Die bifunktionellen Reagensien können entweder (i) ein "homo"-bifunktionelles Reagens, das zwei identische funktionelie Gruppen aufweist, wie z.B. Alkylenbisepoxid oder (ii) ein "hetero"-bifunktionelles Reagens, das zwei verschiedene funktioneile Gruppen aufweist,wie Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin oder Halogenalkanoylhalogenid, darstellen. Beispiele des bifunktionellen Reagenses, welches zur Aktivierung von Tannin und des Hydroxy-Polymeren verwendet werden können, schliessen Cyanhalogenid,Epihalogenhydrin und Alkylenbisepoxide, wie dL,U< -Bis (2,3-epoxypropyl) -alkan oder ck, OJ-Bis-
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(2,3-epoxypropoxy) alkan ein. Das EIpihalogenhydrin und das Alkylenbisepoxid können auchzur Aktivierung des Amino-Polymeren verwendet werden. Darüberhinaus kann das Halogenaikanoylhalogenid zur Aktivierung des Hydroxy-Polymeren Anwendung finden. Beispiele von Cyanhalogenid und Epihalogenhydrln schliessen Cyanchlorid, Cyanbromid, Epichlorhydrin und Epibromhydrin ein. Bevorzugte Beispiele des Alkylenbisepoxides (d.h. eine Verbindung der Formel:
O O
CH2CHCiJ - A - CH2CHCH2 )
schliessen jene mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie A,u2-Bis(2,3-epoxypropyl)äthan, Λ,Οο -Bis(2,3-epoxypropyl)butan oder öo,Oo-Bis (2,3-epoxypiopoxy)butan ein. Bevorzugte Beispiele des Halogenalkanoylhalogenides (d.h. einer Verbindung der Formel: X(CH-) COX ) schliessen jene mit 2 bis 16 Kohlen-
z m
stoffatomen, wie Chloracetylchlorid oder Bromacetylbromid ein. Bei Herstellung der wasserunlöslichen Tanninzubereitung gemäsä der Erfindung können entweder Tannin oder das Hydroxy- oder Amino-Polymere zuerst aktiviert werden. Wenn diese Aktivierung unddie nachfolgenden Kupplungsreaktionen dadurch veranschaulicht werden, dass man die in den Zeichnungen gezeigten Reaktionsformeln in Betracht zieht, kann die Aktivierung des Tannins oder des Hydroxy-Polymeren mit Cyanhalogenid /Fig. (1) oder {1)J bei 4 bis 40°C bei pH 8 bis in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Andererseits kann die Aktivierung des Tannins oder des Hydroxy- oder Amino-Polymeren mit Epihalogenhydrin oder Alkylenbisepoxid /Fig. (2), (3), (4), (5), (8) oder (9)_7 bei
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30 bis 7O°C bei pH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) aurchgeführt werden. Die Aktivierungsreaktion des Hydroxy-Polymeren mit dem Halogenalkanoylhalogenid /Fig. (6^7 kann bei 4 bis 40°C in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Die Reaktion des Tannins mit dem Epihalogenhydrin- oder Alkylen-bis-epoxid-aktivierten Hydroxy- oder Amino-Polymeren, welches hierdurch erhalten wird /Fig. (19), (20) oder (21^7 ergibt eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, in der Tannin covalent an das Hydroxy- oder Amino-Polymere durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2- oder -CH2CH(OH)CH0-A-CH2CH(OH)Ch2- gebunden ist. In ähnlicher Weise ergibt die Reaktion des Epihalogenhydrin- oder Alkylenbisepoxid-aktivjerten Tannins mit dem Hydroxy- oder Amino-Polymeren /Fig. (23) oder (24)_7 eine Tanninzubereitung, in der Tannin covalent an die Hydroxy- oder Amino-Polymeren durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2- oder -CH2CH (OH)CH2-A-CH2CH (OH) abgebunden ist. Nochspezifischer ausgedrückt kann z.B. eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, in der Tannin an das PoIysaccharid durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2- oder -CH2CH(OH)CH2NH(CH2) -Y- (Y stellt eine Gruppe der Formel dar: -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH,,-) gebunden ist, aus Polysaccharid, dem Aminoalkylpolysaccharid, das in den Fig. (12) oder (13) gezeigt ist oder dem Aminoalkyl-Polysaccharid der Formel: (P)-OCH0CONH(CH9) NH_ durch deren Einsatz als Hydroxy- oder Amino-Polymeren, die in den Reaktionen der Fig. (19), (21) oder (23) jeweils gezeigt sind, hergestellt werden. Die Reaktion des Tannins mit dem Epihalogenhydrir.- oder Alkylenbisepoxid-aktivierten Hydroxy- oder Amino-Polymeren kann bei 30 bis 70°C bei einem pH von 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Die Reaktion des Epihalogenhydrin- oder
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Alkylenbisepoxid-aktivierten Tannins mit dem Hydroxy- oder Amino-Polymeren kann bei 30 bis 700C bei pH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. In alternativer Weise kann eine Tanninzubereitung, in der Tannin an das Amino-Polymere covalent gebunden ist, durch die Bindung: -CONH- durch Umsetzung von Cyanhalogenid-aktiviertem Tannin mit dem Amino-Polymeren /Fig. (22)_7 hergestellt werden. Beispielsweise kann Tannin, das an Polysaccharid gebunden ist durch die Bindung: -CONH(CH2Jn-Y- (Y besitzt die vorstehende Bedeutung) aus den in den Fig. (12) oder (13) gezeigten Aminoalkyl-Polysacchariden oder jenen der Formel: (^)-OCH2CONH(CH2) NH2 erhalten werden. Die Reaktion des Amino-Polymeren mit Cyanhalogen-aktiviertem Tannin kann bei 4 bis 40°C bei pH 4,5 bis 6 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden.
Um die wasserunlösliche Tanninzubereitung herzustellen, können die vorstehend erwähnten bifunktionellen Reagentien, wie Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, Alkylenbisepoxid und Halogenelkanoylhalogenid in Kombination mit zumindest einem anderen bifunktionellen Reagens, wie Alkylendiamin, Aminoalkanol oder Aminoalkansäure, verwendet werden. Das heisst, die wasserunlösliche Tanninzubereitung kann aus dem aktivierten Tannin /d.h. Tannin aktiviert mit Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, a,, ^-Bis (2,3-epoxypropyl) alkan oder cn/,u> -Bis(2,3-epoxypropoxy)alkan7 durch dessen Umsetzung mit Alkylendiamin oder Aminoalkanol unter Erhalt eines Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannins, Umsetzung entweder des Tanninderivates oder des Hydroxy- oder Amino-Polymeren mit Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, συ, U;-Bis(2,3-epoxypropyl) alkan, oc, Uj-Bis (2,3-epoxypropoxy) alkan oder
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Halogenalkanoylhalogenid unter Erhalt eines aktivierten Tanninderivates oder Polymeren und anschliessende Umsetzung des aktivierten Tanninderivates mit dem Hydroxy- oder Amino-Polymeren oder des aktivierten Polymeren mit dem Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannin hergestellt werden. Die wasserunlösliche Tanninzubereitung kann auch durch Kondensation des Aminoalkyl-Tannins mit dem Carboxy-Polymeren erzeugt werden. In alternativer Weise kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung durch Reaktion von Tannin mit Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, "^-,^ -Bis (2 , 3-epoxypropyl) aikan oder ov/,U,-Bis-(2,3-epoxypropoxy)alkan unter Erhalt eines aktivierten Tannins, Umsetzung des aktivierten Tannins mit Aminoalkansäure unter Erhalt eines Carboxyalkyl-Tannins und sodann des Carboxyalkyltannins mit dem Amino-Polymer erzeugt werden. Um diese Reaktionen spezifischer zu veranschaulichen,sei angegeben, dass das Cyanhalogenid-aktivierte Tannin mit Alkylendiamin, Aminoalkanol oder Aminoalkansäure unter Erhalt des entsprechenden Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Carboxyalkyl-Tannins /Fig. (25-1), (25-2) oder [2S-Z)J umgesetzt wird. Das Aminoalkyl-Tannin und das Carboxyalkyl-Tannin können auch durch Umsetzung des Epihalogenhydrin-aktivierten Tannins mit dem Alkylendiamin oder Aminoalkansäure /Fig. (26-1) oder (26-2^7 hergestellt werden. Beispiele der Alkylendiamine /d.h. eine Verbindung der Formel: H2N(CH2JnNH2 oder H3N (CH^NH^ schliessen jene mit 1 bis Kohlenstoffatomen, wie Äthylendiamin, Tetramethylendiamin, Hexamethylendiamin, Octamethylendiamin, Decamethylendiamin, Dodecamethylendiamin ein. Beispiele des Aminoalkanols /d.h. eine Verbindung der Formel: H2N(CH2JnOH oder H3N(CH2)m0H7 schliessen jene mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie Aminoäthanol, Aminopropanol, Aminobutanol oder Aminopentanol ein. Beispiele der Aminoalkansäure /d.h. H2N(CH2JnCOOH oder
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H2N(CH2)mCOOH7 schliessen jene mit 2 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie Aminoessigsäure, Aminopropionsäure, Aminohexansäure oder Aminoheptansäure, ein. Eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, in der Tannin an das Hydroxypolyroere gebunden ist durch die Bindung: -Y1-(CH3) ^HCO-, -Y1-(CH3) nNHCH2CH (OH)CH3- oder -Y1-(CH2JnNH (CH^CO- (Y1 stellt eine Gruppe der Formel dar: -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH-) kann durch weitere Umsetzung des resultierenden Aminoalkyl-Tannins mit einem Cyanhalogenid-, Epihalogenhydrin- oder Halogenalkanoylhalogenid-aktivierten Hydroxy-Polymeren ^Fig. (25-4), (25-5), (25-6), (26-3) oder (26-4^7 hergestellt werden. Andererseits kann eine wasserunlösliche Tanninzubereitung, in der Tannin an das Hydroxy-Polymere covalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH(CH3) OCH CH(OH)CH2- durch Umsetzung des Hydroxyalkyl-Tannins mit dem Epihalogenhydrin-aktivier ten Hydroxy-Polymeren /Fig. (25—11 )_7 erhalten werden. In alternativer Weise kann eine Tanninzubereitung, in der Tannin an das Carboxyl-Polymere oder Amino-Polymere covalent gebunden ist durch die Bindung: -Y1-(CH2) NHCO oder -γ1-(CH-) CONH- (Y1 besitzt die vorstehend angegebene Bedeutung) derch Umsetzung des Aminoalkyl-Tannins oder Carboxyalkyl-Tannins, welches vorstehend erhalten worden ist, mit dem Cärboxyl-Polymeren oder Amino-Polymeren erhalten werden ^Fig. (25-7), (25-15) oder (26-7^7· Die Reaktion des Cyanhalogenidaktivierten Tannins mit dem Alkylendiamin, Aminoalkanol oder der Aminoalkansäure kann bei 4 bis 40°C bei pH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden, und die Reaktion des Epihalogenhydren-aktivierten Tannins mit dem Alkylendiamin oder der Aminoalkansäure kann bei 30 bis 700C bei pH 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Die Reaktion des Aminoalkyl-Tannins
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mit dem Cyanhalogenid- oder Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxypolymeren kann in gleicher Weise wie im Fall der Reaktionen durchgeführt worden, die in den Fig. (22) oder (23) jeweils gezeigt sind. Tannin, das an Polysaccharid gebunden ist durch die Bindung: -Y'-(CH-) NHCO- oder -Y'-(CH9) NHCH0CH-(CH)CH2-(Y' besitzt die vorstehend angegebene Bedeutung) kann durch Verwendung von Cyanhalogenid-aktiviertem Polysaccharid oder Epihalogenhydrin-aktiviertem Polysaccharid als aktiviertes Polymeres in Fig. (25-4), (25-5), (26-3) oder (26-4) erhalten werden. Die Reaktion des Aminoalkyl-Tannins mit dem Halogenalkanoylhalogenid-aktivierten Hydroxy-Polymer kann bei 4 bis 40°C in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser)durchgeführt werden. Die Reaktion des Hydroxyalkyl-Tannins mit dem Epihalogenhydrin-aktivierten Hydroxy-Polymer kann in gleicher Weise wie im Fall der Reaktion, die in Fig. (23) gezeigt ist, durchgeführt werden und Tannin, das an Polysaccharid gebunden ist durch die Bindung: -CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- wird hierdurch aus Epihalogenhydrin-aktiviertem Polysaccharid erhalten. Die Kondensationsreaktion des Aminoalkyl-Tannins oder des Carboxyalkyl-Tannins mit dem Carboxyl-Polymeren oder Amino-Polymeren kann bei 4 bis 40°C in der Gegenwart eines Carbodiimidreagenzes (z.B. i-Äthyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid, i-Cycloljexyl-3- (2-morpholinoäthyl) -carbodiimid) oder Woodwardreagenz (d.h. 2-Äthyi-5-m-sulfenyl-isooxazoliumhydroxid) in einem Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden. Die Kondensationsreaktion kann auch durch Umwandlung des Carboxyalkyl-Tannins oder Carboxy-Polymeren in das entsprechende reaktive Derivat (z.B. Säureacid, Säurehalogenid, N-Hydroxy-succinimidester) und anschliessende Behandlung des reaktiven Derivates mit dem Amino-Polymeren oder dem Aminoalkyl-Tannin durchgeführt werden. Darüberhinaus kann eine
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wasserunlösliche Tanninzubereitung, in der Tannin an das Hydroxy- oder Amino-Polymere covalent gebunden ist durch die Bindung: -Y'-(CH-) NHCH-CH(OH)CH-- oder -CONH(CH-) -
»m ΓΙ 4m £ £ Γι iij:
OCH2CH(OH)CH2- (Y1 besitzt die vorstehende Bedeutung), durch Umsetzung des Aminoalkyl-Tannins oder Hydroxyalkyl-Tannins mit Epihalogenhydrin unter Erhalt des entsprechenden Epihalogenhydrin-aktivierten Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannins /Fig. (25-8), (25-12) oder (26-5]y und anschliessende Umsetzung des aktivierten Tanninderivates mit dem Hydroxy-Polymeren oder Amino-Polymeren /Fig. (25-9), (25-10), (25-13), (25-14) oder (26-6^7 hergestellt werden. Diese Umsetzung des Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannins mit Epihalogenhydrin kann in gleicher Weise wie im Fall der Reaktion, die in Fig. (8) gezeigt ist, durchgeführt werden. Andererseits kann die Reaktion des Epihalogenhydrin-aktivierten Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannins mit dem Hydroxy- oder Amino-Polymeren in gleicher Weise wie im Fall der Reaktionen durchgeführt werden, die in Fig. (23) gezeigt sind. Tannin, das an Polysaccharid gebunden ist durch die Bindung: -CONH(CH2)nNHCH2CH(OH)CH3-, -CONH(CH2)n~ OCH2CH(OH)CH2- oder -CH2CH(OH)CH3NH(CH2JnNHCH2CH(OH)CH2- kann dadurch erhalten werden, dass man Polysaccharid als Hydroxy-Polymeres in den Reaktionen der Fig. (25-9), (25-13) oder (26-6) verwendet. Wenn das Amino-Polymere als wasserunlöslicher Träger gemäss der Erfindung verwendet wird, kann das Tannin an den Träger ohne Verwendung beliebiger bifunktioneller Reagentien, die vor stehen! erwähnt worden sind, gebunden werden. Beispielsweise kann Tannin direkt an den Träger durch Diazogruppen durch Diazotierung des Amino-Polymeren mit einem Alkalimetallnitrit (z.B. Natriumnitrit) und nachfolgende Reaktion des diazotierten Amino-Polymeren mit Tannin gebunden
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werden. Die Diazotierung kann bei O bis 2O°C in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, während die Kondensationsreaktion des diazotierten Amino-Polymeren mit Tannin /Fig. (27^7 bei 4 bis 2O°C bei pH 7,5 bis 10 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) durchgeführt werden kann. Eine Tanninzubereitung, in der Tannin an das Polysaccharid covalent durch die Bindung
-N=N
gebunden ist, kann durch Verwendung von Aminobenzyl-Polysaccharid als das Amino-Polymere erhalten werden.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die wasserunlösliche Tanninzubereitung durch Adsorption von Tannin
an einem wasserunlöslichen hydrophilen Träger hergestellt. Die Hydroxy-Polymeren, Amino-Polymeren, Carboxyl-Polymeren, Alkyl-Polymeren und Phenoxyalkyl-Polymeren, die vorstehend beschrieben worden sind, können zu diesem Zweck herangezogen werden. Unter diesen sind Aminoalkyl-Polysaccharide, Hydroxyalkyl-Polysaccharide, Carboxyalkyl-Polysaccharide, Alkyl-Polysaccharide und Phenoxyalkyl-Polysaccharide /d.h. ein Polysaccharid, das eine Gruppe
der Formel: ~(CH2^m R besitzt, worin R Wasserstoff, Phenoxy,
Amino, Hydroxy oder Carboxyl darstellt und m eine ganze Zahl
von 1 bis 16 bedeutet.7 besonders für die physikalische Adsorption des Tannins geeignet. Die Aminoalkyl-Polysaccharide,
Hydroxyalkyl-Polysaccharide und Carboxyalkyl-Polysaccharide können in gleicher Weise, wie dies vorstehend angegeben worden ist, hergestellt werden. Andererseits kann das Alkyl-Polysaccharid
(z.B. Methyl-Polysaccharid, Xthyl-Polysaccharid, Propyl-Polysaccharid,
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Butyl-Polysaccharid, Hexyl-Polysaccharid, Octyl-Polysaccharid, Decyl-Polysaccharid, Dodecyl-Polysaccharid) dadurch hergestellt werden, dass man (i) ein Cyanhalogenid-aktiviertes Polysaccharid oder Epihalogenhydrin-aktiviertes PoIysaccharid mit einem Alkylamin mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen (z.B. Methylamin, Äthylamin, Propylamin, Butylamin, Hexylamin, Octylamin, Decylamin, Dodecylamin) umsetzt; oder (ii) Poiysaccharid mit einem Alkylglyzidyläther (z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Hexyl-, Octyl-, Decyl- oder Dodecyläther von 2,3-Epoxypropanol) umsetzt. Zellulose, Agarose und vernetztes Dextran sind als Polysaccharid geeignet. Darüberhinaus kann das Phenoxyalkyl-Polysaccharid durch Umsetzung von Polysaccharid mit Phenylglyzidyläther (d.h. Phenyläther von 2,3-Epoxypropanol) hergestellt werden. Die Reaktion des Cyanhalogenid-aktivierten Polysaccharides oder Epihalogenhydrinaktivierten Polysaccharides mit dem Alkylamin ^Fig. (28) oder (29)_7 können bei 4 bis 40°C bei pH 8 bis 12 (im Fall der Verwendung von Cyanhalogenid-aktivierten Polysaccharid) oder bei 30 bis 100°C bei pH 9 bis 14 (im Fall der Verwendung von Epihalogenhydrin-aktiviertem Polysaccharid) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser durchgeführt werden. Die Reaktion des Polysaccharides mit dem Alkylglyzidyläther oder Phenylglyzidyläther ^Fig. (30) oder (31)7 kann bel 30 bis 100°C in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, oder einem wässrigen Alkanol (z.B. wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol) durchgeführt werden. Die physikalische Absorption des Tannins an dem wasserunlöslichen, hydrophilen Träger wird leicht durch Kontaktierung des Tannins mit dem Träger in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erreicht. Beispielsweise wird die physikalische Adsorption dadurch durchgeführt, dass
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man den Träger zu einer wässrigen Tanninlösung hinzugibt und anschliessend das Gemisch bei einer Temperatur von etwa O bis 5O°C bei einem pH von 3 bis 10 stehen lässt. Eine bevorzugte Konzentration des Tannins in der Lösung kann etwa 0,5 bis etwa 1,0 Gew./Vol.% (w/v-%) darstellen. Nach der vorstehend angeführten Behandlung kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung durch Filtration oder Zentrifugieren wiedergewonnen werden.
