CH634101A5 - Verfahren zur herstellung von wasserunloeslichen tanninpraeparaten. - Google Patents

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CH634101A5
CH634101A5 CH109177A CH109177A CH634101A5 CH 634101 A5 CH634101 A5 CH 634101A5 CH 109177 A CH109177 A CH 109177A CH 109177 A CH109177 A CH 109177A CH 634101 A5 CH634101 A5 CH 634101A5
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tannin
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wet weight
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CH109177A
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Ichiro Chibata
Tetsuya Tosa
Takao Mori
Taizo Watanabe
Ryujiro Sano
Yuhsi Matuo
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Tanabe Seiyaku Co
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Description

634101
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Tanninpräparats, dadurch gekennzeichnet, dass Tannin kovalent an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff gebunden wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete wasserunlösliche, hydrophile Trägerstoff für die ko valente Bindung von Tannin ein Hydroxy-polymer, ein Aminopolymer oder ein Carboxylpolymer ist.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung von Tannin an den Trägerstoff aus den folgenden Reaktionsschritten besteht:
(A) Umsetzen von Tannin oder von Hydroxy- oder Aminopolymer mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, co-bis(2,3-Epoxypropyl)-alkanon oder a, co-bis(2,3-Epoxypropoxy)-alkan zur Bildung eines aktivierten Tannins oder Polymers und anschliessendes Umsetzen dieses aktivierten Tannins mit dem Hydroxy- oder Aminopolymer; oder dieses aktivierten Polymers mit Tannin oder
(B) Diazotieren des Aminopolymeren und Umsetzen des diazotierten Aminopolymers mit Tannin.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung von Tannin an den Trägerstoff über die folgenden Reaktionsschritte erfolgt:
(A) Umsetzen von Tannin mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, co-bis(2,3-Epoxypropyl)-alkan oder a, co-bis(2,3-Epoxy-propoxy)-alkan zum aktivierten Tannin, Umsetzen dieses aktivierten Tannins mit Alkylendiamin, Aminoalkanol oder Amino-carbonsäure zu einem Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Carbo-xyalkyltannin, und
(B) Umsetzen dieses Aminoalkyltannins, Hydroxyalkyltan-nins, des Hydroxypolymeren oder des Aminopolymeren mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, (o-bis(2,3-Epoxypropyl> alkan, a, co-bis(2,3-Epoxypropoxy)-alkan oder Halogenalkanoyl-halogenid zum aktivierten Tanninderivat oder aktivierten Polymer und anschliessendes Umsetzen des aktivierten Tanninderivats mit dem Hydroxy- oder Aminopolymeren oder des genannten aktivierten Polymeren mit dem Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyltannin, oder
(C) Umsetzen des Aminoalkyltannins mit dem Carboxylpolymer oder des Carboxyalkyltannins mit dem Aminopolymer.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxypolymer ein Polysaccharid oder ein Hydroxyalkylpolysaccharid ist und dass das Aminopolymer ein Aminoalkylpolysaccharid oder ein Aminobenzylpolysaccharid ist.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydroxypolymer ein Polysaccharid oder ein Hydroxyalkylpolysaccharid ist, das Aminopolymer ein Aminoalkylpolysaccharid oder ein Aminobenzylpolysaccharid ist und das Carboxylpolymer ein Carboxyalkylpolysaccarid ist.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Tannin Pyrogalloltannin ist.
8. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Tannin Pyrogalloltannin ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Tanninpräparates, dadurch gekennzeichnet, dass Tannin physikalisch an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff adsorbiert wird.
10. Verfahren gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der wasserunlösliche hydrophile Trägerstoff für die physikalische Adsorption von Tannin ein Hydroxypolymer, ein Aminopolymer, ein Carboxylpolymer, ein Alkylpolymer oder ein Phenoxyalkylpolymer ist.
11. Verfahren gemäss Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der wasserunlösliche hydrophile Trägerstoff ein Polysaccharid mit einer Gruppe der Formel: -(CH2)mR, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, Hydroxy oder Carboxy darstellt und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 bedeutet, ist.
12. Verfahren gemäss Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Tannin Pyrogalloltannin ist.
13. Verwendung des nach dem Verfahren des Patentan-
5 spruchs 1 hergestellten Tanninpräparates zur Herstellung eines immobilisierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass ein biologisch aktives Protein mit dem wasserunlöslichen Tanninpräparat in einem wässrigen Lösungsmittel kontaktiert wird,
wobei das genannte Protein am genannten Tanninpräparat io adsorbiert wird, worauf das immobilisierte Protein isoliert werden kann.
14. Verwendung gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Protein ein katalytisch aktives Enzym ist.
15 15. Verwendung gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Protein Aminoacylase, Glu-cose-isomerase, Papain, Amylase, Hesperiginase, ß-Galactosi-dase, Glucoseoxidase, Aspartase, Fumarase oder Asparagin-säure-ß-decarboxylase ist.
2o 16. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat hauptsächlich aus Tannin besteht, das kovalent an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff gebunden ist, der ein Hydroxypolymer, ein Aminopolymer oder ein Carboxylpoly-
25 mer ist.
17. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat hauptsächlich aus Tannin besteht, das kovalent an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff über eine Diazobrücke
30 oder mit Hilfe von Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, o-bis(2,3-Epoxypropyl)-alkan oder a, co-bis(2,3-Epoxypropoxy)-alkan gebunden ist.
18. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat
35 hauptsächlich aus Tannin besteht, das kovalent an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff mit Hilfe von Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, o>bis(2,3-Epoxypropyl)-alkan oder a, «)-bis(2,3-Epoxypropoxy)alkan in Kombination mit Alkylendiamin, Aminoalkanol, Aminocarbonsäure, Alkylendiol oder
40 Halogenalkanoylhalogenid gebunden ist.
19. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat hauptsächlich aus Tannin besteht, das kovalent an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff über eine der folgenden
45 Bindungen gebunden ist: -CONH-, -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2- A-CH2CH(OH)CH2-, - Y' -(CHz)n-NHCO-, -Y' -(CH2)n-CONH-, -Y' -(CHz)n-NHCH2CH(OH)CH2-, -Y'-(CH2)nNH(CH2)mCO- und -CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2-, worin Y' -CONH- oder so -CH2CH(OH)CH2NH-, A -(CH2)q- oder -0(CH2)q0-, n und m eine ganze Zahl von 1 bis 16 und q eine ganze Zahl von 1 bis 6 darstellen.
20. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat
55 hauptsächlich aus Tannin besteht, das kovalent an ein Polysaccharid über eine der folgenden Bindungen gebunden ist: -CH2CH(OH)CH2-,-CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2NH(CH2)n-Y-,-CONH(CH2)n-Y-, - Y' -(CH2)nCONH(CH2)m-Y-, -Y' -(CH2)nNHCO(CH2)m-Y-,
60
-C0NH-^-CH2-, -N=N-@-CH2- und -C0NH( CHg )n-N=N-^-CH2-,
65
worin Y -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH2-, Y' -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH-, n und m eine ganze Zahl von 1 bis 16, A
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-(CH2)q- oder -0(CH2)q0- und q eine ganze Zahl von 1 bis 6, tung geworden (Annual Review of Biochemistry, Vol. 35, Teil darstellen. II, P.D. Beyer, Editor; Annual Review Inc., Palo Alto, California,
21. Verfahren gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekenn- Seiten 873-908; 1966). Die genannten immobilisierten Enzyme zeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat können als heterogene Katalysatoren in Suspensionen oder in hauptsächlich aus Tannin besteht, das durch physikalische s Säulenform verwendet werden, und nach der Beendigung der Adsorption an einen wasserunlöslichen hydrophilen Träger- heterogenen Reaktionen können sie leicht aus den Reaktionsstoff gebunden ist, der ein Hydroxypolymer, ein Aminopoly- gemischen entfernt werden.
mer, ein Carboxylpolymer, ein Alkylpolymer oder ein Phenoxy- Ferner können die genannten immobilisierten Enzyme alkylpolymer ist. mehrmals verwendet werden, um spezifische chemische Verän-
22. Verfahren gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekenn- io derungen in grossen Anteilen von Substrat zu bewirken. In die-zeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat sem Zusammenhang sind die verschiedensten Methoden zur hauptsächlich aus Tannin besteht, das durch physikalische Immobilisierung von Enzymen bekannt, wie z.B. (a) kovalente Adsorption an ein Polysaccharid mit einer Gruppe der Formel Bindung der Enzyme auf geeignete wasserunlösliche Träger--(CH2>mR gebunden ist, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, materialien wie Haloacetylpolysaccaride; (b) ionische Bindung Hydroxy oder Carboxy bedeutet und m eine ganze Zahl von 1 15 auf Trägermaterialien, wie DEAE-Cellulose oder DEAE-Sepha-bis 16 darstellt. dex; (c) physikalische Adsorption auf inerte Trägerstoffe oder
23. V erfahren gemäss Patentanspruch 9, dadurch gekenn- auf synthetische Ionenaustauscherharze ; (d) kovalente Kreuzzeichnet, dass das genannte wasserunlösliche Tanninpräparat Vernetzung der Enzyme durch bifunktionelle Agenzien; (e) Einhauptsächlich aus Tannin besteht, das durch physikalische schluss in dem Gel eines Polyacrylamids; und (f) Mikroverkap-Adsorption an eines der nachfolgenden Polysaccharidderivate 20 sein der Enzyme durch die semipermeable Membran von gebunden ist, besteht: Nylon. Zur Illustration der oben genannten Methode (c) wurde P0lysaccharid-0-CH2CH(0H)CH20(CH2)mH, dieselbe in der Weise durchgeführt, dass Enzyme auf Aktiv-Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)mH, kohle oder porösem Glas physikalisch adsorbiert wurden (U.S.-Polysaccharid-0-CONH(CH2)mH, Patent Nr. 271785, Enzymologia, 39,12,1970). Diese bekannten
25 Methoden verbinden eine einfache Arbeitstechnik mit hoher P0lysaccharid-0-CH2CH(0H)CH2-0 *V__/ ì enzymatischer Aktivität. In den bekannten Fällen jedoch kann auch eine leichte Veränderung der Umgebung, wie z.B. eine Polysaccharid-0-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)mNH2, oder pH-Veränderung, eine Änderung der Temperatur oder die
Polysaccharid-0-CH2CONH(CH2)mNH2 Zugabe von Substrat eine teilweise oder vollständige Desorp-
worin m eine ganze Zahl von 1 bis 16 darstellt. 30 tion des Enzyms von seinem Trägerstoff bewirken.
Es wurde nun gefunden, dass ein wasserunlösliches Tannin-präparat, d.h. Tannin gebunden auf einen Trägerstoff durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption die Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren Eigenschaft hat, dass es Proteine spezifisch und reversibel bin-zur Herstellung eines wasserunlöslichen Tanninpräparats 35 den kann und demzufolge als Adsorbens für die Konzentration sowie von damit immobilisierten biologisch aktiven Proteinen. von -verdünnten Proteinlösungen verwendet werden kann. Die
Enzyme und andere biologisch aktive Proteine wie sie aus genannten wasserunlöslichen Tanninpräparate können auch lebenden Zellen (z.B. mikrobiellen Zellen, Pflanzen und tieri- nützlich sein, als Adsorbenzien für die Trennungivon Proteinen sehen Geweben) isoliert werden können, wurden in grossem aus rohen Proteinlösungen oder sogar zur selektiven Entfer-Masse zum Beispiel als Nahrungsmittelzusätze, als Futterzu- 40 nung von Proteinverunreinigungen aus einem Gemisch von sätze, als Heilmittel, als chemische Reagenzien und als indu- verschiedenen Verbindungen. Wir haben ferner gefunden, dass strielle Rohprodukte verwendet. Die Isolation und die Reini- ein wasserunlösliches Tanninpräparat mit einem darauf adsor-gung der genannten Proteine erfolgte nach den verschieden- bierten katalytisch wirksamen Enzym als heterogener Kataly-sten Methoden. So kann die genannte Isolierung und Reinigung sato zur Induktion von chemischen oder enzymatischen Reak-z.B. in der Weise erfolgen, dass die Proteine mit Natriumchlo- 45 tionen verwendet werden kann. Enzyme werden von dem Tan-rid, Ammoniumsulfat oder mit organischen Lösungsmitteln ninpräparat stark adsorbiert ohne Denaturierung und ohne (z.B. Aceton, Äthanol) ausgefällt werden oder dadurch dass die dass bei enzymatischen Reaktionen eine Desorption der Proteine an Aktivkohle oder an Kleie adsorbiert werden. Die Enzyme erfolgen würde, sogar bei Zugabe eines Überschusses genannte Isolation und Reinigung kann auch durch Filtrieren von Substrat.