Anwendung (1):
Die wasserunlösliche Zubereitung gemäss der Erfindung hat eine spezifische und einzigartige Affinität gegenüber Proteinen und kann zur Immobilisierung oder Insolubilisierung von Enzymen verwendet werden. Das heisst, ein immobilisiertes Enzym wird durch physikalische Adsorption des Enzyms an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung hergestellt. Alle katalytisch aktiven Enzyme können für diesen Zweck vorzugsweise verwendet v/erden. Beispielsweise umfassen Enzyme, die zur Herstellung von deren immobilisierten Zubereitungen herangezogen werden können Oxidoreduktasen, wie Aminosäureoxidase, Uricase, Catalase, Xanthinoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glutamat-dehydrogenase, Cytochrom-C-oxidase, Tyrosinase, Lactat-dehydrogenase, Peroxidase, 6-Phosphogluconat-dehydrogenase und Malat-dehydrogenase; Transferasen, wie Aspartat-acetyltransferase, Aspartat-aminotransferase, Glycin-aminotransferase, glutamin-oxalessigsäure-aminotransferase, Glutam-brenztraubenaminotransferase, Creatin-phosphorkinase, Histaminmethyltransferase, Pyruvat-kinase, Fructokinase, Hexokinase, £-Lysinacety!transferase und Leucir.-aminopeptidase; Hydrolasen, wie Asparaginase, Acetylcholinesterase, Aminoacylase, Amyläse,
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Arginase, L-Arginin-deiminase, Invertase, urease, Uricase, Esterase* ß-Galactosidase, Kallikrein, Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Naringinase, Nucleotidase, Papain, Hyaluronidase, Plasimin, Pectinase, Hesperidinase, Pepsin, Penicillinase, Penicillin-amidase, Pnospholipase, Phosphatase, Lactase, Lipase, Ribonuclease und Renin; Lyasen, wie Aspartat-decarboxylase, Aspartase, Citrat-lyase, Glutamat-decarboxylase, Histidinammoniak-lyase, Phenylalanin-ammoniak-lyase, Fumarase, Fumarathydratase und Malatsynthetase; Isomerasen, wie Alaninracemase, Glucose-isomerase, Glucosephosphat-isomerase, Glutamat-racemase, Lactat-racemase, und Methionin-racemase; und Lygasen, wie Asparagin-synthetase, Glutathion-synthetase und Pyrovat-synthetase. Die vorstehend angeführten Enzyme liegen nicht notwendigerweise in reiner Form vor, sondern auch rohe Enzymlösungen können per se in der Immobilisierungsstufe der Erfindung angewandt werden. Beispielsweise können Extrakte pflanzlicher odex tierischer Gewebe und die zellfreien Extrakte von Mikroorganismen vorzugsweise als die Enzymlösung verwendet werden. Diese Extrakte können naturgemäss vor der Verwendung in der Erfindung teilweise gereinigt werden. Darüberhinaus kann die Immobilisierung der Erfindung dadurch durchgeführt werden, dass man ein Gemisch von zwei oder mehreren Enzymen, die vorstehend angeführt worden sind, verwendet. Die physikalische Adsorption des Enzyms an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung (d.h. die Immobilisierung des Enzyms) kann dadurch erreicht werden, dass man das Enzym mit der wasserunlöslichen Tanninzubereitung in einem wässrigen Lösungsmittel in Berührung bringt. Beispielsweise wird das Enzym in Wasser aufgelöst. Die wasserunlösliche Tanninzubereitung wird in der Enzymlösung suspendiert und die Suspension gerührt. Durch diesen Vorgang wird das Enzym spezifisch an der Tanninzubereitung adsorbiert und die anderen Verbindungen, wie RNA,
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DNA, Saccharide und Verbindungen niedrigen Molekulargewichtes, verbleiben in der Suspension gelöst. Nach dem Vorgang kann daher das immobilisierte Enzym gemäss der Erfindung leicht durch Filtration oder Zentrifugieren der Suspension zur Sammlung und nachfolgendes Waschen dieser Fällungen mit einer geeigneten Pufferlösung und/oder Wasser erhalten werden. In alternativer Weise kann die physikalische Adsorption des Enzyms an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung durch eine Säulenmethodik erreicht werden. Beispielsweise wird die wasserunlösliche Tanninzubereitung in eine Säule eingefüllt. Durch Durchführung einer Enzymlösung durch die Säule mit einer geeigneten Fliessgeschwindigkeit(z.B. mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,1 bis 100 Std~ ) wird das Enzym spezifisch an der Säule der Tanninzubereitung adsorbiert und andere Verbindungen werden in den ausfliessenden Stoffen eluiert. Nach der Behandlung wird ein immobilisiertes Enzym der Erfindung leicht durch Waschen der Säule mit einer geeigneten Pufferlösung und/oder Wasser erhalten. Die vorstehend erwähnte physikalische Adsorption der Enzyme an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 70°C und bei einem pH von 2 bis 12 in einer wässrigen Lösung durchgeführt. Darüberhinaus kann bei Verwendung von Aminoacylase die enzymatische Aktivität einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung dadurch erhöht werden, dass man die vorstehend angeführte Behandlung in Gegenwart eines Alkanols (z.B. Butanol), von Aceton oder eines hydrophoben Lösungsmittels (z.B. Äthylenglykol) durchführt. In jedem Fall behält das immobilisierte Enzym der Erfindung (d.h. das Enzym, das an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung physikalisch adsorbiert ist) das durch die vorstehend angeführten Verfahrensstufen erhalten
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worden ist, ein nohesAusmass der enzymatischen Aktivität während eines langen Zeitraums und ist als heterogener Katalysator zur Induzierung verschiedenartiger enzymatischer Reaktionen verwendbar. Darüberhinaus kann, da die wasserunlösliche Tanninzubereitung das Enzym sehr fest bindet, das immobilisierte Enzym wiederholt für die enzymatische Reaktion mit Substraten verwendet werden, wobei sich keine wesentliche Desorption des gebundenen Enzymes während der enzymatischen Reaktion oder selbst bei Zugabe von Substraten in hoher Konzentration ergibt. Darüberhinaus kann, wenn die Aktivität des immobilisierten Enzymes durch dessen wiederholte Anwendung verringert wird, die Aktivität des Enzymes dadurch wiederhergestellt werden, dass man es mit einer Lösung, die 0,01 bis 1,0 n-Chlorwasserstoffsäure, 0,01 bis 0,1 η-Natriumhydroxid, ein oberflächenaktives Agens oder Äthylenglykol enthält, behandelt, mit Wasser wäscht und ctnschliessend es erneut mit einer Enzymlösung in Berührung bringt.
Anwendung (2);
Wie vorstehend kurz erwähnt worden ist, adsorbiert die wasserunlösliche Tanninzubereituny (d.h. Tannin, das an einen wasserunlöslichen, hydrophilen Träger durch covalente Bindung oder physikalische Adsorption gebunden ist) Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Nucleinsäuren und hochmolekulare Verbindungen, die von Proteinen verschieden sind, nicht, zeigt jedoch eine sehr starke Fähigkeit der spezifischen und reversiblen Bindung von Proteinen. Durch Anwendung dieser Eigenschaften kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung der Erfindung als Adsorbens
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zur Trennung oder Isolierung von Protein aus einer Rohproteinlösung oder zur Reinigung der isolierten Proteine verwendet werden. Beispielsweise können Proteine aus einer Rohproteinlösung dadurch abgetrennt werden, dass man sie mit einer wasserunlöslichen Tanninzubereitung zur Adsorption der Proteine an der Tanninzubereitung kontaktiert, die Tanninzubereitung sammelt und anschliessend die Proteine hieraus eluiert. Enzyme, Albumin, Globulin, hormonale Proteine und andere therapeutisch oder industrielle wertvolle Proteine können durch diese Vorgänge leicht gewonnen werden. Andererseits können die Extrakte von Tier- oder Pflanzengewebe, die Fermentierungsbruhen oder die zellfreien Extrakte von Mikroorganismen, die tierischen oder pflanzlichen Sekretionen oder beliebige weitere Proteinlösungen verwendet werden zur Abtrennung von Proteinen, vorausgesetzt, dass die Proteine in diesen Lösungen löslich enthalten sind. Proteine können an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung dadurch adsorbiert werden, dass man die Tanninzubereitung zu der Rohproteinlö- ' sung hinzugibt und das Gemisch während eines Zeitraums von etwa 1 bis 24 Stunden rührt. Es ist bevorzugt, diese Adsorptionsstufe bei O bis 6O°C bei einen pH von etwa 2 bis etwa 12 durchzuführen. Bei Durchführung der Adsorptionsstufe ist es auch bevorzugt, eine Rohproteinlösung zu verwenden, die eine spezifische elektrische Leitfähigkeit von O bis etwa 400 m mho aufweist. Nach der Adsorptionsstufe kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung, an der Proteine adsorbiert sind, leicht durch Filtration oder Zentrifugieren gesammelt werden und durch Elution der Tanninzubereitung mit einem geeigneten Lösungsmittel können die Proteine in hoher Reinheit gewonnen werden. Starke Säurelösungen (z.B. 0,01 bis 1 n-Chlorwasserstoffsäure), stark alkalische Lösungen (z.B. 0,01 bis 1 η-Natriumhydroxid) ,
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wässrige Lösungen von Benetzungsmitteln, wässrige 3 bis 6 m Harnstofflösung, Äthanol und n-Butanol können als Elutionslösungsmittel geeignet sein. Wenn die adsorbierten Proteine Enzyme darstellen, kann auch eine Lösung, die Enzyminhibitoren enthält, als Elutionslösungsmittel angewandt werden. Darüberhinaus können die vorstehend angeführten Adsorptions- und Elutionsstufen durch eine Säulenmethodik durchgeführt werden. Beispielsweise wird die wasserunlösliche Tanninzubereitung in eine Säule eingefüllt. Nachdem die Säule mit Wasser und/oder €>iner Pufferlösung gewaschen worden ist, wird eine Proteinlösung (ph 3 bis 10) durch die Säule mit einer geeigneten Fliessgeschwindigkeit (z.B. einerRaumgeschwindigkeit von 0,01 bis 100 Std" ) durchgeführt. Durch diesen Vorgang werden die Proteine, die in der Lösung enthalten sind, an der Tanninzubereitung adsorbiert, während die anderen Verbindungen mit dem Ausfluss ausgeführt werden. Die adsorbierten Proteine können aus der Säule durch Behandlung der Säule mit den vorstehend erwähnten Elutionslösungsmitteln eluiert werden. In jedem Fall können die Adsorptions- und Elutionsstufen gemäss der Erfindung ohne Denaturierung der Proteine durchgeführt werden und durch Verwendung von Rohenzymlösungenbei diesen Stufen können Enzyme mit hoher biologischer Aktivität ohne Verunreinigung durch Aminosäuren, organische Säuren, Nukleinsäuren und andere hochmolekulare Verbindungen, die von Protein verschieden sind, erhalten werden.