des Rohproteins durch den Gel eines kreuzvernetzten Dex- 50 Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge ein trans oder Polyacrylamids oder durch Chromatographieren auf Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Tanninprä-Ionenaustauscherharzen durchgeführt werden. Bei den paraten mit spezieller Affinität zu Proteinen, die als Adsorben-
genannten Fällungsmethoden werden jedoch immer andere sien für Proteine Verwendung finden können. Ein weiterer hochmolekulare Verbindungen oder anorganischen Stoffe mit- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur gefällt, die einen teilweisen oder einen vollständigen Verlust 55 Herstellung von Adsorbentien. Diese können für selektive Iso-der biologischen Aktivität des gewünschten Enzymes infolge lation, Reinigung oder Separation von Proteinen und für selek-dessen Denaturierung bewirken. Bei den Adsorptions- und tive Entfernung von Proteinverunreinigungen aus einem chromatographischen Methoden werden die verschiedensten Gemisch von Verbindungen Verwendung finden. Ferner sind anderen organischen Verbindungen ebenfalls adsorbiert und die Adsorbentien geeignet zur Herstellung neuer immobilisier-demzufolge enthalten die gewünschten Proteine j e nach dem eo ter Enzyme, die während längerer Zeit eine hohe Aktivität auf-die verschiedensten Verunreinigungen. Gelfiltration ist ein ge- weisen und die mehrmals wiedereingesetzt werden können, eignetes Verfahren zur Isolierung von Proteinen in hoher Rein- Die Fig. 1 bis 6 zeigen die Aktivierungsreaktion von heit ohne Verunreinigung durch niedermolekulare Verbindun- Hydroxy- und Amino-polymeren. Fig. 7 bis 9 zeigen die Aktivie-gen. Die Gelfiltration ist jedoch eine komplizierte Technik und rungsreaktion von Tannin. Die Synthese von Hydroxy-Polyme-es ist schwierig einen grossen Anteil von Rohprotein-Lösung es ren, Aminopolymeren und Carboxylpolymeren werden in den durch den Gel zu filtrieren. Fig. 10 bis 11,12 bis 15 und 16 bis 18 gezeigt. Die Fig. 19 bis 27
Andererseits sind immobilisierte Enzyme (d.h. Enzyme, die beschreiben die Synthese von wasserunlöslichen Tanninpräpa-an Trägermaterialien gebunden sind) von steigender Bedeu- raten und die Fig. 28 bis 30 und Fig. 31 zeigen die Synthese von
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Alkylpolymeren und Phenoxyalkylpolymeren. In der vorliegenden Beschreibung sowie in den Figuren stehen und (7^011 für Tannin,
©ra » ©m ' 0"OH mä 0"OH
für Hydroxypolymere, ^P^-NH2 und (^p^-K^ für Aminopolymere und
©• COOK und Q} eoo a
15
für Carboxylpolymere. Ferner stehen die Buchstaben n und m für eine ganze Zahl zwischen 1 und 16 und A bedeutet die Formel : -(CH2>q- oder -0(CH2)q0-, worin q eine ganze Zahl zwi- 20 sehen 1 und 6 darstellt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des wasserunlöslichen Tanninpräparates besteht darin, dass Tannin an einen wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff kovalent gebunden oder physikalisch adsorbiert wird. Im besonderen 25 wird das genannte Tanninpräparat in der Weise hergestellt,
dass Tannin und der wasserunlösliche hydrophile Trägerstoff durch mindestens eine divalente funktionelle Gruppe verbunden werden oder durch einfaches Kontaktieren des Tannins mit dem wasserunlöslichen hydrophilen Trägerstoff. 30
Unter dem Ausdruck «hydrophil» wird verstanden, dass das Polymer durch Wasser benetzbar oder in Wasser quellbar ist, ohne jedoch sich darin aufzulösen. Die verschiedensten Polymere mit diesen Eigenschaften können für das erfindungsgemässe Verfahren zur Anwendung kommen. Solche Polymere 35 sind z.B. Polymere mit Hydroxy, Amino, Carboxyl, Alkyl oder Phenoxyalkylgruppen (z.B. Hydroxypolymere, Aminopolymere, Carboxylpolymere, Alkylpolymere und Phenoxyalkylpo-lymere). Polysaccharide wie Cellulose, Agarose und kreuzvernetzte Dextrane (z.B. Dextran, kreuzvernetzt mit Epichlorhy- 40 drin oder Divinylsulfon) sind geeignet als Hydroxypolymere. Für das erfindungsgemässe Verfahren können jedoch solche Hydroxypolymere vorgängig der Bindung von Tannin daran modifiziert werden unter Verwendung von mindestens einem bifunktionellen Reagens, wobei geeignete andere Hydroxypo- « lymere erhalten werden. So können z.B. Hydroxypolymere wie Polysaccharide durch Cyanogenhalogenid (z.B. Cyanogenbro-mid) oder Epihalohydrin (z.B. Epichlorhydrin) behandelt werden und die erhaltenen Cyanogenhalogenid- oder Epihalohy-drin-aktivierten Hydroxypolymere können anschliessend mit so Aminoalkanolen (z.B. Aminomethanol, Aminoäthanol, Amino-propanol) oder mit Alkylendiolen (z.B. Methylenglykol, Äthy-lenglykol, T etramethylenglykol, Hexamethylenglykol) umgesetzt werden. Die auf diese Weise erhaltenen Hydroxyalkylpo-lymere wie Hydroxyalkylpolysaccaride können ebenfalls als 55 Hydroxypolymere in das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzt werden. Die Aktivierungsreaktion der Hydroxypolymere mit Cyanogenhalogenid oder Epihalohydrin (Fig. 1 oder 2)
kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH von 8-12 erfolgen (bei Verwendung von Cyanogen- 60 halogenid) oder bei einer Temperatur von zwischen 30 und 100 °C und einem pH zwischen 9 und 14 (bei Verwendung von Epihalohydrin) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser). Bei Verwendung von Cellulose als Hydroxypolymer wird diese vorzugsweise mit einem Alkalimetallhydroxid (z.B. Natriumhy- es droxid) vorgängig der Reaktion mit Cyanogenhalogenid oder Epihalohydrin behandelt. Andererseits kann die Reaktion der Cyanogenhalogenid-aktivierten Hydroxypolymere mit Aminoalkanolen (Fig. 10) bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH zwischen 8 und 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die Reaktion der Epiha-lohydrin-aktivierten Hydroxypolymere mit Alkylendiolen (Fig. 11) kann bei einer Temperatur von zwischen 30 und 100 °C und bei einem pH von zwischen 9 und 14 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen.