Anwendung (3);
Alkoholische Getränke, wie z.B. der japanische Reiswein, d.h. "Japanischer Sake" (ein aus Reis hergestellter Fermentierungsschnaps), Bier oder Wein, flüssige Sossen, wie Essig- oder
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Sojasossen, und Fruchtsäfte, wie Orangen, Apfel- oder Traubensaft, sind normalerweise mit Proteinen wegen der verwendeten Rohmaterialien oder Mikroorganismen in den Fermentierungs- oder Braustufen verunreinigt. Die enthaltenen Proteine verschlechtern die Qualität dieser flüssigen Produkte. Darüberhinaus werden diese flüssigen Produkte während ihrer Lagerung trübe durch die Proteinverunreinigungsstoffe. Vor dem Vertrieb durch den Handel müssen daher diese Produkte weiter bearbeitet werden, damit sich keine Sedimentierung der Proteine ergibt. Die wasserunlösliche Tanninzubereitung gemäss der Erfindung kann als Adsorbens zur Entfernung der Proteine aus diesen flüssigen Produkten verwendet werden. Beispielsweise werden Proteine, die in diesen Produkten enthalten sind, einfach durch deren Kontaktierung mit der wasserunlöslichen Tanninzubereitung entfernt, wobei die Proteine hieran adsorbiert werden,und anschliessende Filtration oder Zentrifugierung des Gemisches zur Abtrenung der Tanninzubereitung hiervon. Da die wasserunlösliche Tanninzubereitung keine Aminosäuren, Nukleinsäuren oder andere Verbindungen adsorbiert, die den Geschmack, Geruch und/oder dieFarbe beeinflussen, ist die Tanninzubereitung besonders geeignet, Proteinverunreinigungsstoffe aus derartigen flüssigen Produkten zu entfernen ohne deren Qualität zu verändern oder zu beeinträchtigen. In gleicher Weise können Arzneimittel oder chemische Reagentien, die mit Proteinen verunreinigt sind, wie vorstehend angeführt, gereinigt werden. Die verschiedenartigen Lösungen (z.B. alkoholische Getränke, flüssige Würzen, Fruchtsäfte und wasserfreie Lösungen von Therapeutika oder chemischen Reagentien) , die mit der Zubereitung gereinigt worden sind, sind in keinster Weise mit Tannin verunreinigt, da die Tanninzubereitung
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gemäss der Erfindung stabil genug ist, um nicht während der vorstehend angeführten Adsorptionsstufe eine Herauslösung von Tannin zu erfahren. Darüberhinaus können, nachdem die wasserunlösliche Tanninzubereitung, an der Proteine adsorbiert sind, von den flüssigen Produkten abgetrennt etc. ist, die adsorbierten Proteine von der Tanninzubereitung dadurch befreit werden, dass man diese mit einem Elutionslösungsmittel, wie υ,01 bis 1 n-Chlorwasserstoffsäure, 0,01 bis 1 n-Natriumhydroxid oder einer wässrigen oberflächenaktiven Lösung, einer 3 bis 6 m-Harnstofflösung, Äthanol oder n-Butanol behandelt. Die hierdurch wiederhergestellte Tanninzubereitung kann für die vorstehend angeführten gleichen Zwecke wiederholt eingesetzt werden.
Anwendung (4):
Darüberhinaus kann die wasserunlösliche Tanninzubereitung verwendet werden, um eine enzymatische Reaktion zu stoppen. Wenn beispielsweise das Enzym mit dem Substrat während eines ausreichenden Zeitraumes umgesetzt worden ist, kann die Reaktion dadurch gestoppt werden, dass man die Tanninzubereitung zu einem Gemisch von Enzym und Substrat hinzugibt, wodurch das Enzym an der Tanninzubereitung angehaftet wird, wonach man das Gemisch zur Entfernung der Tanninzubereitung filtriert oder zentrifugiert. Gemäss dieser Methodik können selbst Substrate und Reaktionsprodukte, die bei Erhitzung oder bei saurem oder alkalischem pH-Wert instabil sind, ohne Zersetzung aus dem Reaktionsgemisch wiedergewonnen werden, da das Stoppen der enzymatischen Reaktion und die Entfernung der Enzyme hiervon ohne Erhitzung, Ansäuerung oder Alkalifizierung durchgeführt wird.
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Praktische und derzeit bevorzugte Ausführungsformen der
Erfindung werden in den folgenden Beispielen veranschaulicht. In den Beispielen ist die Menge des Proteins nach der Copper-Folin-Methodik, die in "Journal of Biological Chemistry", 193, 265 (1951) angegeben worden ist, bestimmt.
Beispiel 1
(1) 4g Zellulosepulver (hergestellt durch Toyo Roshi Co., unter dem Warenzeichen "Cellulose Powder C") werden in 40 ml einer wässrigen 25 %-igen Natriumhydroxidlösung eingetaucht. 10 ml Epichlorhydrin werden zu der Suspension hinzugegeben und das Gemisch wird bei 60°C während 30 Minuten heftig gerührt. Nach der Reaktion wird die Epichlorhydrinaktivierte Zellulose, die hierdurch erhalten ist, durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und anschliessend in 60 ml einer wässrigen Lösung (pH 10) suspendiert, die Hexamethylendiamin (Gehalt an Hexamethylendiamin: 2,2 g/80 ml) enthält, suspendiert. Die Suspension wird bei 60°C während Stunden langsam gerührt. Sodann werden die ausgefällten Stoffe durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonatlösung und Wasser sukzessive gewaschen. Es werden 10,5 g Aminohexyl-Zellulose in nasser Form erhalten.
(2) 10,5 g chinesisches Gallotannin werden in 240 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 10 eingestellt und es werden 0,3 ml Epichlorhydrin hinzugegeben. Das Gemisch wird bei 300C während 2 Stunden gerührt, wodurch eine Epichlorhydr in-aktivier te chinesische Gallotannin-Lösung erhalten
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wird. 10,5 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose, die in Abschnitt (1) erhalten worden waren, werden zu der Epichlorhydrin-aktivierten chinesischen Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 6 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die ausgefallenen Stoffe durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonatlösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,3 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen xanninzubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose covalent durch die Bindung -CH2-CH(OH)CH2NH-(CH2)g-NHCHjCH(OH)CH3- gebunden ist7 werden hierdurch erhalten.
(3) 200 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 4000 .u Mol/ Std), die aus Aspergiilus orizae erhalten worden waren, werden in 6 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchloridlösung (pH 8,0) aufgelöst, die 0,2 v/v-% n-Butanol enthält. 500 mg (nasse Form) der in Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tanninzubereitung werden zu der Aminoacylase-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 3?°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 530 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung (d.h. Aminoacylase, die an der wasserunlöslichen Tanninzubereitung adsorbiert ist) werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylaseaktivität von 9,376 ,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung /die Aminoacylaseaktivität wird in Mikromolen von L-Methionin angegeben, welche durch Reaktion mit N-Acetyl-DL-methionin bei 37°C bei pH 7,0 erzeugt werden7·
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Beispiel 2
(1) 10,5 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose werden aus 4 g Zellulosepulver in gleicher Weise wie dies in Beispiel 1 beschrieben worden ist, hergestellt. Die Aminohexyl-Zellulose wird in 100 ml wässriger 1 n-Natriumhydroxidlösung suspendiert. 6 ml Epichlorhydrin werden zu der Suspension hinzugegeben und das Gemisch wird bei 60°C während 30 Minuten gerührt. Die Epichlorhydrin-aktivierte Aminohexyl-Zellulose, die hierdurch erhalten wird, wird durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Eine Lösung (pH 10) von 5,2 g chinesischem Gallotannin in 100 ml Wasser wird zu der Epichlorhydrin-aktivierten Aminohexyl-Zellulose hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 6 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 n-Natriumcarbonatlösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,4 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tanninzubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose covalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)-CH2NH-(CH2J6-NHCH2-CH(OH)CH2-7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der in Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tanninzubereitung und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 525 mg einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylaseaktivität von 8900,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung.
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Beispiel 3
(1) 4g Zellulosepulver werden in 40 ml einer wässrigen 25 %-igen Natriumhydroxidlösung bei 25°C während 30 Minuten eingetaucht und anschliessend mit Wasser gewaschen. 10 g der nassen Zellulose werden in 100 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonatlösung suspendiert. Die Suspension wird auf pH 11,5 eingestellt und es werden hierzu 0,4 g Cyanbromid hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 20 bis 25°C während etwa 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei pH 11 bis 11,5 mit einer wässrigen 5 n-Natriumhydroxid-Lösung gehalten. Nach der Reaktion'werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung, die auf etwa 4°C abgekühlt worden ist,und kaltem Wasser sukzessive gewaschen. Es wird eine Cyanbromid-aktivierte Zellulose hierdurch erhalten.
(2) 5,2 g chinesisches GaIlotannin werden in 100 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 11,5 eingestellt. 0,2 g Cyanbromid werden hierzu bei 20°C gegeben und das Gemisch wird bei der gleichen Temperatur während 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei einem pH-Wert von 11 bis 11,5 gehalten. Die hierdurch erhaltene Cyanbromid-aktivierte chinesische Gallotannin-Lösung wird auf pH 10 eingestellt und es wird eine Lösung (pH 10) von 2,3 g Hexamethylendiamin und 30 ml Wasser hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 25°C während 2 Stunden gerührt , wodurch eine Aminohexyl-chinesische Gallotannin-Lösung erhalten wird. Die Cyanbromid-aktivierte Zellulose, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, wird zu der Aminohexylchinesisches Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch
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wird bei 25°C während 20 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und in einer wässrigen 0,1 mNatriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,4 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tanninzubereitung ^d.h. chinesisches GaHotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH0J^-NHCO-? werden hierdurch erhalten.
(3) 500 mg (nasse Form der in Absatz (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tanninzubereitung und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 530 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylasezubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylaseaktivität von 10 600,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung.
Beispiel 4
(1) 4g Zellulosepulver und 0,4 g Cyanbromid werden in gleicher Weise wie in Beispiel 3-(1) beschrieben worden ist, behandelt. Die Cyanbromid-aktivierte Zellulose, die hierdurch erhalten worden ist, wird in 100 ml einer wässrigen Lösung (pH 10), die Hexamethylendiamin enthält (Gehalt an Hexamethylendiamin 2,3 g/100 ml) suspendiert. Die Suspension wird bei 25°C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriurnbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 10,6 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose werden hierdurch erhalten.
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(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin und 0,2 g Cyanbromid werden In gleicher Welse, wie dies In Beispiel 3-(2) beschrieben worden 1st, behandelt. Die hierdurch erhaltene Cyanbromid-aktivierte-chinesisches GaIlotannin-Lösung wird auf pH 10 mit 5 η-Chlorwasserstoffsäure eingestellt und es wird eine Lösung (pH 10) von 2,0 g 6-Aminocapronsäure in 30 ml Wasser hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 25°C während 2 Stunden gerührt, wodurch eine Carboxypentylchinesisches Gallotannin-Lösung erhalten wird. 10,6 g (nasse Form) der in Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-Zellulose werden in der Carboxypentyl - chinesisches Gallotannin-Lösung suspendiert und die Suspension wird auf pH 4,8 eingestellt. 4 ml einerwässrigen 20 %-igen 1-A*thyl-3-(3-dimethylaminopropy1)-carbodiimid-Lösung werden tropfenweise zu der Suspension während etwa 5 Minuten hinzugegeben. Während der tropfenweisen Zufügung wird die Suspension bei etwa pH 4,8 mit 0,5 η-Chlorwasserstoffsäure gehalten. Sodann wird die Suspension bei 28°C während 20 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,5 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tanninzubereitung /3.h. chinesisches Gallotannin das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-NHCO-7 werden hierdurch erhalten.
(3) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung, die in Abschnitt (2) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 530 mg
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(nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 7400,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung.
Beispiel 5
(1) 10,5 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose werden aus 4 g Zellulosepulver in gleicher Weise wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist, hergestellt.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin und 0,2 g Cyanbromid werden in gleicher Weise wie dies in Beispiel 3-(2) beschrieben worden ist, behandelt. Die hierdurch erhaltene Cyanbromidaktiverte-chinesisches Gallotannin-Lösung wird auf einen pH-Wert von 10 mit 5 η-Chlorwasserstoffsäure eingestellt und es wird eine Lösung (pH 10) von 3,1 g .Ethylendiamin in 30 ml Wasser hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 25°C während 2 Stunden gerührt. 0,2 ml Epichlorhydrin werden zu dem Gemisch hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden weitergerührt, wodurch eine Epichlorhydrin-aktivierte Aminoäthyl-chinesisches Gallotannin-Lösung erhalten wird. 10,5 g (nasse Form) der in Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-Zellulose werden zu der Epichlorhydrin-aktivierten Aminoäthyl-chinesisches Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit wässriger 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,1 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tanninzubereitung /d.h. chinesiches Gallotannin,
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das an Zellulose !covalent gebunden 1st durch die Bindung: -CONHCh2CH2NHCH2CH(OH)CH2NH-(CH2)gNHCH2CH(OH)CH3-? werden hierdurch erhalten.
(3) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung, die in Abschnitt (2) erhalten worden ist und mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 505 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zübereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 2900.u Mol/ Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung.
Beispiel 6
(1) 10,6 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose werden aus 4 g Zellulosepulver in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 4-(1) beschrieben worden ist, hergestellt.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin werden in 100 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 11,5 eingestellt und es werden 0,2 g Cyanbromid hinzugegeben. Das Gemisch wird bei 20 bis 25°C während etwa 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei pH 11 bis 11,5 mit 5 η Natriumhydroxid-Lösung gehalten. Die hierdurch erhaltene Cyanbromid-aktivierte-chinesisches GaIlotannin-Lösung wird auf pH 11,0 eingestellt. 10,6 g (nasse Form) der in Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-Zellulose werden in der Cyanbromidaktivierten-chinesisches Gallotannin-Lösung suspendiert und die Suspension wird langsam bei 40°C während 2 Stunden
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gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit wässriger 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,6 g (nasse Form) einer wasserunlösliche Tanninzubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCO-7 werden hierdurch erhalten.
(3) 500 mg (nasse Form) der in Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 530 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 11 OCO ,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tanninzubereitung.
Beispiel 7
(1) 10,5 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. Nussgallen-Tannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCO-7 werden aus 5 g Nussgallen-Tannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist, erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 525 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung
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SS
werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 9 80OyU Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 8
(1) 10,9 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. Persimmon-Tannin, an Zellulose !covalent gebunden durch die Bindung: -CONH-(CHj)g-NHC0-7 werden aus 100 ml Persimmon-Tannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist, erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 7600 /U Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 9
(1) 10,5 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. Catechol-Tannin, das an Zellulose !covalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCO-7 werden aus 3 g Catechol-Tannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist, hergestellt.
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(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 510 mg (nasse Form einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 2 100,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 10
(1) Eine Aminohexyl-chinesisches Gallotannin-Lösung wird aus 5,2 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 3-(2) beschrieben worden ist, behandelt. 0,3 ml Epichlorhydrin werden zu der Lösung hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 30°C während 2 Stunden gerührt, wonach eine Epichlorhydrin-aktivierte Aminohexylchinesisches Gallotannin-Lösung erhalten wird. 10 g Zellulose /vorbehandelt mit einer Natriumhydroxid-Lösung in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist7 werden zu der Epichlorhydrin-akt!vierten Aminohexyl-chinesisches Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 20 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,0 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin das in Zellulose durch die Bindung -CONH-(CH2Jg-NHCH2CH(OH)CH2-kovalent gebunden ist/ werden hierdurch erhalten.
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(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 510 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 1 200,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 11
(1) Epichlorhydrin-aktivierte Zellulose wird auf 4 g Zellulosepulver in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist, hergestellt. Die Epichlorhydrin-aktivierte Zellulose wird in 80 ml wässriger Lösung (pH 10) die 2-Aminoäthanol (Gehalt an 2-Aminoäthanol: 3,1 g/ 80 ml) enthält, suspendiert. Die Suspension wird bei 60°C während 20 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 10,4 g (nasse Form) Aminoäthyl-Zellulose werden hierdurch erhalten.