Geeignete Beispiele für Aminopolymere sind Aminobenzyl-polysaccharide (z.B. p-Aminobenzylcellulose), kreuzvernetzte Polyacrylamide (z.B. Polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid), kreuzvernetzte p-Aminophenylpoly-acrylamide (z.B. p-Aminophenyl-polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid), kreuzvernetzte p-Amino-benzamidoäthylpolyacrylamide (z.B. p-Aminobenzamidoäthyl-polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid), p-Aminobenzamido-poröses Glas, p-Aminophenylalaninleucin-copolymer, p-Aminopolystyrol, Methacrylsäure-m-aminostyrol-copolymer, Aminoalkylscleroprotein (z.B. Aminohexyl-Wolle, Aminohexyl-Seide) und kreuzvernetzte Aminoalkyl-polyme-thalcrylsäuren (z.B. Aminohexylpolystyrol, kreuzvernetzt mit Divinylbenzol). Aminopolymere, die aus Hydroxypolymeren unter Verwendung von geeigneten bifunktionellen Reagenzien hergestellt wurden, können auch für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden. Die Reaktion von Alkylendiami-nen mit den Cyanogenhalogenid-aktivierten Hydroxypolymeren oder die Reaktion von Alkylendiaminen mit den epihalohy-drin-aktivierten Hydroxypolymeren liefert die entsprechenden Aminoalkylpolymere und diese Aminoalkylpolymere können als Aminopolymer im erfindungsgemässen Verfahren zur Anwendung kommen. Bevorzugte Beispiele solcher Aminoalkylpolymere sind Aminoalkylpolysaccaride, wie Aminoäthyl-Cellulose, Aminobutylcellulose, Aminohexylcellulose, Ami-nooctylcellulose, Aminododecylcellulose, Aminoäthylagarose und Aminohexylagarose. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Cyanogenhalogen aktivierten Hydroxypolymeren (Fig. 12) kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH von 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen und die verschiedensten Alkylendi-amine wie Äthylendiamin, Tetramethylendiamin, Hexamethy-lendiamin, Octamethylendiamin, Decamethylendiamin und Dodecamethylendiamin können für die genannte Reaktion Verwendung finden. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Epihalohydrin aktivierten Hydroxypolymeren (Fig. 13) kann bei einer Temperatur von zwischen 30 und 100 °C und bei einem pH von 9 bis 14 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbaren Aminopolymere können auch durch Reaktion von Alkylendiamin mit diazotierten Aminopolymeren erfolgen wie diazotierter p-Aminobenzylcellulose oder diazotiertem p-Aminophenylpolyacrylamid kreuzvernetzt mit N,N'-Methy-lenbisacrylamid oder durch Reaktion von Alkylendiaminen mit Carboxylpolymeren wie Carboxymethylpolysaccharid erfolgen. Bei der genannten Reaktion kann ein Aminoalkylpolysac-charid der Formel
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OCH2CONH(CH2)mNH2
aus dem Carboxymethylpolysaccharid erhalten werden. Die Reaktion von Alkylendiaminen mit diazotierten Aminopolymeren (Fig. 14) kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 20 °C und bei einem pH von 7,5 bis 10 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Andererseits kann die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Carboxylpolymeren (Fig. 15) durch Behandeln derselben bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C in Gegenwart eines Carbodiimidreagens erfolgen (z.B. l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid) oder in
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Gegenwart eines Woodward-Reagens (z.B. 2-Äthyl-5-m-suIfe- vierte Tannin oder der aktivierte Trägerstoff mit dem Träger-nyl-isoxazol-hydroxid) in einem geeigneten Lösungsmittel stoff oder dem Tannin umgesetzt wird. Das bifunktionelle Re-
erfolgènr Die Reaktion von Alkylendiaminen mit den Carboxyl- agens kann entweder (i) ein «homo»-bifunktionelles Reagens polymeren kann auch durch Umsetzen der Carboxylpolymere mit zwei identischen funktionellen Gruppen wie Alkylenbis-in die entsprechenden reaktiven Derivate (z.B. Säureazide, Säu- s epoxyd; oder (ii) ein «hetero»-bifunktionelles Reagens mit zwei rehalogenide, N-Hydroxy-succinimidester) und durch anschlies- verschiedenen funktionellen Gruppen wie ein Cyanogenhalo-sende Reaktion der genannten reaktiven Derivate mit den genid, Epihalohydrin oder ein Halogenalkanoylhalogenid sein.
Alkylendiaminen erfolgen. Beispiele für das bifunktionelle Reagens, das für die Aktivie-
Beispiele für Polymere mit Carboxylgruppen (d.h. Carboxyl- rung von Tannin oder von dem Hydroxypolymeren verwendet polymere) sind kreuzvernetzte Polymethacrylsäuren wie Poly- io werden kann, sind Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin und methacrylsäure, kreuzvernetzt mit Divinylbenzol; kreuzver- Alkylenbisepoxid wie a, co-bis(2,3-Epoxypropyl)alkan oder a, netzte Carboxymethyl-polyacrylamide wie Carboxymethyl- co-bis(2,3-Epoxypropoxy)alkan. Das Epihalohydrin und Alkylen-polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid; bisepoxid kann auch für die Aktivierung des Aminopolymeren und Carboxyalkyl-polysaccaride wie Carboxymethylcellulose, verwendet werden. Ferner kann für die Aktivierung des Hydro-Carboxyäthylcellulose, Carboxybutylcellulose, Carboxyhexyl- 15 xypolymeren ein Halogenalkanoylhalogenid zur Anwendung cellulose, Carboxymethylagarose, Carboxyäthylagarose, Car- gelangen. Beispiele für Cyanogenhalogenide und Epihalohy-boxybutylagarose und Carboxyhexylagarose. Die Carboxyal- drin sind Cyanogenchlorid, Cyanogenbromid, Epichlorhydrin kyl-polysaccharide können durch Reaktion der Cyanogenhalo- und Epibromhydrin. Bevorzugte Beispiele für die Alkylenbis-genid- oder Epihalohydrin-aktivierten Polysaccharide mit Ami- epoxide (z.B. eine Verbindung der Formel:
nocarbonsäuren wie Aminoessigsäure, Aminopropionsäure, 20 n „
Aminohexansäure oder Aminoheptansäure erfolgen. Die / \ / \
genannte Reaktion (Fig. 16 oder 17) kann bei einer Temperatur qjj ÇHCH —A-CH CHCH )
von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH von 8 bis 12 (im 2 2 2 2
Fall von Cyanogenhalogenid-aktivierten Polysacchariden)
oder bei einer Temperatur von zwischen 30 und 100°Cund 25 sind diejenigen mit 1-12 Kohlenstoffatomen wie a, w-bis(2,3-einem pH von 9 bis 14 (bei den epihalohydrin-aktivierten Poly- Epoxypropyl)äthan, a, co-bis(2,3-Epoxyprophyl)butan oder a, sacchariden) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) co-bis(2,3-Epoxypropoxy)butan. Bevor-zugte Beispiele für die erfolgen. Andererseits können die Carboxyalkyl-polysaccha- Halogenalkanoylhalogenide (z.B. eine Verbindung der Formel: ride durch Umsetzen von Aminopolymeren mit Bernsteinsäu- X(CH2)nCOX) sind diejenigen mit 2-16 Kohlenstoffatomen wie reani ydrid (Fig. 18) erhalten werden. Die genannte Reaktion 30 Chloracetylchlorid oder Bromacetylbromid. Bei der Herstel-erfolgt bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei lung der wasserunlöslichen Tanninpräparate kann entweder einem pH von 4,5 bis 6 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Tannin oder das Hydroxy- oder Aminopolymer zuerst aktiviert Wasser). Weitere Beispiele für wasserunlösliche, hydrophile werden. Bei diesen Aktivierungs- und anschliessenden Kopp-Trägerstoffe, die für das erfindungsgemässe Verfahren geeig- lungsreaktionen gemäss den in den Figuren angegebenen net sind, sind fibröse Scleroproteine wie Wolle oder Seide. 35 Reaktionschemen erfolgt die Aktivierung von Tannin oder von Diese Scleroproteine enthalten sowohl Aminogruppen als Hydroxypolymeren mit Cyanogenhalogenid (Fig. 1 oder 7) bei auch Carboxylgruppen in ihren Molekülen und können entwe- einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH der als Aminopolymere oder als Carboxylpolymere verwendet von 8 bis 12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser), werden. Die Aktivierung von Tannin oder von Hydroxy- oder Aminopo-
«Tannin» ist ein allgemeiner Name für astringierende, aro- 40 lymeren mit Epihalohydrin oder Alkylenbisepoxid (Fig. 2,3,4,5, matische Säureglucoside oder Polyphenole, die in den verschie- 8 oder 9) kann bei einer Temperatur von zwischen 30 und 70 °C densten Pflanzen und Bäumen vorkommen und die je nach und bei einem pH von 8-12 in einem wässrigen Lösungsmittel ihrer Struktur in zwei Gruppen eingeteilt werden können: (z.B. Wasser) erfolgen. Die Aktivierungsreaktion des Hydroxy-
(a) Pyrogalloltannin (z.B. Mono-, Di- und/oder Trigalloylmono- polymeren mit dem Halogenalkanoylhalogenid (Fig. 6) kann saccharide, Mono-, Di- und/oder Trigalloyldisaccaride und 45 bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C in einem wäss-Mono-, Di- und/oder Trigalloyltrisaccaride); (b) Catecholtannin rigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die Reaktion von (z.B. Polyhydroxyphenol-Kondensate und Polyhydroxy-Flavan- Tannin mit dem epihalohydrin- oder alkylenbisepoxid-aktivier-Kondensate). Beispiele für die genannten Pyrogalloltannine ten Hydroxy- oder Aminopolymeren (Fig. 19,20 oder 21) liefert sind Gallotannin, Pentagalloylglucose, Hamameli-Tannin und ein wasserunlösliches Tanninpräparat, bei dem Tannin kova-Acetannin. Beispiele für die genannten Catecholtannine sind 50 lent an das Hydroxy- oder Aminopolymere gebunden ist und Polycatechol, Polyepicatechol, Polycatechin, Poly(pistacia- zwar durch die folgenden Bindungen: -CH2CH(OH)CH2- oder catechol) und Poly(galloyl-epicatechol). Für das erfindungsge- -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-, Entsprechend liefert mässe Verfahren können alle die genannten Pyrogallol- und die Reaktion von Epihalohydrin- oder alkylenbisepoxid-akti-Catecholtannine verwendet werden. Zur Herstellung der was- vierten Tannin mit den Hydroxy- oder Aminopolymeren serunlöslichen Tanninpräparate müssen diese Tannine jedoch 55 (Fig. 23 oder 24) ein Tanninpräparat, in dem Tannin kovalent nicht in reiner Form vorliegen, sondern es können Rohpro- durch die folgenden Bindungen an das Hydroxy- oder Amino-dukte, wie sie aus Pflanzen oder Bäumen isoliert werden, ohne polymer gebunden ist: -CH2CH(OH)CH2- oder vorgängige Reinigung eingesetzt werden. Vorzugsweise ver- -CH2CH(OH)CH2-A-CH2CH(OH)CH2-. Im besonderen kann wendet für das erfindungsgemässe Verfahren werden rohe z.B. ein wasserunlösliches Tanninpräparat, bei dem Tannin an Pyrogalloltannine wie chinesisches Gallotannin oder Galläpfel- 60 das Polysaccharid durch eine der folgenden Bindungen gebun-Tannin und rohe Catecholtannine wie Dattelpflaumen-Tannin. den ist: -CH2CH(OH)CH2-, -CH2CH(OH)CH2-A-
In einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfah- CH2CH(OH)CH2- oder -CH2CH(OH)CH2NH(CH2)n-Y- (Y ist rens kann das wasserunlösliche Tanninpräparat in der Weise eine Gruppe der Formel: -NHCO-, -NHCH2CH(OH)CH2-, hergestellt werden, dass entweder Tannin oder der wasserun- -OCH2CH(OH)CH2- oder -NHCOCH2-) hergestellt werden lösliche hydrophile Trägerstoff (entweder ein Hydroxypolymer 65 aus: Polysaccharid, dem Aminoalkyl-polysaccharid aus Fig. 12 oder ein Aminopolymer) mit mindestens einem bifunktionellen oder 13 oder dem Aminoalkyl-polysaccarid der Formel Reagens umgesetzt wird, wobei ein aktiviertes Tannin oder ein aktivierter Trägerstoff erhalten wird, worauf das genannte akti-
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bei Verwendung derselben als das Hydroxy- oder Aminopolymer in den Fig. 19,21 oder 23.
(^y0CH2C0NH(CH2)nNH2,
Die Reaktion von Tannin mit dem epihalohydrin- oder alky-lenbisepoxid-aktivierten Hydroxy- oder Aminopolymeren kann bei einer Temperatur von zwischen 30 und 70 °C und bei einem pH von 8-12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die Reaktion des Epihalodrin- oder Alkylenbisepoxid aktivierten Tannins mit dem Hydroxy- oder Aminopolymeren kann bei einer Temperatur von zwischen 30 und 70 °C und bei einem pH von 8-12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Andererseits kann ein Tanninpräparat, bei dem Tannin kovalent an das Aminopolymere durch die Bindung -CONH- gebunden ist, in der Weise erhalten werden, dass das Cyanogenhalogenid-aktivierte Tannin mit dem Aminopolymer (Fig. 22) umgesetzt wird. Tannin, gebunden an Polysaccharid durch die Bindung -CONH(CHz)n-Y- (worin Y die oben genannte Bedeutung hat) kann aus den Aminoalkyl-poly-sacchariden der Fig. 12 oder 13 oder aus solchen der Formel:
(jT)- 0CH2C0NH( CH2 ) nNH2
erhalten werden. Die Reaktion des Aminopolymeren mit Cyanogenhalogenid aktiviertem Tannin kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und bei einem pH von 4,5 bis 6 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen.