(2) 10,5 g chinesisches GaIlotannin werden in 240 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 10 eingestellt und es werden hierzu 0,3 ml Epichlorhydrin hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch bei 30°C während 2 Stunden gerührt, wodurch eine Epichlorhydrin-aktivierte-chinesische Gallotannin-Lösung erhalten wird. 10,4 g (nasse Form) der Aminoäthyl-Zellulose,
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die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, werden zu der Epichlorhydrin-aktivierten-chinesisches Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 3 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 11,1 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung werden hierdurch erhalten /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH-(OH)CH2NHCh2CH2OCH2CH(OH)CH2=7·
(3) 500 mg (nasse Form) der in Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 2410,u Mol/Std/ 10g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 12
(1) Epichlorhydrin-aktivierte Zellulose und eine Aminohexyl-chinesisches Gallotannin-LÖsung werden aus 4 g Zellulosepulver und 5,2 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(1) und Beispiel 3-(2) jeweils beschrieben worden ist, hergestellt. Die Epichlorhydrin-aktivierte Zellulose wird zu der Aminohexyl-chinesische Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 45°C während 4 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge
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durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 10,9 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose !covalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2;7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 530 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 9430 .u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 13
(1) 15 g 2-Hydroxy-3-^4-(2,3-epoxypropyloxy)-butyloxyy-propyl-agarose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals unter dem Warenzeichen "Epoxy-activated Sepharose 6B") werden mit 500 ml Wasser, 500 ml einer wässrigen 0,5 m Natriumchlord-Lösung und 500 ml Wasser sukzessive gewaschen. 1 g chinesisches Gallotannin, aufgelöst in 100 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung, werden zu der Agarose hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch auf pH 10,5 mit einer wässrigen 8 n-Natriumhydroxid-Lösung eingestellt und bei 37 C während 26 Stunden geschüttelt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit 1 1 Wasser
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500 ml einer 0,2 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10) und 1 1 Wasser sukzessive gewaschen. 14,9 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallottannin, das an Agarose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2O-(CH2J4-OCH2CH(OH)CH2=7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abshnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 490 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 800 ,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 14
(1) 4g Agarose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals unter dem Warenzeichen "Sepharose 4B") werden mit 500 ml Wasser, 500 ml wässriger 0,5 m Natriumchlorid-Lösung und 500 ml Wasser sukzessive gewaschen. Die Agarose wird in 500 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung suspendiert. Die Suspension wird auf pH 11,5 eingestellt. 0,4 g Cyanbromid werden zu der Suspension hinzugegeben und das Gemisch wird bei 20 bis 25°C während etwa 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei pH 11 bis 11,5 gehalten. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt, und mit 1 1 einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung (etwa 4°C) und 1 1 kaltem Wasser sukzessive
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gewaschen. Hierdurch wird Cyanbromid-aktivierte Agarose erhalten.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin werden in 100 ml Wasser aufgelöst und auf pH 11,5 eingestellt. 0,2 g Cyanbromid werden zu der Lösung bei 20°C hinzugegeben und das Gemisch wird bei der gleichen Temperatur während 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei pH 11 bis 11,5 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird auf pH 10 mit 5 n-Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Eine Lösung (pH 10) von 2,3 g Hexamethylendiamin in 30 ml Wasser wird zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden weitergerührt, wodurch eine Aminohexylchinesisches GaIlotannin-Lösung erhalten wird. Die in Abschnitt (1) erhaltene Bromid-aktivierte Agarose wird zu der Aminohexyl-chinesisches Gallotannin-Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 3,6 g (trockene Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Agarose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH- (CH2) ß-NHCO1? werden hierdurch erhalten.
(3) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (2) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(3) beschrieben, behandelt. 480 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 2600 ,u Mol/Std/ 10 g
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(nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 15
(1) 4,5 g (trockene Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Divinylsulfon-vernetztes-Dextran kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO1?werden aus 4 g Divinylsulfon-vernetztem-Dextran (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals unter dem Warenzeichen "Sephadex G-100") in gleicher Weise, wie die in Beispiel 14-(2) beschrieben ist, hergestellt.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(3) beschrieben, behandelt. 505 mg (nasse Form) der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 1720-u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 16
(1) 1,3 g chinesisches Gallotannin werden in 50 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 11,5 mit einer wässrigen 5 n-Natriumhydroxid-Lösung eingestellt und es werden 200 mg Cyanbromid hinzugegeben Das Gemisch wird bei 25 C während etwa 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei
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pH 11 bis 11,5 gehalten. Die hierdurch erhaltene Cyanbromidaktivierte-chinesisches GaIlotannin-Lösung wird zu 1 g Aminohexyl-Agarose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals unter dem Warenzeichen "AH-Sepharose 4B") (zuvor gewaschen mit 500 ml Wasser, 5OO ml einer wässrigen 0,5 m Natriumchlorid-Lösung und 5OO ml Wasser sukzessive) hinzugegeben und das Gemisch wird bei 30°C während 16 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 1,1 g (trockene Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Agarose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHC0-7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(3) beschrieben behandelt. 510 mg (nasse Form) einer immobilisierten Amlnoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 2 270 .u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 17
(1) 3,6 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCOCHji werden aus 1,3 g chinesischem Gallotannin und 1 g Aminohexyl-Zellulose (hergestellt durch Merck Co. unter dem Warenzeichen
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"AH-Cellulose") werden in gleicherweise, wie dies in Beispiel 16— (1) beschrieben worden ist, hergestellt.
Beispiel 18
(1) 2g p-Aminobenzyl-Zellulose (hergestellt durch Seravac Co unter dem Warenzeichen "PAB-CeIIulose") werden mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend in 50 ml 2 η-Chlorwasserstoffsäure suspendiert, die auf etwa 4°C abgekühlt worden ist. 10 ml einer wässrigen 14 %-igen Natriumnitrat-Lösung, die auf etwa 4°C abgekühlt worden ist, werden tropfenweise zu der Suspension während 5 Minuten unter Rührung hinzugegeben. Die Suspension wird bei O0C während 1 Stunde weitergerührt. Die hierdurch erhaltene diazotierte p-Aminobenzyl-Zellulose wird durch Filtration gesammelt und mit 100 ml einer wässrigen 1 %-igen SuIfansäure-Lösung die auf etwa 4°C abgekühlt worden ist, und 300 ml kaltem Wasser sukzessive gewaschen. Eine Lösung von 1,3 g chinesischem Gallotannin in 40 ml 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10) wird zu der diazotierten p-Aminobenzyl-Zellulose hinzugegeben. Sodann wird das Gemisch auf pH 9,2 mit einer wässrigen 8 n-Natriumhydroxid-Lösung eingestellt und bei 25°C während 20 Minuten geschüttelt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer 0,1 m Carbonat-Puff er lösung (pH 10) und Wasser sukzessive gewaschen. 4,7 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung:
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-N=N <f ^> CH- J
werden hierdurch erhalten.
(2) 5OO mg (nasse Form) derwasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(3) beschrieben, behandelt. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es zeigt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 540 ,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 19
(1) 4,9 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung:
-CONH
werden aus 1,3g chinesischem Gallotannin und 2 g p-Aminobenzyl-Zellulose in gleicher Weise wie in Beispiel 16—(1) beschrieben, hergestellt.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und
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200 mg Aminoacylase werden in gleicherweise wie in Beispiel 1-(3) beschrieben, behandelt. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 610 ,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 20
(1) 1g p-Aminobenzyl-Zellulose wird mit Wasser gewaschen und anschliessend in 25 ml 2 n-Chlorwasserstoffsäure, die auf etwa 4°C abgekühlt ist, suspendiert. 5 ml einer wässrigen 14 %-igen Natriumnitrit-Lösung werden tropfenweise zu der Suspension bei etwa 4°C unter Rührung hinzugegeben und die Suspension wird bei 5°C während 1 Stunde gerührt. Die hierdurch erhaltene diazotierte p-Aminobenzyl-Zellulose wird durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Die diazotierte p-Aminobenzyl-Zellulose wird in 30 ml einer 0,1 m Borat-Pufferlösung (pH 8,0) suspendiert und es werden 500 mg Hexamethylendiamin hinzugegeben. Sodann wird die diazotierte p-Aminobenzyl-Zellulose-Suspension auf pH 9,5 eingestellt und bei 25°C während 20 Stunden gerührt. Die hierdurch erhaltene p-Aminohexylazobenzyl-Zellulose wird durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Eine Cyanbromid-ciktivierte-chinesische Gallotannin-Lösung, die aus 0,7 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 16— (1) beschrieben worden ist, hergestellt wurde, wird zu der p-Aminohexylazobenzyl-Zellulose hinzugegeben und
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das Gemisch wird bei 1O,5°C während 16 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 2,3 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose !covalent gebunden ist durch die Bindung:
-CONH-(CH0),.-N=N & \ CH_- 7
werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Heise, wie dies in
Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 530 mg
(nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 745 ,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen
Tannin-Zubereitung.
Beispiel 21
(1) 1,1 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an poröses Glas kovalent gebunden ist durch die Bindung:
-CONH- (CH2) fi-N=N—^ ^—CONH-(CH,).,- J
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werden aus 1 g p-Aminobenzamidopropyl-poröses Glas (hergestellt durch Corning Glass Works unter dem Warenzeichen "Enchol") und 0,7 g cHnesischem Gallotannin in der gleichen Weise, wie die in Beispiel 20-(1) beschrieben worden ist, hergestellt.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 510 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 4530-u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 22
(1) 500 mg Wolle werden in 30 ml einer wässrigen 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) dispergiert. 500 mg Hexamethylendiamin und 200 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid werden zu der Dispersion hinzugegeben. Sodann wird die Dispersion auf pH 6,0 eingestellt und bei 25°C während 20 Stunden gerührt. Die hierdurch erhaltene Aminohexyl-Wolle wird durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Zu der Aminohexyl-Wolle wird eine Cyanbromid-aktivierte-chinesische Gallotannin-Lösung, die aus 5,2 g chinesischem Gallotannin in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 16—(1) beschrieben worden ist, hinzugegeben
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und das Gemisch wird bei 1O°C während 16 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 530 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Wolle kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)gNH-7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) hergestellt worden war, und 200 mg Aminoacylase werden in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben ist, behandelt. 510 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 420 .u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 23
(1) 530 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Polyacrylamid vernetzt mit N,N1-Methylenbisacrylamid kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH_),-NHC0CHo~7 werden aus 5OO mg Carboxymethyl-Polyacrylamid, vernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid (hergestellt durch Bio-Rad Co. unter dem Warennamen "Bio-Gel CM-2") und 0,6 g chinesischem Gallotannin in der gleichen Weise wie in Beispiel 22-(1) beschrieben, hergestellt.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Abschnitt (1) erhalten worden ist, und
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200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie die in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 520 mg (nasse Form) einer immobilisiertenAminoacylase-Zubereitung werden er halten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 1 /U Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 24
(1) 505 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Polymethacrylsäure, vernetzt mit Divinylbenzol, kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH~)g-NH-7 werden aus 500 mg Polymethacrylsäure, vernetzt mit Divinylbenzol (hergestellt durch Rohm & Haas Co. unter dem Warennamen "AmberIite IRC-50" und 0,6 g chinesisches Gallotannin in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 22-(1) beschrieben worden ist.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist, behandelt. 5OO mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 1010.U Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
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Beispiel 25
(1) 1 g Chitosan (hergestellt durch Kyowa Yushi Kogyo Co. unter dem Warennamen "Fronac N") werden in 30 ml einer wässrigen 0,1 n-Natriumhydroxid-Lösung suspendiert und es werden 0,5 ml Epichlorhydrin hinzugegeben. Das Gemisch wird bei 30°C während 24 Stunden gerührt. Das Epichlorhydrinaktivier te Chitosan, das hierdurch erhalten wird, wird durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumcarbonat -Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Sodann wird das Epichlorhydrin-aktiviete Chitosan in 30 ml einer wässrigen Lösung suspendiert, die chinesisches Gallotannin (Gehalt an Tannin: 1 g/30 ml) enthält. DieSuspensionwird bei 45°C während 16 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumcarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. 1,1 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin das an Chitosan kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH3CH(OH)CH2~7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 510 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 480 Ai Mol/Std/iO g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung .
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Beispiel 26
(1) 1,1 g (trockene Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Polyacrylamid, vernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid, kovalent gebunden ist durch die Bindung:
-CONH-(CH0),-N=N
werden aus 1 g p-Aminophenyl-Polyacrylamid, vernetzt mit Ν,Ν1-Methylenbisacrylamid und 0,6 g chinesischem Gallotannin in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 20-(1) beschrieben worden ist.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 640-u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 27
(1) 1,1 g (trockene Form)einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Polyacrylamid,
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vernetzt mit N,N1-Methylenbisacrylamid, kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH0),-? werden aus 1 g
/. o—
Hydrazine—Polyacrylamid, vernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid (hergestellt durch Koch-Light Labs Ltd. unter dem Warennamen "Enzacryl AH") und 0,6 g chinesischem Gallotannin in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 20-(1) beschrieben worden ist.
(2) 5OO mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 2OO mg Aminoacylase werden in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 520 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 480 .u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 28
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)g-NHCHjCH(OH)CH2~7 werden in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben worden ist. 25 mg Glukoseisomerase (Gesamtaktivität: 690 Einheiten), aufgelöst in 20 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumchlorid-Lösung, werden zu 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 20 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit
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Wasser gewaschen. 500 mg (nasse Form) einer immobilisierten Glukoseisomerase-Zubereitung ^d.h. Glukoseisomerase, das an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert ist7 werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Isomerase-Aktivität von 3 26 Einheiten. /Eine Einheit der Glukoseisomerase ist als die enzymatische Aktivität definiert, die 1 mg Fructose durch Reaktion miteiner wässrigen 3,6 %-igen Glukose-Lösung bei 700C während einer Stunde in Anwesenheit von 0,025 m Magnesiumsulfat ergibt^?
Beispiel 29
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2J6-NHCO1? wird in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist. 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung und 25 mg der Glukoseisomerase (Gesamtakticität: 690 Einheiten) werden in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 28 beschrieben worden ist. 500 mg (nasse Form) einer immobilisierten Glukoseisomerase-Zubereitung ^d.h. Glukoseisomerase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung? werdenhierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Glukoseisomerase-Aktivität von 319 Einheiten.
Beispiel 30
250 mg Papain werden zu 100 ml einer wässrigen 0,01 m Zitronensäure-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 6,2) hinzugegeben.
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die 5 rnnol Cystein und 1 irrnol Ethylendiamintetraessigsäure enthält. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und sodann filtriert. 5OO mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d". h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)-CH2NH-(CH2J6-NHCH2CH(OH)CH2-7, die in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1-(2) beschrieben, hergestellt worden ist, werden zu 20 ml des Filtrates (Papain-Aktivität: 64 Einheiten) hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mitWasser gewaschen. Es werden 500 mg (nasse Form) einer immobilisierten Papain-Zubereitung (Ά.h. Papain adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7 hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Papain-Aktivität von 20 Einheiten. ^Eine Papain-Einheit ist als die enzymatische Aktivität definiert, die 1 λι Mol ok-Benzoyl-arginin-äthylester durch Reaktion mit dem Argininester bei pH 6,2 während einer Minute zersetzt7·
Beispiel 31
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)fi-NHCH2CH(OH)CH2;7 wird in der gleichen Weise hergestellt,wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben ist. 20 ml einer wässrigen Lösung (pH 5,0) von Glukoseoxidase (Gesamtaktivität: 376 Einheiten) die aus Aspergillus niger erhalten ist, werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird
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bei 25°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 1,1 g (nasse Form) eine: immobilisierten Glukoseoxidase-Zubereitung /d.h. Glukoseoxidase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7 werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Glukoseoxidase-Aktivität von 162 Einheiten. ^Eine Einheit der Glukoseoxidase ist definiert als die enzymatische Aktivität, die 1 ,u Mol Glukose zu Glukon säure und H O2 durch Reaktion mit Glukose bei 35°C bei pH 5,1 während 1 Minute umwandelt.7
Beispiel 32
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCO=7 wird in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist. 50 mg Hesperiginase (Gesamtaktivität: 1900 Einheiten) aufgelöst in 1OO ml einer 0,01 m Acetat-Pufferlösung (pH 4,3), werden zu 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 35°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 500 mg (nasse Form) einer immobilisierten Hesperiginase-Zubereitung ^d. h. Hesperiginase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung^ werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Hesperiginase-Aktivität von 703 Einheiten. ^Eine Einheit Hesperiginase ist als die enzymatische Aktivität definiert, die 1 mg Ramnose durch Reaktion mit 0,1 % Hesperidin
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- «τη
bei 4O°C bei pH 3,8 während 30 Minuten ergibt?.
Beispiel 33
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)g-NHCH2(OH)CH2=7 wird in der
gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben worden ist. Eine Lösung (pH 4,3) von 6 mg Amylase (Gesaintakt ivi tat: 3600 Einheiten), die aus Bacillus subtilis erhalten worden ist, in 20 ml Wasser wird zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das
Gemisch wird bei 20°C während 2 Stunden gerührt. Sedann werden die Niederschläge duch Filtration gesammelt und mit
Wasser gewaschen. 0,98 g (nasse Form) einer immobilisierten Amylase-Zubereitung /d.h. Amylase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7 werden hierdurch erhalten.