Zur Herstellung der wasserunlöslichen Tanninpräparate können die oben genannten bifunktionellen Reagenzien wie Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, Alkylenbisepoxid und Halogenalkanoylhalogenid in Kombination mit mindestens einem anderen bifunktionellen Reagens wie Alkylendiamin, Aminoalkanol oder Aminocarbonsäure eingesetzt werden. Das heisst, das wasserunlösliche Tanninpräparat kann aus dem aktivierten Tannin (z.B. Tannin aktiviert mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, co-bis(2,3-Epoxypropyl)-alkan oder a, co-bis(2,3-Epoxypropoxy)-alkan) durch Reaktion mit Alkylendiamin oder Aminoalkanol zum Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-Tannin, durch Umsetzen entweder des genannten Tanninderivats oder des Hydroxy- oder Aminopolymeren mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, co-bis(2,3-Epoxypropyl)-alkan, a, co-bis-(2,3-Epoxypropoxy)-alkan oder Halogenalkanoylhalogenid zum aktivierten Tanninderivat oder Polymer, und anschliessendem Umsetzen des genannten aktivierten Tanninderivats mit dem Hydroxy- oder Aminopolymer; oder des genannten aktivierten Polymers mit dem Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyl-tannin, erhalten werden. Das wasserunlösliche Tanninpräparat kann auch durch Kondensieren des Aminoalkyltannins mit dem Carboxylpolymeren erhalten werden. Andererseits kann das wasserunlösliche Tanninpräparat durch Umsetzen von Tannin mit Cyanogenhalogenid, Epihalohydrin, a, co-bis(2,3-Epoxypro-pyl)-alkan oder a, co-bis(2,3-Epoxypropoxy)-alkan zum aktivierten Tannin, durch anschliessendes Umsetzen dieses aktivierten Tannins mit Aminocarbonsäure zu einem Carboxyalkyltannin und anschliessendem Umsetzen dieses Carboxyalkyltannins mit dem Aminopolymeren erhalten werden.
Zur näheren Erläuterung dieser Reaktionen wird das Cyanogenhalogenid aktivierte Tannin mit dem Alkylendiamin, Aminoalkanol oder Aminocarbonsäure umgesetzt, wobei das entsprechende Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Carboxyalkyltannin (Fig. 25-1,25-2 oder 25-3) erhalten wird. Das Aminoalkyl-tannin und das Carboxyalkyltannin kann auch durch Umsetzen des Epihalohydrin aktivierten Tannins mit dem Alkylendiamin oder der Aminocarbonsäure (Fig. 26-1 oder 26-2) hergestellt werden. Beispiele für Alkylendiamine (d.h. eine Verbindung der
Formel H2N(CH2)nNH2 oder H2N(CH2)mNH2) sind diejenigen mit 1-16 Kohlenstoffatomen wie Äthylendiamin, Tetramethy-lendiamin, Hexamethylendiamin, Octamethylendiamin, Deca-methylendiamin, Dodecamethylendiamin. Beispiele für Aminoalkanol (d.h. die Verbindung der Formel H2N(CH2)nOH oder H2N(CH2)mOH) sind solche mit 1-16 Kohlenstoffatomen wie Aminoäthanol, Aminopropanol, Aminobutanol oder Amino-pentanol. Beispiele für die Aminocarbonsäuren sind (d.h. Verbindungen der Formel H2N(CH2)nCOOH oder H2N(CH2)mCOOH) solche mit 2-16 Kohlenstoffatomen wie Aminoessigsäure, Aminopropionsäure, Aminohexansäure oder Aminoheptansäure. Ein wasserunlösliches Tanninpräparat, bei dem Tannin an das Hydroxypolymer durch die Bindung: -Y'-(CH2)nNHCO-, -Y'-(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2- oder -Y'-(CH2)nNH(CH2)mCO- (Y' ist eine Gruppe der Formel: -CONH- oder -CH2CH(OH)CH2NH-) gebunden ist, kann in der Weise hergestellt werden, dass das erhaltene Aminoalkyl-tannin mit einem Cyanogenhalogenid-, Epihalohydrin- oder Halogenalkanoylhalogenid-aktivierten Hydroxypolymer (Fig. 254,25-5,25-6,26-3 oder 264) umgesetzt wird. Andererseits kann ein wasserunlösliches Tanninpräparat, bei dem Tannin kovalent an ein Hydroxypolymer durch die Bindung: -CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- gebunden ist durch Reaktion des Hydroxyalkyltannins mit dem Epihalohydrin aktivierten Hydroxypolymer (Fig. 25-11) erhalten werden. Ein Tanninpräparat, bei dem Tannin kovalent durch die Bindung: -Y'-(CH2)nNHCO- oder -Y'-(CH2)mCONH- (worin Y' die oben genannte Bedeutung hat) an das Carboxylpolymer oder an das Aminopolymer gebunden ist, kann durch Umsetzen des Aminoalkyltannins oder des Carboxyalkyltannins mit dem Carboxylpolymeren oder dem Aminopolymeren (Fig. 25-7,25-15 oder 26-7) erhalten werden. Die Reaktion von Cyanohalogenid aktiviertem Tannin mit dem Alkylendiamin, dem Aminoalkanol oder der Aminocarbonsäure kann bei einer Temperatur von 4 bis 40 °C und bei einem pH von 8-12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen, und die Reaktion des Epihalohydrin aktivierten Tannins mit dem Alkylendiamin oder der Aminocarbonsäure kann bei einer Temperatur von 30-70 °C und bei einem pH von 8-12 in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die Reaktion des Aminoalkyltannins mit dem Cyanogenhalogenid oder Epihalohydrin aktivierten Hydroxypolymeren kann in gleicher Weise wie die Reaktionen wie sie in den Fig. 22 und 23 beschrieben sind, erfolgen. Tannin, gebunden an Polysaccharid durch die Bindung: -Y'-(CH2)nNHCO- oder -Y'-(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2-(worin Y' die oben genannte Bedeutung hat) kann unter Verwendung von Cyanogenhalogenid aktiviertem Polysaccharid oder Epihalohydrin aktiviertem Polysaccharid als aktiviertem Polymer der Fig. 254,25-5,26-3 oder 264 hergestellt werden. Die Reaktion des Aminoalkyltannins mit dem Halogenalkanoylhalogenid aktivierten Hydroxypolymeren kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die Reaktion des Hydroxyalkyltannins mit dem Epihalohydrin aktivierten Hydroxypolymeren kann in gleicher Weise wie die in Fig. 23 beschriebene Reaktion erfolgen und dabei wird ein Tannin gebunden an Polysaccharid durch die Bindung:
-CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- aus dem Epihalohydrin-aktivierten Polysaccharid erhalten. Die Kondensationsreaktion des Aminoalkyltannins oder des Carboxyalkyltannins mit dem Carboxylpolymeren oder dem Aminopolymeren kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C und in Gegenwart von einem Carbodiimid-Reagens (z.B. l-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid, l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbo-diimid) oder Woodward-Reagens (d.h. 2-Äthyl-5-m-sulfenyl-iso-xazolium-hydroxid) in einem Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen. Die genannte Kondensationsreaktion kann auch dadurch erfolgen, dass das Carboxyalkyltannin oder das Carboxylpoly-
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mere in das entsprechende reaktive Derivat (z.B. Säureazid, caride, Hexylpolysaccharide, Octylpolysaccaride, Decylpoly-Säurehalogenid, N-Hydroxy-succinimidester) übergeführt wird, saccaride, Dodecylpolysaccaride) entweder (i) durch Umset-worauf dieses reaktive Derivat mit dem Aminopolymer oder zen eines Cyanogenhalogend-aktivierten Polysaccharids oder mit dem Aminoalkyltannin umgesetzt wird. Ferner kann ein eines Epihalohydrin-aktivierten Polysaccharids mit einem Alky-wasserunlösliches Tanninpräparat, bei dem Tannin kovalent s lamin mit 1 -16 Kohlenstoffatomen (z.B. Methylamin, Äthyl-mit der Bindung: -Y' -(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2- oder amin, Propylamin, Butylamin, Hexylamin, Octylamin, Decyla-
-CON H(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- an das Hydroxy- oder Ami- min, Dodecylamin) erhalten werden ; oder (ii) durch Umsetzen nopolymer gebunden ist, in der Weise hergestellt werden, dass eines Polysaccharids mit einem Alkylglydicyläther (z.B. Methyl, das Aminoalkyltannin oder das Hydroxyalkyltannin mit Epiha- Äthyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Octyl, Decyl oder Dodecyläther lohydrin zum entsprechenden Epihalohydrin-aktivierten Ami- io von 2,3-Epoxypropanol) erhalten werden. Als Polysaccharid noalkyl- oder Hydroxyalkyltannin (Fig. 25-8,25-12 oder 26-5) sind Cellulose, Agarose und kreuzvernetztes Dextran geeignet, umgesetzt wird, worauf das genannte aktivierte Tanninderivat Ferner kann das Phenoxyalkylpolysaccharid durch Umsetzen mit dem Hydroxypolymer oder dem Aminopolymer (Fig. 25-9, von Polysaccharid mit Phenylglycidyläther (z.B. Phenyläther 25-10,25-13,25-14 oder 26-6) weiter umgesetzt wird. Diese von 2,3-Epoxypropanol) erhalten werden. Die Reaktion des
Reaktion des Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyltannin mit dem 15 Cyanogenhalogenid aktivierten Polysaccharids oder des Epiha-Epihalohydrin kann in gleicher Weise erfolgen wie die Reak- lohydrin aktivierten Polysaccharids mit dem Alkylamin (Fig. 28 tion von Fig. 8. Ferner kann die Reaktion des Epihalohydrin oder 29) kann bei einer Temperatur von zwischen 4 und 40 °C aktivierten Aminoalkyl- oder Hydroxyalkyltannins mit dem und bei einem pH von 8-12 (im Falle der Verwendung von Cya-Hydroxy- oder Aminopolymer in gleicher Weise durchgeführt nogenhalogenid-aktiviertem Polysaccharid) oder bei einer werden wie die Reaktionen gemäss Fig. 23. Tannin, das an Poly- 20 Temperatur von zwischen 30 und 100 °C und einem pH von saccharide durch die Bindung: 9-14 (für den Fall des Epihalohydrin aktivierten Polysaccha-
-CONH(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2-, rids) in einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen.
-CONH(CH2)nOCH2CH(OH)CH2- oder Die Reaktion von Polysaccharid mit dem Alkylglycidyläther
-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)nNHCH2CH(OH)CH2- gebunden oder Phenylglycidyläther (Fig. 30 oder 31) kann bei einer Tem-ist, kann bei Verwendung von Polysaccharid als Hydroxypoly- 25 peratur von zwischen 30 und 100 °C in einem geeigneten mer gemäss den Reaktionen der Fig. 25-9,25-13 oder 26-6 erhal- Lösungsmittel wie Wasser oder einem wässrigen Alkanol (z.B. ten werden. Wenn das Aminopolymere als wasserunlöslicher wässriges Methanol oder Äthanol) durchgeführt werden. Die Trägerstoff nach dem erfindungsgemässen Verfahren verwen- physikalische Adsorption von Tannin am wasserunlöslichen, det wird, kann Tannin an diesen Trägerstoff gebunden werden hydrophilen Trägerstoff erfolgt augenblicklich bei Kontaktie-ohne Verwendung eines der vorgenannten bifunktionellen Re- 30 ren von Tannin mit dem genannten Trägerstoff in einem wässri-agenzien. So kann z.B. Tannin direkt an den Träger über eine . gen Lösungsmittel (z.B. Wasser). Zum Beispiel erfolgt die Diazogruppe gebunden werden, dadurch dass das Aminopoly- genannte physikalische Adsorption durch Zugabe des Träger-mer mit einem Alkalimetallnitrit (z.B. Natriumnitrit) diazoti- stoffes zu einer wässrigen Tanninlösung und nachfolgendem siert wird, worauf das so erhaltene diazotisierte Aminopolymer Stehenlassen des Gemisches bei einer Temperatur von ca. mit Tannin umgesetzt wird. Die genannte Diazotisierung kann 35 0-50 °C und einem pH von zwischen 3 und 10. Bevorzugte Kon-bei einer Temperatur von 0-20 °C in einem wässrigen Lösungs- zentrationen von Tannin in der Lösung betragen zwischen 0,5 mittel (z.B. Wasser) unter sauren Bedingungen erfolgen, wäh- und 1,0 Gew.-%. Nach dieser genannten Behandlung kann das rend die Kondensationsreaktion des diazotisierten Aminopoly- wasserunlösliche Tanninpräparat durch Filtration oder Zentri-mers mit Tannin (Fig. 27) bei einer Temperatur von 4-20 °C und fugieren gewonnen werden.