Es ergibt sich eine Amylase-Aktivität von 480 Einheiten. Die Amyläse-Aktivität wird durch Reaktion mit 1 %-iger löslicher Stärke bei 40 C während 10 Minuten und anschliessende Färbung der Stärke mit Jod bestimmt. ^Eine Einheit der Amylase ist
als die enzymatische Aktivität definiert, die 1 % der charakterisitschen blauen Farbe der Stärke pro Minute abschwächt^
Beispiel 34
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die
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Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6~NHCH2CH(OHJCH^/ wird in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben worden ist. 100 mg ß-Galactosidase (Gesamtaktivität: 184 Einheiten), aufgelöstin 4 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchlorid-Lösung, werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 0,97 g (nasse Form) einer immobilisierten ß-Galactosidase-Zubereitung ^d. h. ß-Galactosidase, adsorbiert an wasseranlöslicher Tannin-Zubereitung7 werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine ß-Galactosidase-Aktivität von 75 Einheiten. ^Eine Einheit der ß-Galactosidase ist als die enzymatische Aktivitär definiert, die 1 ,u Mol c-Nitrophenol durch Reaktion mit o-Nitrophenyl-ß-galactopyranosid bei 37°C bei pH 6,5 während 1 Minute ergibt·/
Beispiel 35
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH3)6-NHCH2CH(OH)CH2=7 wird in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben worden ist. 4 ml einer wässrigen Lösung von Aspsrtase (Gesamtaktivität: 40 000,U Mol/Std) werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichenTannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten geschüttelt. Sodann wrden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 1,05 g (nasse Form) einer
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immobilisierten Aspartase-Zubereitung ^d.h. Aspartase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung? werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine Aspartase-Aktivität von 14 410,u Mol/Std. £Die Aspartase-Aktivität ist in ,u Mol L-Asparaginsäure angegeben, die durch Reaktion mit 1 m Aramoniumfumarat bei 37°C bei pH 8,5 erzeugt wird./
Beispiel 36
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2~7 wird in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-beschrieben ist. 5 ml einer wässrigen Fumarase-Lösung (Gesamtaktivität: 43 OOO ,u Mol/Std), die durch Brevibacterium ammoniagenes erhalten worden ist, werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten geschüttelt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und ir.it Wasser gewaschen. 0,98 g (nasse Form) einer immobilisierten Fumarase-Zubereitung ^d.h. Fumarase, adsorbiert an einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung? werden hierdurch erhalten. Es ergibt sicheine Fumarase-Aktivität von 7 300.u Mol/ Std. ^Die Fumarase-Aktivität ist in .u Molen L-Xpfelsäure angegeben, die durch Reaktion mit 0,2 m Natriumfumarat bei 37°C bei pH 7,0 erzeugt wirdJ
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Beispiel 37
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH NH-(CH2) -NHCH2CH(OH)CH2-? wird in der gleichen Weise hergestellt,wie dies in Beispiel 1~(2) beschrieben worden ist. 4 ml einer wässrigen Lösung von L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase^Gescimtaktivität: 5 64O,u Mol/ Std7, welche aus Pseudomonas dacuhae erhalten worden ist, werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten geschüttelt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 0,95 mg (nasse Form) einer immobilisierten L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Zubereitung ^d.h. L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase, adsorbiert an wasserunlöslicher Tannin-Zubereitung/ werden hierdurch erhalten. Es ergibt sich eine L-Asparaginsäure-ßdecarboxylase-Aktivität von 180,u Mol/Std. ^Die Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität ist in ,u Molen L-Alanin angegeben, die durch Reaktion mit 0,2 m L-Asparaginsäure bei 37°C bei pH 5,5 erzeugt werden^7
Beispiel 38
Eine wasserunlösliche Tannin-Zubereitung /a.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH21? wird in der gleichen Weise hergestellt,wie dies in Beispiel 1-(2) beschrieben worden ist. 2 ml einer wässrigen Lösung von
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Aspartase (Gesamtaktivität: 20 000 ,u Mol/Std), welche aus Pseudomonas dacunhae erhalten worden ist, werden zu 1 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten geschüttelt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 1,0 g (nasse Form) einer immobilisierten Enzym-Zubereitung ^d.h. die Enzyme, die an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert sind7 werden hierdurch erhalten. Es zeigt sich eine L-Alanin-Produktivität von 18OyU Mol/Std.
L-Alanin-Produktivität ist in ,u Molen L-Alanin angegeben, die durch Reaktion mit 0,2 m Asparaginsäure bei 37°C bei pH 5,5 erzeugt werden^7
Beispiel 39
(1) 4g Zellulosepulver werden in 200 ml einer wässrigen 25 %-igen Natriumhydroxid-Lösung bei 25°C während 30 Minuten eingetaucht und anschliessend mit Wasser gewaschen. 10 g der nassen Zellulose werden in 80 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung suspendiert. Die Suspension wird auf pH 11,5 eingestellt. Zu der Suspension wird Cyanbromid hinzugegeben.
(Die Menge an Cyanbromid ist in Tabelle 1 gezeigt) und das Gemisch wird bei unter 30°C während etwa 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei pH 11 bis 11,5 mit einer wässrigen 5 n-Natriumhydroxid-Lösung gehalten. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung, die auf etwa 10 C abgekühlt ist und kaltem Wasser gewaschen. Die Cyanbromid-aktivierte Zellulose, die hierdurch erhalten wird, wird in 100 ml
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einer wässrigen Lösung (pH 10), die Hexamethylendiamin (Gehalt an Hexamethylendiamin: 2,3 g/1OO ml) enthält, suspendiert und die Suspension bei 25 C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Es werden 10,5 g (nasse Form) Aminohexyl-Zellulose erhalten.
(2) Cyanbromid wird zu einer wässrigen 5 %-igen chinesischen Gallotannin-Lösung (pH 11,5) (die Menge an Cyanbromid und chinesischem Gallotannin ist in Tabelle 1 angegeben) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei 20°C während 8 Minuten gerührt. Während der Reaktion wird das Gemisch bei einem pH von 11 bis 11,5 gehalten. Die hierdurch erhaltene Cyanbromidaktivierte-chinesische Gallotannin-Lösung wird zu der in Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-Zellulose hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit einer wässrigen 0,1 m Natriumbicarbonat-Lösung und Wasser sukzessive gewaschen. Es werden hierdurch 11,2 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH0) ,.-NHCO-? erhalten.
(3) 2OO mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 40OO .u Mol/ Std) werden in 6 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchlorid-Lösung, die 2 v/v % n-Butanol enthält, aufgelöst. 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (2) erhalten worden ist, werden zu der Lösung
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-χτ-
hinzugegeben und das Gemisch wird bei 37 C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Es werden 530 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung erhalten ^d.h. Aminoa.cylase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7Die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Versuch Kr.
Menge an gemäss Abschnitt (1) verwendetem Cyanbromid (g)
Menge an gemäss Abschnitt (2) verwendetem chinesischem Gallotannin und
Cyanbromid
chinesisches Gallotannin (g)
Cyanbromid
(g)
Aminoacylaseaktivität der immobilisierten Zubereitung*
(i) 0,4
(ü) 0,4
(iii) 0,4
(iv) 0,4
(V) 0,2
(Vi) 0,1
(vii) 0,05
(viii) 0,02
1,5
2,6
5,2
21,0
10,5
5,2
2,6
1,05
0,02
0,04
0,1
0,4
0,2
0,1
0,05
0,02
8 480
9 056 9 280
10 080
10 400
6 176
3 136
2 176
Anmerkung:
*,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung
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Beispiel 40
96 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 192O,u Mol/Std) werden in 12 ml einer wässrigen Natriumchlorid-Lösung aufgelöst (die Konzentration (Gew./v %) des Natriumchlorides ist in Tabelle 2 angegeLen). Die Lösung wird auf pH 8,0 mit NaOH eingestellt. Es werden 250 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung/d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH-),NHCO-7 die in gleicher Weise wie in Versuch (v) des Beispiels 3 9 hergestellt worden ist, zu der Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Stunden gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Es werden 260 mg (nasse Form) einer immobilisiertenAminoacylase-Zubereitung /d.h. Aminoacylase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung? erhalten. Die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Konzentration an
Natriumchlorid
(Gew/v-%)		 Aminoacylase-Aktivität der immobili
sierten Zubereitung ( ,u Mol/Std/10 g
(nasse Form) der wasserunlöslichen
Tannin-Zubereitung)
0
0,05
0,1
0,2		 1 .100
4.300
10.550
11.050
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Fortsetzung Tabelle 2
0,3 10.900
0,4 10.100
0,5 8.800
Beispiel 41
96 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 1920-u Mol/Std) werden in 12 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchlorid-Lösung aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 8,0 eingestellt und es werden
Äthylenglykol, n-Butanol oder Harnstoff (die Menge ist in
Tabelle 3 wiedergegeben) hinzugegeben. Es werden 200 mg
(nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung
^cLh. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent
gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)g-NHCO-7, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist, hergestellt worden sind, zu der Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 4°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Es werden 210 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung ^d.h. Aminoacylase,
adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7 erhalten. Die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 3 wiedergegeben.
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Tabelle 3
Zugefügte Verbindungen
und Konzentration
(Gew./v-%)		 50 % I
Amincacylase-Aktivität der immo
bilisierten Zubereitung ( .u Mol/
Std/200 mg (nasse Form) der was
serunlöslichen Tannin-Zubereitung)
30 %
17 %		 120
Äthylen-
glykol		 8 % 140
128
8 % 140
4 %
2 %		 172
n-Butanol 1 % 186
172
2 m 172
1 ,3 m
0,6 m		 140
Harnstoff 0,3 m 148
168
140
keine
Zugabe		 128
Beispiel 42
32 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 640 .u Mol/Std) werden in 4 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wird auf einen in Tabelle 4
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gezeigten pH-Wert eingestellt. 200 mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Zellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2) g-NHCO^» die in der gleichen Weise hergestellt worden sind, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrie ben worden ist, werden zu der Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 30 Minuten gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Was ser gewaschen. Es werden 2OO mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung ^d.h. Aminoacylase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung7 hierdurch erhalten. Die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4
PH Aminoacylase-Aktivität der immobilisier
ten Zubereitung ( ,u Mol/Std/200 mg (nasse
Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zube
reitung)
4 17
5 34
6 45
7 58
8 62
9 64
10 58
11 28
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Beispiel 43
96 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 192O,u Mol/Std) werden in 12 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchlorid-Lösung aufgelöst. 0,2 ml n-Butanol werden zu der Lösung hinzugegeben und die Lösung wird auf pH 8,0 eingestellt. 2OO mg (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an Cellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH2)6 -NHC0=7, die in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben worden ist, hergestellt worden sind, werden zu der Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird während 30 Minuten bei einer Temperatur, die in Tabelle 5 gezeigt ist, gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Es werden 210 mg (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase /d.h. Aminoacylase, adsorbiert an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung? hierdurch erhalten. Die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 5 wiedergegeben.
Tabelle 5
Temperatur Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zu
bereitung ( ,u Mol/Std/200 mg (nasse Form) der
wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung)
4°C 184
25OC 280
37°C 280
45°C 291
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Beispiel 44
(1) 2g Aminoacylase (Gesamtaktivität 40 000 »u Mol/Std) werden in 250 ml einer wässrigen 0,2 m Natriumchlorid-Lösung, die 2 v/v % n-Butanol enthält, aufgelöst. Die Lösung wird auf pH 8,0 eingestellt. 5 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Cellulose kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH-(CH_)ß-NHC07 die in gleicher Weise hergestellt worden ist, wie dies in Beispiel 6-(2) beschrieben wurde, werden zu der Lösung hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 1 Stunde gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 5,2 g (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung /d.h. Aminoacylase, die an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert ist7 werden hierdurch erhalten.
(2) Eine Säule eines Durchmessers von 0,5 cm und einer Höhe von 10 cm wird mit 2 g (nasse Form) der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, beladen. Sodann wird eine wässrige 0,6 m N-Acetyl-
DL-Methionin-Lösung (pH 7,0) 5 χ 10~4 m Co++) oder eine wäss-
— 4 rige 0,2 m N-Acetyl-DL-Tryptophan-Lösung (pH 7,0, 5 χ 10 m Co ) durch die Säule mit einer Flussgeschwindigkeit von 1,7 ml/Std. oder 2,0 ml/Std. jeweils geführt. Die Menge an L-Methionin oder L-Tryptophan in dem Ausfluss wird in Intervallen gemessen und die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Zubereitung hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
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Tabelle 6
Betriebs
zeit		 0,6 m N-Acetyl-DL-
Methionin		 0,2 m N-Acetyl-DL-
Tryptophan
(Tage) Aminoacylase-Akti-
vität Cu Mol/Std)		 Aminoacylase-Aktivi-
tät (,u Mol/Std)
O 1.512 (10O) 972 (100)
2 1.836 (121) 1.138 (117)
6 1.174 (78) 731 (75)
10 1.315 (87) 731 (75)
17 962 (64) 498 (51)
18 1.047 (69) 435 (45)
22 1.106 (73) 554 (57)
26 1.106 (73) 499 (51)
30 976 (65) 523 (54)
34 749 (50) 515 (53)
40 599 (40) 515 (53)
44 623 (41) 488 (50)
Anmerkung:
Die in Klammern gezeigten numerischen Werte bedeuten das Stärkenverhältnis der enzymatisehen Aktivität, die gemäss folgender Formel berechnet worden ist:
Aktivität der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung, die zu einem Zeitpunkt, der in Tabelle 6 angege-
ben ist, bestimmt ist
Anfangsaktivität der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung
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Beispiel 45
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Beispiel 17 erhalten worden ist, beschickt. Die Säule wird mit 100 ml 0,1 m Carbonat-Pufferlösung, 50 ml Wasser und 50 ml einer Acetat-Pufferlösung (pH 4,3, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Ein in Tabelle 7 angegebenes Enzym wird in einer Acetat-Pufferlösung (pH 4,3, 1 m mho) aufgelöst und 200 ml der Enzym-Lösung (Proteingehalt: 1 mg/ml) (nachstehend als "Probenlösung" bezeichnet) werden durch die Säule mit einer Flussgeschwindigkeit von 20 ml/Std. geführt. Die Säule wird mit 0,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 4,3) und Wasser gewaschen. Sodann wird dieSäule mit einer Carbonat-Puff er lösung (pH 10,50m mho) eluiert und die Menge an Protein in dem EIuat (d.h. die Menge des Proteins, die an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert ist) wird durch die Copper-Folin-Methodik gemessen. Darüberhinaus wird zum Vergleich die Menge des Proteins, die an Aminohexyl-Zellulose (hergestellt durch Merck Co unter dem Warenzeichen "AH-Cellulose") adsorbiert werden soll, durch Behandlung der Cellulose in der vorstehend angeführten Weise gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.
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Tabelle 7
Enzym Menge des an der
wasserunlöslichen
Tannin-Zubereitung
adsorbierten Pro
teins (mg/ml)		 !
Wiederge
winnung
Ausbeute
(%) *		 Menge des an
"AH-Cellulose"
adsorbierten
Proteins
(mg/ml)
Lysozym 37,0 89 0,2
Trypsin 96,0 94 0,2
Asparaginase 47,4 95 0,1
C^ -Amylase 51 ,6 75 0,5
saure Phosph
tase		 1-
37,4		 94 1,1
Anmerkung: * Die "Wiedergewinnungsausbeute (4)", die in Tabelle 7 angegeben ist, wird gemäss nachstehender Formel berechnet:
Gesamtaktivität des in dem Eluat enthal-
tenen Enzymes
(Gesamtaktivität der Probenlösung) - (Gesamtaktivität des Enzyms, das an der wasserunlöslichen Tannin- Zubereitung nicht adsorbiert worden ist)
Beispiel 46
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Beispiel 13-(2) erhalten worden ist, beschickt. Die
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Säule wird mit 50 ml einer wässrigen 1 m Natriumchlorid-Lösung und 30 ml einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Ein in Tabelle 8 angegebenes Versuchsmaterial wird in einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) aufgelöst. 2 ml der Versuchsmaterial-Lösung (Gehalt des Versuchsmaterials: 1 ,u Mol/ml) werden durch die Säule geführt und die Säule wird mit 15 ml einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) gewaschen. Sodann wird die Menge des in den ausfliessenden Stoffen und der Waschlösung enthaltenen Versuchsmaterials gemessen und die Menge des auf der wasserun löslichen Tannin-Zubereitung adsorbierten Materials hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 wiedergegeben.
Tabelle 8
Versuchsmaterialien
Menge des auf der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbierten Versuchsmaterials ( ,u g/ml)
(Proteine)
ck-Amylase Ei-albumin Jjr-Globulin
(L-Aminosäuren) Arginin Histidin Alanin
Leucin
12 .000 ,0
7 .0OO
30 .000 ,1
1 ,8
0
2
5
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Fortsetzung Tabelle 8
Isoleucin O
Valin 9,6
Tryptophan 2,2
Asparagin 3,6
Asparaginsäure 6,9
(Organische Säuren)
Fumarsäure O
L-Äpfelsäure O
(Saccharide)
Glucose O
Fructose O
Ribose O
(Nucleoside)
Adenosin O
Guanidin O
Cytidin O
Ur id in O
Thymidin O
Beispiel 47
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Beispiel 17 erhalten worden ist, beladen. Die Säule wird
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mit 5 ml einer wässrigen 0,1 m Natriumchlorid-Lösung und elfter Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Ein in Tabelle 9 gezeigtes Versuchsmaterial wird in einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) aufgelöst. 2 ml der Versuchsmaterial-Lösung (Gehalt des Versuchsmaterials : 1 .u Mol/ml) werden durch die Säule geführt und die Säule wird mit 15 ml einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) gewaschen. Sodann wird die Menge des Versuchsmaterials, die in den ausfliessenden Substanzen und der Waschlösung enthalten ist, gemessen und die Menge der auf der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung enthaltenen adsorbierten Materialien hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Versuchsmaterialien Menge des auf der wasserunlöslichen
Tannin-Zubereitung adsorbierten Ver
suchsmaterials ( ,U g/ml)
(Proteine)
Asparaginase 41.000
Saure Phosphatase 39.000
Lysozym 11.0OO
(L-Aminosäure)
Arginin 1,5
Histidin 1,9
Alanin 2,3
Valin 4,9
Asparaginsäure 3,7
Tryptophan 2,3
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Fortsetzung Tabelle 9
(Organische Säuren) O
Fumarsäure O
L-Äpfelsäure
(Saccharide) O
Glucose O
Fructose
(Nucleoside) O
Adenosin O
Guanosin O
Cytidin O
Ur id in O
Thymidin
Beispiel 48
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von
5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung,
die gemäss Beispiel 16-(2) erhalten worden ist, beschickt. Die Säule wird mit 50 ml einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10, 50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml einer Carbonat-Pufferlösung (pH 9,0 1 m mho) sukzessive gewaschen. Eine Probenlösung (Proteingehalt: lOO.ug/ml) wird durch Auflösung von Lysozym in
einer Carbonat-Pufferlösung (pH 9,0, 1 m mho) hergestellt und
980 ml der Probenlösung werden durch die Säule geführt. In der
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Endstufe des Vorgangs wird die Konzentration des Proteins in den ausfliessenden Substanzen gleich der des Proteins, die in der Probenlösung enthalten ist. Sodann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01 n-Natriumhydroxid-Lösung, die auf etwa 4 C abgekühlt worden ist, eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat enthält 23,2 mg Protein. Wiedergewinnungsausbeute:
96 %.
Beispiel 49
Lysozym wird in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 48 beschrieben worden ist, jedoch mit der Ausnahme, dass 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Beispiel 17 erhalten worden ist, anstelle der wasserunlöslichen Zubereitung des Beispiels 16 verwendet werden. Das hierdurch erhaltene Eluat enthält 54 mg Protein. Wiedergewinnungsausbeite 97 %.
Beispiel 50
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Beispiel 17 erhalten worden ist, beladen. Die Säule wird mit 100 ml einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung, 50 ml Wasser und einer Acetat-Pufferlösung (pH 4,3, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Eine Probenlösung (Proteingehalt: 1OO.ug/ml) wird durch Auflösung in einer Acetat-Pufferlösung (pH 4,3 , 1 m mho) hergestellt und 1200 ml dieser Probenlösung werden durch die
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Säule geführt. In der Endstufe des Vorgangs wird die Konzentration des Proteins in den ausfliessenden Substanzen gleich der des Proteins, die in der Probenlösung enthalten ist. Sodann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01 n-Natriumhydroxid-Lösung, die auf etwa 4°C abgekühlt worden ist, eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat enthält 48,7 mg Protein. Wiedergewinnungsausbeute 7 5 %.
Beispiel 51
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Beispiel 18-(1) erhalten worden ist, beschickt. Die Säule wird mit 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10, 50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml einer Acetat-Pufferlöusng (pH 5,5, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Eine Probenlösung (Proteingehalt: 100 .ug/ml) wird durch Auflösung von Trypsin in einer Acetat-Pufferlösung (pH 5,5, 1 m mho) hergestellt und 540 ml der Probenlösung werden durch die Säule mit einer Flussgeschwindigkeit von 30 ml/Std. geführt. In der Endstufe des Vorgangs wird die Konzentration des Proteins in den ausfliessenden Substanzen gleich der des Proteins, die der Probenlösung entspricht. Sodann wird die Säule mit einer wässrigen 1 m Natriumchlorid-Lösung eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat enthält 8,9 mg Protein. Wiedergewinnungsausbeute: 98 %.
Beispiel 52
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung
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des Beispiels 17 beladen. Die Säule wird mit 50 ml einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10, 50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml einer Carbonat-Puff er lösung (pH 9,0, 1 mmho) sukzessive gewaschen. Eine Probenlösung wird durch Auflösung von 10 mg Lysozym, 10 mg L-Arginln, 10 ml L-Histidin, 10 mg L-Alanln, 10 mg L-Leucin, 10 mg L-Valin, 10 mg L-Tryptophan und 10 mg L-Asparaginsäure in 200 ml einer Carbonat-Pufferlösung (pH 9,0, 1 m mho) hergestellt und die Probenlösung wird durch die Säule hindurchgeführt. Die hierdurch erhaltenen ausfliessenden Stoffe zeigten keine Trübheit bei Erhitzung auf 60°C während 10 Minuten und wurden sodann bei Raumtemperatur während 1 Woche stehen gelassen. Andererseits wurde die Probenlösung, die nicht durch die Säule geführt wurde, bei ihrer Erhitzung auf 60°C während 10 Minuten trübe und ergab bei weiteren Stehenlassen während 1 Woche bei Raumtemperatur unlösliche weisse Niederschläge. Darüberhinaus zeigen die Ergebnisse der Aminosäurenanalyse, dass die ausfliessenden Stoffe die gleiche Menge an Aminosäuren enthalten, wie im Fall der vorstehend erwähnten Probenlösung. Aus diesen Tatsachen ergibt sich, dass Lysozym an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert wird, während Aminosäuren nicht adsorbiert werden.
Beispiel 53
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 17 beladen.Die Säule wird mit 50 ml einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10, 50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml einer Carbonat-Pufferlösung (pH 9,0, 1 m mho) sukzessive
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AOO
gewaschen. Eine Probenlösung wird durch die Auflösung von 20 mg Lysozym, 20 mg Fumarsäure und 20 mg L-Äpfelsäure in 200 ml einer Carbonat-Pufferlösung (pH 9,0, 1 m mho) hergestellt und die Probenlösung wird durch die Säule hindurchgeführt. Der hierdurch erhaltene ausfliessende Stoff enthält keine wesentliche Menge an Protein. Darüberhinaus enthalten die ausfliessenden Substanzen die gleiche Menge an organischen Säuren wie im Fall der vorstehend angeführten Probenlösung.
Beispiel 54
Eine Säule eines Durchmessers von 0,3 cm und einer Höhe von 5 cm wird mit 1 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 17 beladen. Die Säule wird mit 1OO ml einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10), 50 ml Wasser und 50 ml einer Acetat-Pufferlösung (pH 5,5, 1 m mho) sukzessive gewaschen. Eine Probenlösung wird durch Auflösung von 10 mg <*>-Amyläse, 0,1 mg L-Arginin, 0,1 mg L-Histidin, 0,1 mg L-Alanin, 0,1 mg L-Leucin, 0,1 mg L-Valin, 0,1 mg L-Tryptophan, 0,1 mg L-Asparagin und 0,1 mg L-Asparaginsäure in 200 ml einer Acetat-Pufferlösung (pH 5,5, 1 m mho) hergestellt und diese Probenlösung wird durch die Säule hindurchgeführt. Die hierdurch erhaltenen ausfliessenden Stoffe zeigten keine Trübung bei Erhitzung auf 60 C während 10 Minuten. Die Probenlösung, die jedoch nicht durch die Säule geführt worden war, wird bei Erhitzung trübe unter den vorstehend angeführten Bedingungen. Darüberhinaus zeigten die Ergebnisse der Aminosäureanalyse, dass die ausfliessenden Stoffe die gleiche
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Menge an Aminosäuren wie im Fall der vorstehend erwähnten Probenlösung enthielten.
Beispiel 55
1 ml derwasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 17 wird zu 500 ml einer Tris-Pufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) die 100,ug/ml kristalline Asparaginase (erhalten aus Proteus vulgaris) enthält, hinzugegeben. Das Gemisch wird während 4 Stunden unter Kühlung gerührt und sodann zur Abtrennung der wasserunlöslichen Tanninzubereitung abfiltriert. Das Filtrat enthält 4,5 .ug/ml Protein. Sodann wird die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung mit einer 1 m Natriumchloridlösung eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat enthielt 45,5 mg Protein.
Beispiel 56
Eine wässrige Asparaginase-Lösung (nachstehend als "die Probenlösung" bezeichnet) wird aus Proteus vulgaris nach der Methodik hergestellt, die in Biochemistry, 11, 217-222 (197 2) beschrieben worden ist. Die Probenlösung (pH 8,0, 4 m mho, Proteingehalt:23,2 mg/ml, Asparaginase-Aktivität: 13,9 Einheiten/ml) wird auf pH 7,0 mit einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung eingestellt und sodann mit dem 5-fachen Volumen an Wasser verdünnt. Eine Säule eines Durchmessers von cm und einer Höhe von 10 cm wird mit 300 ml
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von 5 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 16— (1) beladen und 300 ml der verdünnten Lösung werden durch die Säule hindurchgeführt. 152 Einheiten Asparaginase werden hierdurch auf der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbiert. Nachdem die Säule mit 50 ml einer Tris-Puffer lösung (pH 7,0, 1 m mho) gewaschen worden ist, wird die Säule mit 50 ml einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0, 5 m mho), die 0,05 m L-Asparagin enthält, eluiert. 24 ml des hierdurch erhaltenen Eluats enthalten 42 mg Protein und das Eluat zeigt eine Asparaginase-Aktivität von 149 Einheiten. Dies zeigt, dass 98 % der an der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung adsorbierten Asparaginase mit der Phosphat-Pufferlösung eluiert werden und das Protein in dem Elut zeigt eine um 6-fach höhere Asparaginase-Aktivität als diejenige des Proteins, das in der vorstehend erwähnten Probenlösung enthalten ist. ^Eine Einheit wird als die enzymatische Aktivitätdefiniert, die 1 ,u Mol Ammoniak durch Reaktion mit 0,03 m L-Asparagin bei 37°C bei pH 8,0 während 1 Minute ergibt^?
Beispiel 57
Eine Hesperiginase-Lösung (nachstehend als "die Probenlösung" bezeichnet) wird durch Filtration einer Fermentierung sbrühe von Aspergillus niger hergestellt. Die Probenlösung (ph 4,8 , 14m mho, Proteingehalt: 19,2 mg/ml, Hisperiginase-Aktivität: 8,6 Einheiten/ml) wird auf pH 7,0 mit einer wässrigen Natiumhydroxid-Lösung eingestellt und anschliessend mit dem 5-fachen Volumen an Wasser verdünnt.
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-M-
Eine Säule eines Durchmessers von cm und einerHöhe von 10 cm wird mit 5 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 17 beladen und 400 ml der verdünnten Lösung (Gesamtaktivität 1242 Einheiten) werden durch die Säule hindurchgeführt. 270 Einheiten Hesperiginase werden hierdurch auf der wasserunlösliehen Tannin-Zubereitung adsorbiert. Nachdem die Säule mit 50 ml einer Tris-Puffer lösung gewaschen worden ist (pH 7,0, 1 m mho) wird die Säule mit 50 ml einer Carbonat-Puffer lösung (pH 10, 50 m mho) eluiert. 25 ml des Eluates, welches hierdurch erhalten wird, enthalten 42 mg Protein und das Eluat zeigt eine Hesperiginase-Aktivität von 149 Einheiten. Dies gibt an, dass 98 % der auf der wasserunlösliche Tannin-Zubereitung adsorbierten Hisperiginase mit der Carbonat-Pufferlösung eluiert werden. Das Protein in dem Eluat zeigt eine Hesperiginase-Aktivität, die etwa 2-fach höher als diejenige des Proteins ist, welches in der vorstehend angeführten Probenlösung erhalten ist.
Beispiel 58
Eine.Säule eines Durchmessers von cm und einer Höhe von 10 cm wird mit 5 ml der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung des Beispiels 16-(1) beladen. Die Säule wird mit 1 1 einer 0,1 m Carbonat-Pufferlösung (pH 10) und 1 1 Wasser sukzessive gewaschen. Amyläse (hergestellt durch Tanabe Seiyaku Co., Ltd. unter dem Warenzeichen "Morotomine" wird in einem japanischen Reiswein, d.h. in Sake (einem Fermentierungsschnaps aus Reis) aufgelöst, die Lösung (pH 4,3,
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0,6 m mho, Proteingehalt: 100,ug/ml)(nachstehend als "die Probenlösung" bezeichnet) wird durch die Säule unter Kühlung hindurchgeführt und sodann werden 500 ml der ausfliessenden Stoffe gesammelt. Die hierdurch erhaltenen ausfliessenden Stoffe zeigten keine Trübung bei Erhitzung auf 60°C während 10 Minuten und anschliessendem Stehenlassen bei Raumtemperatur während 50 Tagen. Andererseits wird die Probenlösung die nicht durch die Säule geführt worden ist, bei Behandlung unter den vorstehend angeführten gleichen Bedingungen trübe. Darüberhinaus enthalten die ausfliessenden Stoffe die gleiche Menge von jeder der Aminosäuren, der Saccharide und organischen Säuren wie im Fall des vorstehend erwähnten japanischen Sake. Nach Beendigung der vorstehend angeführten Vorgänge wird die Säule mit 0,01 η-Chlorwasserstoffsäure eluiert. Es werden hierdurch 104 mg Amylase wiedergewonnen.
Beispiel 59
(1) 10,5 g (nasse Form) Aminohexyl-Cellulose werden aus 4 g Cellulosepulver in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist. 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesischen Gallotannin-Lösung (pH 5,7 oder 9) werden zu 4 g (trockene Form) der Aminohexyl-Cellulose hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25oc während 2 Stunden gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 12,5 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Aminohexyl-Cellulose adsorbiert ist7 werden hierdurch erhalten.
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40S
(2) 5OO mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und
200 mg Aminoacylase (Gesamtaktivität: 4000 .u Mol/Std) oder
25 mg Glukoseisomerase (Gesamtaktivität: 690 Einheiten) werden in gleicher Weise, wie dies in Beispiel 1-(3) oder
Beispiel 28 beschrieben ist, behandelt. Es werden eine immobilisierte Aminoacylase- oder Glukoseisomerase-Zubereitung erhalten. Die enzymatische Aktivität der immobilisierten Zubereitung ist in Tabelle 10 angegeben.
Tabelle 10
pH der chinesischen
Gallotannin-Lösung		 Enzymatische Aktivität der immo
bilisierten Zubereitung		 Glukoseisomerase-
Aktivität ·*
5
7
9		 Aminoacylase-
Aktivität*		 9
45
237
7.650
9.054
9.468
Anmerkung: * ,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung
** mg/Std/100 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung
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Beispiel 60
(1) 11,Og (nasse Form) n-Octyl-Cellulose ^d.h. CeIIuIoSe-O-CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)7-CH3_7 werden durch Behandlung von 4 g Cellulosepulver (Warenzeichen "Cellulosepulver C" in der gleichen Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist, jedoch mit der Ausnahme, dass 1,2 ml n-Octylamin anstelle von Hexamethylendiamin verwendet werden. 4 g (trockene Form) n-Octyl-Cellulose werden zu 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesischen Gallotannin-Lösung (pH 7,0) hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden gerührt. Sodann werden dia Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 12,7 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin, das an n-Octyl-Cellulose adsorbiert ist? werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 200 mg Amino-Acylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. Es wird eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 14.400 ,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 61
(1) 10,9 g (nasse Form) n-Dodecyl-Cellulose ^d.h. CeIIuIOSe-O-CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)1^CH3-? werden durch Behandlung
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von 4 g Cellulosepulver (Warenzeichen "Cellulose Pulver C") in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist, hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass 1,5 g n-Dodecylamin anstele von Hexamethylendiamin verwendet werden. 4 g (trockene Form) der n-Dodecyl-Cellulose werden zu 1OO ml einer 5 %-igen chinesischen GaIlotannin-Lösung (pH 7.0) hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25 C während 2 Stunden gerührt. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 12,4 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung (Ά.h. chinesisches Gallotannin, das an n-Dodecyl-Cellulose adsorbiert worden ist? werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. Es wird eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten. Es zeigt sich eine Aminoamylase-Aktivität von 7389 ,u Mol/Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 62
(1) 4g Cellulosepulver (hergestellt durch Toyo Roshi Co unter dem Warenzeichen "Cellulose Powder D")werden in 15 ml einer wässrigen 25 %-igen Natriumhydroxid-Lösung bei 10°C während 30 Minuten eingetaucht Sodann werden 0,5 ml n-Butylglycidyläther ^d.h. n-Butyläther von 2,3-Epoxypropanol7 und 35 ml Wasser zu der nassen Cellulose hinzugegeben und das
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Gemisch wird bei 600C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 11,1 g n-Butyl-Cellulose /d.h. Cellulose-0-CH2CH(OH)CH2O-(CH2)3-CH3_7 werden hierdurch erhalten. 5OO mg (nasse Form) der Butylcellulose werden zu 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesiscbn Gallotannin-Lösung (pH 7,0) hinzugegeben. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 12,3 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an Butyl-Cellulose adsorbiert ist7 werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in der gleichen Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. Eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung wird erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 11 .1 60 ,u Mol/Std/ 10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 63
(1) 4g Zellulosepulver (Warenzeichen "Cellulose Powder D") werden in 15 ml einer wässrigen 25 %-igen Natriumhydroxid-Lösung bei 10 C während 30 Minuten eingetaucht. 0,5 ml Phenylglycidyläther, d.h. Phenyläther von 2,3-Epoxypropanol und 3 5 ml einer wässrigen 50 %-igen Äthanol-Lösung werden zu der nassen Cellulose hinzugegeben und das Gemisch wird bei 60°C während 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion wird die
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hierdurch erhaltene Phenoxypropyl-Cellulose /[d.h. CeIlUlOSe-O-CH2CH(OH)CH2O-^ ? J
zu 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesischen Gallotannin-Lösung (pH 7,0) hinzugegeben. Sodann werden die Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 12,1 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d. h. chinesisches Gallotannin an Phenoxypropyl-Cellulose adsorbiert? werden hierdurch erhalten.
(2) 500 mg (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 200 mg Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. Es wird eine immobilisierte Aminoacylase-Zubereitung erhalten. Es ergibt sich eine Aminoacylase-Aktivität von 12.420 ,u Mol/ Std/10 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung.
Beispiel 64
(1) 14g (nasse Form) Aminohexyl-Cellulose werden aus 4 g Cellulosepulver (Warenzeichen "Cellulose Powder D") in gleicher Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist. 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesischen Gallotannin-Lösung (pH 7,0) werden zu 4 g (trockene Form) der Aminohexyl-Cellulose hinzugegeben und das Gemisch wird bei 25°C während 2 Stunden gerührt. Sodann werden die
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-Vf-
Niederschläge durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 16,4 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung /d.h. chinesisches Gallotannin, das an der Aminohexyl-Cellulose adsorbiert worden ist? werden hierdurch erhalten.
(2) 5 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die gemäss Abschnitt (1) erhalten worden ist, und 2 g Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie dies in Beispiel 1 -(3)beschrieben worden ist. 5,5 g (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten.
(3) Eine Säule eines Durchmessers von 1 cm und einer Höhe von 10 cm wird mit 2 g (nasse Form) der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung beladen, die gemäss Abschnitt
(2) erhalten worden ist. Eine wässrige 0,6 m N-Acetyl-DL-
— 4 ++ Methionin-Lösung (pH 7,0, 5 χ 10 m Co ) oder eine wäss-
-4 rige 0,2 m N-Acetyl-DL-Tryptophan-Lösung (pH 7,0, 5 χ 10 m
C0++) werden durch die Säule mit einer Fliessgeschwindigkeit von 6 ml/Std. geführt. Die Menge an L-Methionin oder L-Trypto phan in den ausfliessenden Substanzen wird in Intervallen gemessen und die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung wird hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 wiedergegeben.
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Tabelle 11
Betriebszeit
(Tage)		 Stärkenverhältnis
vität*		 der enzymatIschen Akti-
O 0,6 m N-Acetyl-
DL-Methionin		 0,2 m N-Acetyl-
DL-Tryptophan
1 100 100
3 145 89
7 126 76
10 109 60
15 82 58
79 50
Anmerkung;
* Das Stärkeverhältnis der enzymatischen Aktivität wird aus der Formel berechnet, die in der Anmerkung der Tabelle 6 angegeben ist.
Beispiel 65
(1) 14,5 g (nasse Form) n-Octyl-Cellulose ^d.h. Cellulose-0-CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)7-CH3_7 werden durch Behandlung von 4 g Cellulosepulver (Warenzeichen "Cellulose Powder D") in gleicher Weise hergestellt, wie dies in Beispiel 1-(1) beschrieben worden ist, jedoch mit der Ausnahme, dass 1,2 ml n-Octylamin anstelle von Hexamethylendiamin verwendet werden. 100 ml einer wässrigen 5 %-igen chinesischen GaIlotannin-Lösung (pH 7,0) werden zu 4 g (trockene Form) n-Octyl-Cellulose
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hinzugegeben und das Gemisch w±d bei 25 C während 2 Stunden gerührt. Sodann werden die Niederschlage durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. 16,7 g (nasse Form) einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung ^d.h. chinesisches Gallotannin, das an n-Octyl-Cellulose adsorbiert worden ist7 werden hierdurch erhalten.
(2) 5 g (nasse Form) der wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, die in Abschnitt (1) erhalten worden ist und 2 g Aminoacylase werden in gleicher Weise behandelt, wie' dies in Beispiel 1-(3) beschrieben worden ist. 5,6 g (nasse Form) einer immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung werden erhalten.
(3) Eine Säule eines Durchmessers von 1 cm und einer Höhe von 10 cm wird mit 2 g (nasse Form) der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung beladen, die gemäss Abschnitt
(2) erhalten worden ist. Eine wässrige 0,6 m N-Acetyl-DL-
—4 ++ Methionin-Lösung (pH 7,0, 5 χ 10 m Co ) oder eine wässrige
0,2 m N-Acetyl-DL-Tryptophan-Lösung (pH 7.0, 5 χ 10~4 m Co++) werden durch die Säule mit einerFlussgeschwindigkeit von 6 ml/Std geführt. Die Mengen an L-Methionin oder L-Tryptophan in den ausfliessenden Substanzen werden in Intervallen gemessen und die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Aminoacylase-Zubereitung wird hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 wiedergegeben.
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Tabelle 12
Betriebszeit
(Tage)		 Stärkeverhältnis der enzymatischen Akti
vität"1 		0,2 m N-Acetyl-
DL-Tr yptophan
O 0,6 m N-Acetyl-
DL-Methionin		 100
1 100 112
3 137 104
7 121 87
10 94 69
15 79 70
79
Anmerkung: * Das Stärkeverhältnis der enzymatischen Aktivität wird gemäss der Formel berechnet die in der Anmerkung der Tabelle 6 angegeben ist.
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Aktivierung von Tannin
Figur 7
v-OH
1^ -OH (Tannin)
CNX (Cyanhalogenid-aktiviertes Tannin)
Figur 8 (τ)-ΟΗ
(Tannin)
(T)-OCH CHCH
(Epihalogenhydr in-aktiviertes Tannin)
Figur 9 (τ)-OH
-A-CH ,CHC
(T)-OCH2CH(OH)CH-A-CH2CHCH (Alkylenbisepoxid-aktiviertes Tannin)
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Synthese von Hydroxy-Polyroeren
Figur 10
Figur 11
H2N(CH2)mOH" (Aminoalkanol)
HO(CH-) OH 2 m
(Alkylendiol) (P)-OCONH(CH-) OH
(Hydroxyalkyl-Polymeres)
Θ -CH0CH(OH)CH-O(CH-) 0! (Hydroxyalkyl-PolynereS]
Synthese von Amino-Polymeren
Figur 12 (|>
Xj
(Alkylendiamin) ^)-OCONH(CH2)mNH2 (Aminoalkyl-Polymeres)
Figur 13 (p)-OCH CHCH2
CHCH „ +
-) 0-OCH2CH (OH)CH2NH (CH2) (Aminoalkyl-Polymeres)
Figur 14 @~Ν
(diazotiertes Amino-Polymeres -N=N-
(Aminoalkylazo-Polymeres)
Figur 15 (p)-COOH
(Carboxyl-Polymeres) 0-CONH (CH2)
(Aminoalkyl-Polymeres)
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Synthese von Carboxyl-Polymeren
Figur 16
-O
H0N(CH0) COOH
2 m
(Aminoalkansäure)
(p)-OCONH(CH2)mCOOH
(Carboxyalkyl-Polyraeres)
Figur 17 (p)-OCH 2CHCH H0N(CH0) COOH
2 m
(P)-OCH0CH(OH)CH0Nh(CH0) CCOH *Ζ/ 2 2 2m
(Carboxyalkyl-Polymeres)
Figur 18
-NHCCCH
2COOH
(Carboxyalkyl-Polymeres)
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Synthese von wasserunlöslichen Tannin-Zubereitungen
Figur 19 ©-OH +
XHCl
-OCH2CHCH2 CH(OH)CH2O-
(wasserunlösliche Tannin-Zubereitung)
Figur 20 (τ)-OH +
-NHCH2CHCH2 -t> (τ) -OCH 2CH (OH) CH 2NH- (?)
Figur 21 (T)-OH
+ (P)-OCH2CH(OH)CH2-A-Ch2CHCH2
-> (T)-OCH2CH(OH)CH -A-CH CH(OH)CH O-ι
Figur 22 ©_03^C=NH + (T)-OCONH- ι
Figur 23
)-0H
)-OCH2CHCH2 —\
)-NH„ -OCH2CH (OH) CH2O- (P)
Figur 24 (T)-OCH2CH(OH)Ch-A-CH2CHCH2
(P)-OH
-> (T)-OCH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2O-(P)
(P)-NH,
-OCH2CH(OH)CH2-A-CH2
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25
O O to
H2N(CH2)nN
1)
-» ©-OCONH(CH2)nNH,
(Aminoalkyl-Tannin)
4)
-» (T)-OCONH(CH2) NHCCO-(P;
5)
(Pj-OCO (CH2) (T)-OCOMH (CH2) nNHCH2CH (OH) CH20- (PJ
6) ©-CO0H -» (T)-OCONH(CH0) NH(CH0) COO-(PJ ^-^ 2 η 2 m ^-^
7) NHCO-(P)
XHCH „ —
(P)-OH
-OCONH(CH0) NHCH0W^w0 2 η 2
(Epihalogenhydrinaktiviertes Aminoalkyl-Tannin)
9)
(P)-NH, -» ^)-OCONH(CH ) NHCH2CH(OH)CH2O-(P;
10) 0-OCONH
CH (OH) CH
H N(CH-) OH (P)-OCH CHCH2
-rf — >■ (T)-OCONH(CH0) OH —rr > (T)-OCONH(CH0) 0CH0CH(OH)CH0O
2) ^*--' 2 η 11) N—' 2 η 2 2
(Hydroxyalkyl-Tannin)
(ΡΛ-ΟΗ
12)
> (τ)-OCONH(CH 2)nOCH 2CH (Epihalogenhydrin-akti-
JPJ-NH, -> ©-0C0NH (CH
(OH)CH2O-
viertes Hydroxyalkyl-Tannin)
-r— > (T)-OCONH(CH2) OCH CH(OH)CH2NH-(Pj
COOH
3)
> m)-0C0NH (CH0) COOH —r^r ^^ ^ π 15) > (T)-OCONH(CH0) CONH-
(Carbox Tannin
yalkyl-) .
Figur
1)
(Aminoalkyl-Tannin) (T)-OCH CH(OH)CH NH(CH ) NHCOO-(PJ
> (J)-OCH2CH(OH)CH2NH(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2O- (?)
(T)-OCH
2^2
XCH CHCH
5)
(P)-OH -> ©-OCH2CH(OH)CH2
6)
(T)-OCH-CH(0H)CH0NH(CH-) COOH v*-/ 2 2 2 η
(Carboxyalkyl-Tannin)
(pVnh. (T)-OCH2CH(OH)CH2
7) ■> ©-OCH2CH (OH) CH2
,CHO
nNHCH2CH(OH)CH
-(PJ
Figur
(T)-OH
(Pj-N,
(diazotiertes Amino-Polymeres)
Synthese von Alkyl-Polymeren
Figur 28 (p
^CNH +
(Cyanhalogenidaktiviertes Hydroxy-Polymeres)
H N(CH ) H 2 2 m (P)-OCONH(CH0) H ^-y 2 m
(Alky!-Polymeres)
Figur 29 (p)-OCH CHCH +
(Epihalogenhydrinaktiviertes Hydroxy-Polymeres)
H N(CH ) H 2 2 m ®-0CH„CH (OH) CH-NH (CH-) H Δ £ Δ ΠΙ
(Alkyl-Polymeres)
Figur 30 (p)-OH
(Hydroxy-Polymeres)
CH0CHCH0O(CH-) H i δ ^m CH(OH)CH 0(CH0) H
(Alkyl-Polymeres)
Synthese von Phenoxyalkyl-Polymeren
Figur 31 (F)-OH
g)-OCH2
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Figur 1
Figur 5
Nummer: 27 09 til
Inta.1: C 07«
Annwidetag: 28. Januar 1977 Offenlegungstag: 4. August 1977 Aktivierung von Hydroxy- und Amino-Polymeren
0-OH ^-OH
(Hydroxy-Polymeres)
Figur 2 (p)-OH
(Hydroxy-Polymeres)
Figur 3 (p)-NH
(Araino-Polymeres)
Figur 4 (p)-OH
Figur 6 (?)-0H
CNX
(Cyanhalogenid)
C=NH
(Cyanhalogenid-aktiviertes Hydroxy-Polymeres)
JCRC
XCH CHCH
(Epihalogenhydrin)
XCH
• (P) -OCH CHi
(Epihalogonhydrin-aktiviertes Hydroxy-Polymeres)
(P;-NHCH2CHCH
(Epihalogenhydrin-aktiviertes Amino-Polymeres)
2CHCH2-A-
(Alkylenbisepoxid)
(P)-OCH_CH(OH)CH0-A-CH0CHCH0
(Alkylenbisepoxid-aktiviertes Hydroxy-Polyraer es)
CH2CHCH2-A-CH2
,CHCH,
Qg) -NHCH 2CH (OH) CH-A-CH
(Alkylenbisepoxid-aktiviertes Amino-Polymeres)
X(CH0) COX —
2 ID
(Halogenalkanoy!halogenid)
0-0CO(CH ) X
2'm
(Halogenalkanoyl-halogenidaktiviertes Hydroxy-Polymeres)
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Claims (58)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    λ J Wasserunlösliche Tannin-Zubereitung, die im wesentlichen K^/ aus Tannin besteht, das durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist.
  2. 2. Wasserunlösliche Tannin-Zubereitung, die im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, einem Amino-Polymeren und einem Carboxyl-Polymeren ausgewählt ist.
  3. 3. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger durch eine Diazobindung oder mittels zumindest einer unter Cyanhalogenid, Epihalogenhydrine atz, u>-Bis- (2,3-epoxypropyl) -alkan und cv,U)-Bis-(2,3-epoxypropoxy)-alkan ausgewählten Verbindung gebunden ist.
  4. 4. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, ot/,ω-Bis-(2,3-epoxypropyl)-alkan und of,w -Bis-(2,3-epoxypropoxy)-alkan in Kombination mit zumindest einem Alkylendiamin, Aminoalkanol, Aminoalkansäure, Alkylendiol und Halogenalkanoylhalogenid verwendet werden.
  5. 5. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin kovalent an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger durch eine Bindung gebunden
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    ORlGWAL INSPECTED
    - ztr -
    1st, die unter -CONH-, -CH2CH(OH)CHj-, -CHjCH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CHj-, -Y'- (CHj) ^NHCO-, -Y'- (CHj) n~CONH-, -Y'-(CH.,) -NHCH-CH (OH) CH--, -Y1 - (CH-) NH (CH-) CO- und
    Λ» χι £ & £ Ii dt III
    -CONH(CHj) ^-CHjCH(OH)CH2- ausgewählt ist, worin Y1 -CONH- oder -CHjCH(OH)CHjNH- darstellt, A -(CHj) - oder -0(CHj) 0-ist, wobei η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellen und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
  6. 6. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Polysaccharid darstellt und das Tannin an das Polysaccharid durch eine Bindung gebunden ist, die unter -CHjCH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2-A-CH2Ch(OH)CH2-, -CHjCH(OH)-CH2NH(CH2)n-Y-, -CONH(CH2Jn-Y-, -Y1- (CH2)nCONH(CH2) m~Y-, -Y1- (CH2)nNHCO(CH2)m-Y-,
    -CONH—<C y—CH2-, -N=N—^ J^-CH2- und
    -CONH(CH2Jn-N=N-^ ρ—CH2- ausgewählt ist, worin Y -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -0-CH2CH(OH)CH2- Oder -NHCOCHjdarstellt, Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CHjNH- bedeutet, η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellen und A -(CHj) - oder -0(CHj) 0- ist und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
  7. 7. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin Pyrogalloltannin darstellt.
  8. 8. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid
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    kovalent durch die Bindung -CHjCH((OH)CHj- gebunden ist.
  9. 9. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid durch die Bindung -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(Oh)CH2- gebunden ist, worin A -(CH,) - oder -0(CH0)O- ist und q eine ganze
    δ q ί q
    Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
  10. 10. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet / dass das Tannin an das Polysaccharid durch die Bindung -CH2CH(OH)CH2NH(CHj)n-Y- kovalent gebunden ist, worin Y -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH2- darstellt und η eine ganze Zahl von 1 bis
    16 bedeutet.
  11. 11. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung: -CONH(CH2J-Y-, worin Y -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH2 darstellt und η eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  12. 12. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung: -Y1-(CHj)nCONH(CH2)m-Y-, worin Y -NHCO-, -NHCHjCH(OH)CHj-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCHj- darstellt, Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH- bedeutet und η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeuten.
    - 100 -
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  13. 13. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung: -Y'-(CH-) NHCO-(CH2)m-Y-worin Y -NHCO-, NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2
    oder -NHCOCH2- darstellt, Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH-darstellt und m und η jeweils ganze Zahlen von 1 bis 16 darstellen.
  14. 14. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung:
    -CONH
  15. 15. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung:
  16. 16. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das Tannin an das Polysaccharid kovalent gebunden ist durch die Bindung:
    -CONH
    - 101 -
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    worin η eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellt.
  17. 17. Wasserunlösliche Tannin-Zubereitung, die im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch physikalische Adsorption an einem wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, einem Amino-Polymeren, einem Carboxyl-Polymeren, einem Alkyl-Polymeren und einem Phenoxyalkyl-Polymeren ausgewählt ist.
  18. 18. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 17, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Polysaccharid darstellt das eine Gruppe der Formel "~(CH2)m R aufweist, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, Hydroxy oder Carboxyl bedeutet und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.
  19. 19. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Alkyl-Polysaccharid darstellt, das durch die Formel
    Polysaccharid-O-CHjCH (OH) CHjO (CHj)1nH
    wiedergegeben ist, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  20. 20. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Alkyl-Polysaccharid der Formel
    Polysaccharid-0-CH2CH (OH) CHjNH
    - 102 -
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    darstellt, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  21. 21. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Alkyl-Polysaccharid der Formel
    Polysaccharid-O-CONH(CH2)mH darstellt, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  22. 22. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Phenoxyalkyl-Polysaccharid der Formel
    Polysaccharid-0-CH2CH(OH) darstellt.
  23. 23. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Aminoalkyl-Polysaccharid der Formel
    Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)mNH2 darstellt, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  24. 24. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Aminoalkyl-Polysaccharid der Formel
    Polysaccharid-0-CHoC0NH(CH-) NH0 J 2 Z m I
    - 103 -
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    2703815
    darstellt, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet.
  25. 25. Tannin-Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Tannin Pyrogalloltannin darstellt.
  26. 26. Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet , dasa man Tannin an einem wasserunlöslichen hydrophilen Träger kovalent bindet oder physikalisch adsorbiert.
  27. 27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeich net, dass der wasserunlösliche hydrophile Träger der für die kovalente Bindung des Tannins verwendet wird, ein Hydroxy-Polymeres, ein Amino-Polymeres oder ein Carboxy1-Polymeres darstellt.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeich net, dass die kovalente Bindung des Tannins durch die folgenden Verfahrensstufen durchgeführt wird:
    {Κ/ Umsetzung von Tannin oder des Hydroxy- oder Amino-Polymeren mit Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, <x»W Bis-(2,3-epoxypropyl)-alkanon oder <*,U) -Bis-(2,3-epoxypropoxy)-alkan unter Erhalt eines aktivierten Tannins oder Polymeren und Umsetzung des aktivierten Tannins mit dem Hydroxy- oder Amino-POlymeren; oder des aktivierten Polymeren mit Tannin, oder
    /§7 Diazotierung des Aminopolymeren und Umsetzung des diazotierten Aminopolymeren mit Tannin.
    - 104 -
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  29. 29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung des Tannins durch die folgenden Verfahrensstufen durchgeführt wird:
    [Κ/ Umsetzung von Tannin mit Cyanhalogenid, Epihalogen-
    hydrin, oi/,Cx. -Bis- (2,3-epoxypropyl) -alkan oder σο,οο Bis-(2,3-epoxypropxy)-alkan unter Erhalt eines aktivierten Tannins, Umsetzung des aktivierten Tannins mit Alkylen-diamin, Aminoalkanol oder Aminocarbonsäure unter Erhalt eines Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Carboxyalkyl-Tannins und
    Iß/ Umsetzung entweder eines unter Aminoalkyl-Tannin,
    Hydroxyalkyl-Tannin, des Hydroxy-Polymeren oder des Amino-Polymeren mit Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, <*/»Cm -Bis- (2,3-epoxypropyl) -alkan, σο,ου -Bis- (2,3-epoxypropoxy)-alkan oder Halogenalkanoylhalogenid unter Erhalt eines aktivierten Tanninderivates oder Polymeren und anschliessende Umsetzung des aktivierten Tanninderivates mit dem Hydroxy- oder Amino-Polymeren oder des aktivierten Polymeren mit dem Aminoalky- oder Hydroxyalkyl-Tannin, oder
    Umsetzung des Aminoalkyl-Tannins mit dem Carboxyl-Polymeren oder des Carboxylalkyl-Tannins mit dem Amino-Polymeren.
  30. 30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxy-Polymere ein Polysaccharid oder Hydroxyalkyl-Polysaccharid darstellt und dass das Amino-Polyraere Aminoalkyl-Polysaccharid oder Aminobenzyl-Polysaccharid ist.
    - 105 -
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  31. 31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxy-Polymere ein Polysaccharid oder Hydroxyalkyl-Polysaccharid darstellt, das Amino-Polymere ein Aminoalkyl-Polysaccharid oder Aminobenzyl-Polysaccharid darstellt und das Carboxylpolymere Carboxyalkyl-Polysaccharid darstellt.
  32. 32. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Tannin Pyrogallol-Tannin ist.
  33. 33. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Tannin Pyrogallol-Tannin ist.
  34. 34. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der wasserunlösliche hydrophile Träger, der für die physikalische Adsorption des Tannins verwendet wird, ein Hydroxy-Polymeres, ein Amino-Polymeres, ein Carboxyl-Polymeres,ein Alkyl-Polymeres oder ein Phenoxyalkal-Polymeres darstellt.
  35. 35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der wasserunlösliche hydrophile Träger ein Polysaccharid darstellt, das eine Gruppe der Formel ~(CH2)_R aufweist, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, Hydroxy oder Carboxy darstellt und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.
  36. 36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Tannin Pyrogallol-Tannin darstellt.
  37. 37. Immobilisiertes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen aus einem biologisch
    - 106 -
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    Λ0
    aktiven Protein besteht, das physikalisch an einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung nach Anspruch 1 adsorbiert ist.
  38. 38. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , dass das Protein ein katalytisch aktives Enzym darstellt.
  39. 39. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , dass das Protein Aminoacylase, Glucoseisomerase, Papain, Amylase, Hesperiginase, ß-Galactosidase, Glucoseoxidase, Aspartase, Fumarase oder Asparaginsäure-ß-decarboxylase darstellt.
  40. 40. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, Amino-Polymeren und einem Carboxyl-Polymeren ausgewählt ist.
  41. 41. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin an den wasserunlöslichen,hydrophilen Träger durch eine Diazobindung oder mittels zumindest einer unter Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, öl,^, -Bis- (2 ,3-epoxypropyl) -alkan und <x , Oo -Bis-(2,3-epoxypropoxy)-alkan ausgewählten Verbindung gebunden ist.
  42. 42. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche
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    /I1
    Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger mittels zumindest einer unter Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, -St, (Ai-Bis-(2,3-epoxypropyl)-alkan und »>U; -Bis(-2,3-epoxypropoxy)-alkan in Kombination mit zumindest einer unter Alkylendiamin, Aminoalkanol, Aminoalkansäure, Alkylendiol und Halogenalkanoylhalogenid ausgewählten Verbindung kovalent gebunden ist.
  43. 43. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der das Tannin an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger durch eine Bindung kovalent gebunden ist, die unter -CONH-, -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(Oh)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-, -Y'-iCH^- NHCO-, -Y'-(CH0) -CONH-, -Y' - (CH-) -NHCH0CH(OH)CH.,-, -Y1-(CH2)nNH(CH2)mC0- und -CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- ausgewählt ist, worin Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH- darstellt, A -(CH-) - oder -(CH-) O- bedeutet und η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeuten und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
  44. 44. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der das Tannin kovalent an das Polysaccharid durch eine Bindung gebunden ist, die unter -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2NH(CH2Jn-Y-, -CONH(CHj)n-Y-, -Y'-(CH2)nCONH(CH2)m-Y-, -Y*- (CH3)nNHCO(CH2)m-Y-,
    - 1O8 -
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    -CONH
    -N=N- Ζ' \ -
    -CONH(CH2Jn
    ausgewählt ist, worin Y -NCHO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH2- darstellt, Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH- ist, η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellen, A -(CH2) - oder -0(CH2) 0- ist und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
  45. 45. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch physikalische Adsorption an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, Amino-Polymeren, Carboxyl-Polymeren, Alkyl-Polymeren und einem Phenoxyalkyl-Polymeren ausgewählt ist.
  46. 46. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin durch physikalische Adsorption an ein Polysaccharid gebunden ist, das eine Gruppe der Formel ~(CH2)mR aufweist, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, Hydroxy oder Carboxy darstellt und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.
  47. 47. Immobilisiertes Protein nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet , dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, worin Tannin
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    durch physikalische Adsorption an ein Polysaccharidderi vat der folgenden Formel
    Polysaccharid-O-CHjCH(OH)CH2O(CH2)mH, Polysaccharid-O-CHjCH(OH)CH2NH(CH2)mH, Polysaccharid-0-CONH(CH2)mH, Polysacchar id-0-CH2CH (OH) C Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH
    oder Polysaccharid-0-CH0CONH(CH0) NH0
    gebunden 1st, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellt.
  48. 48. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Proteins, dadurch gekennzeichnet , dass man ein biologisch aktives Protein mit einer wasserunlöslichen Tannin-Zubereitung (wobei die Tannin-Zubereitung im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist) in einem wässrigen Lösungsmittel kontaktiert, um das Protein an der Tannin-Zubereitung zu adsorbieren und anschliessend das immobilisierte Protein hiervon gewinnt.
  49. 49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein katalytisch aktives Enzym darstellt.
    - 11Ο -
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    27Q3615
  50. 50. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Aminoacylase, Glucoseisomerase, Papain, Amylase, Hesperiginase, ß-Galactosidase, Glucoseoxidase, Aspartase, Fumarase oder Asparaginsäure-ß-decarboxylase darstellt.
  51. 51. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, einem Amino-Polymeren und einem Carboxy-Polymeren ausgewählt ist.
  52. 52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger durch eine Diazobindung oder durch zumindest eine unter Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, oi/,(κ)-Bis-(2,3-epoxypropyl)-alkan und cn/,t>j -Bis- (2,3-epoxypropoxy)-alkan ausgewählte Verbindung kovalent gebunden ist.
  53. 53. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger mittels zumindest einer von Cyanhalogenid, Epihalogenhydrin, ob , Uj -Bis- (2,3-epoxypropyl) alkan und <*,, Uj -Bis- (2,3-epoxypropxy) -alkan in Kombination mit zumindest einer von Alkylendiamin, Aminoalkanol, Aminoalkansäure, Alkylendiol und Halogenalkanoylhalogenid ausgewählten Verbindung kovalent gebunden ist.
    - 111 -
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    270361S
  54. 54. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin an den wasserunlöslichen hydrophilen Träger durch eine Bindung gebunden ist, die unter -CONH-, -CHjCH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(Oh)CH2-, -Y'-(CHO) -NHCO-, -Y'-(CH-) -CONH-, -Y1 - (CH-) ,,-NHCH0CH(OH)CH9-, -Y1-(CH2)nNH(CH2)mC0- und -CONH(CHj)nOCHjCH(OH)CH2- ausgewählt ist, worin Y1 -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH- darstellt.
    A -(CH2)a~ oder ~°(CH2^a°~ ist' n und m Jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellen und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
  55. 55. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin kovalent an ein PoIysaccharid durch eine Bindung gebunden ist, die unter den Gruppen -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(Oh)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-,
    -CH0CH(OH)CH0NH(CHJn-Y-, -CONH(CH0) -Y-, -Y1-(CH0) CONH(CH0) -Y- δ δ δ δ η zn £ in
    -Y1-(CH2)nNHCO(CH2)m-Y-,
    -CONH-^ ^-CHj-, -N=N-^ J^-CHj- und
    -CONH(CHj)n-N=N-
    ausgewählt ist, worin Y -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2- , -OCHjCH(OH)CHj- oder -NHCOCHj-ist, Y1 -CONH- oder -CHjCH(OH)CHjNH- ist, η und m jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeuten, A -(CHj) - oder -0(CHj) 0- ist und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
    - 112 -
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  56. 56. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung im wesentlichen aus Tannin besteht, das durch physikalische Adsorption an einem wasserunlöslichen hydrophilen Träger gebunden ist, der unter einem Hydroxy-Polymeren, Amino-Polymeren, Carboxyl-Polymeren, Alkyl-Polymeren und einem Phenoxyalkyl-Polymeren ausgewählt ist.
  57. 57. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin durch physikalische Adsorption an ein Polysaccharid gebunden ist, das eine Gruppe der Formel -(CH2) R aufweist, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, Hydroxy oder Carboxy darstellt und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.
  58. 58. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserunlösliche Tannin-Zubereitung eine Zubereitung darstellt, in der Tannin durch physikalische Adsorption an einem Polysaccharidderivat der folgenden Formel:
    Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2O(CH2)mH, Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)mH, Polysaccharid-0-CONH(CH2)mH, Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2-O-^ Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2NH oder
    - 113 -
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    Polysaccharid-0-CH2CONH
    gebunden ist, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellt.
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