bei einem pH von zwischen 7,5 und 10 in einem wässrigen 40 Die wasserunlöslichen Tanninpräparate des erfindungsge-Lösungsmittel (z.B. Wasser) erfolgen kann. Ein Tanninpräparat, mässen Verfahrens weisen eine spezifische und aussergewöhn-bei dem Tannin kovalent an ein Polysaccharid durch die Bin- liehe Affinität zu Proteinen auf und können zum Immobilisieren dung : oder Insolubilisieren von Enzymen verwendet werden. Das heisst ein immobilisiertes Enzym wid in der Weise hergestellt, _ 45 dass es am wasserunlöslichen Tanninpräparat physikalisch
"" 2 adsorbiert wird. Dazu können alle katalytisch wirksamen
Enzyme verwendet werden, und Beispiele für Enzyme zur Herstellung von immobilisierten Präparaten sind die folgenden: gebunden ist, kann bei Verwendung von Aminobenzylpolysac- Oxidoreductasen wie Aminosäureoxidase, Uricase, Catalase, charid als Aminopolymer erhalten werden. 50 Xanthinoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphat-dehydro-
Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemässen Verfahrens ist genäse, Glutamat-dehydrogenase, Cytochrom-C-oxidase, Tyro-die Herstellung von wasserunlöslichen Tanninpräparaten sinase, Lactat-dehydrogenase, Peroxidase, 6-Phosphogluconat-
durch Adsorption von Tannin an einem wasserunlöslichen dehydrogenase und Malat-dehydrogenase; Transfersen wie hydrophilen Trägerstoff. Für diesen Zweck können die Hydro- spartat-acetyltransferase, Aspartat-aminotransferase, Glycin-xypolymere, die Aminopolymere, die Carboxylpolymere, die 55 amino-transferse, Glutamat-oxalacetat-aminotransferase, Glu-Alkylpolymere und die Phenoxyalkylpolymere wie sie vorgän- tamat-pyruvat-aminotransferase, Creatin-phoosphokinase, gig beschrieben wurden, verwendet werden. Darunter sind Histaminmethyltransferase, Pyruvatkinase, Fructokinase, Aminoalkylpolysaccharide, Hydroxyalkylpolysaccharide, Car- Hexokinase, e-Lysin-actyltransferase und Leucin-aminopepti-boxyalkylpolysaccharide, Alkylpolysaccharide und Phenoxyal-, dase; Hydrolasen wie Asparaginase, Acetylcholinesterase, kylpolysaccharide (d.h. ein Polysaccharid mit einer Gruppe der 60 Aminoacylase, Amylase, Arginase, L-Arginin-deiminase, Inver-Formel: -(CH2)mR, worin R Wasserstoff, Phenoxy, Amino, tase, Urease, Uricase, Esterase, ß-Galactosidase, Kallikrein,
Hydroxy oder Carboxyl ist und m eine ganze Zahl von 1-16 Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Naringinase, Nucleotidase, darstellt) besonders geeignet für die physikalische Adsorption Papain, Hyaluronidase, Plasimin, Pectinase, Hesperidinase, von Tannin. Die Aminoalkylpolysaccharide, Hydroxyalkylpoly- Papsin, Penicillinase, Penicillin-amidase, Phospholipase, Phos-saccharide und Carboxyalkylpolysaccharide können in gleicher 65 phatase, Lactase, Lipase, Ribonuklease und Renin; Lyasen wie Weise wie vorgängig beschrieben hergestellt werden. Anderer- spartat-decarboxylase, Aspartase, Citrat-lyase, Glutamat-decar-seits können die Alkylpolysaccharide (z.B. Methylpolysaccha- boxylase, Histidin-ammonium-lyase, Phenylalanin-ammonium-ride, Äthylpolysaccaride, Propylpolysaccharide, Butylpolysac- lyase, Fumarase, Fumarat-hydratase und Malat-synthetase;
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Isomerasen wie Alanin-racemase, Glucoseisomerase, Glucose-phosphat-isomerase, Glutamat-racemase, Lactat-racemase und Methionin-racemase und Lygasen wie Asparaginsynthetase, Glutathion-synthetase und Pyruvat-synthetase. Die genannten Enzyme müssen nicht notwendigerweise in reiner Form vorliegen, sondern es können für den Immobilisierungsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens rohe Enzymlösungen eingesetzt werden, wie z.B. die Extrakte von tierischen oder pflanzli-hen Geweben und die zellfreien Extrakte von Mikroorganismen. Die genannten Extrakte können natürlich teilweise vorgängig gereinigt werden. Ferner kann der Immobilisierungsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung eines Gemisches von zwei oder mehreren der vorgenannten Enzyme erfolgen. Die physikalische Adsorption des Enzyms am wasserunlöslichen Tanninpräparat (d.h. die Immobilisierung des Enzyms) kann durch Kontaktieren des genannten Enzyms mit dem wasserunlöslichen Tanninpräparat in wässri-ger Lösung erfolgen. Zum Beispiel wird das Enzym in Wasser gelöst, worauf das wasserunlösliche Tanninpräparat in der Enzymlösung suspendiert wird und die erhaltene Suspension gerührt wird. Durch dieses Vorgehen wird das Enzym spezifisch an dem Tanninpräparat adsorbiert und andere Verbindungen wie RNA, DNA, Saccharide und niedermolekulare Verbindungen verbleiben gelöst in der Suspension. Nach Durchführen der genannten Operation kann das immobilisierte Enzym leicht dadurch erhalten werden, dass die Suspension filtriert oder zen-trifugiert wird, worauf der erhaltene Rückstand mit einer geeigneten Pufferlösung und/oder Wasser gewaschen wird. Andererseits kann die physikalische Adsorption des Enzyms am wasserunlöslichen Tanninpräparat in einem Säulenverfahren erfolgen. So kann z.B. das wasserunlösliche Tanninpräparat in eine Säule gepackt werden, worauf eine Enzymlösung mit geeigneter Durchflussgeschwindigkeit (z.B. bei einer Durchflussgeschwindigkeit von zwischen 0,1 und 100 h_I) durch die Säule geschickt wird, wobei das Enzym spezifisch am Tanninpräparat adsorbiert wird, während andere Verbindungen die Säule ungehindert passieren. Nach der genannten Behandlung wird ein immobilisiertes Enzym leicht in der Weise erhalten, dass die Säule mit einem geeigneten Puffer und/oder Wasser gewaschen wird. Die genannte physikalische Adsorption von Enzymen an den wasserunlöslichen Tanninpräparaten erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 0-17 °C und bei einem pH von zwischen 2 und 12 in wässriger Lösung. Ferner kann bei Verwendung von Aminoacylase die enzymatische Aktivität einer immobilisierten Aminoacylase dadurch erhöht werden, dass die oben genannte Behandlung in Gegenwart eines Alka-nols (z.B. Butanol) von Aceton oder einem hydrophoben Lösungsmittel (z.B. Äthylenglykol) durchgeführt wird. In jedem Fall wird jedoch das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte immobilisierte Enzym (d.h. das Enzym, das physikalisch am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsorbiert ist) in hohem Mass seine Aktivität während längerer Zeit behalten und ist demzufolge geeignet als heterogener Katalysator für die verschiedensten enzymatischen Reaktionen. Ferner kann wegen der starken Bindung des Enzyms an das wasserunlösliche Tanninpräparat das immobilisierte Enzym wiederholt für enzymatische Reaktionen mit Substraten eingesetzt werden und es tritt keine wesentliche Desorption des gebundenen Enzyms ein auch bei hohen Substratkonzentrationen. Auch kann, wenn nach wiederholtem Gebrauch die Aktivität des genannten Enzyms abnimmt, diese durch Behandeln des genannten Enzympräparats mit einer Lösung, enthaltend 0,01 bis 1,0 N-Salzsäure, 0,01 bis 0,1 N-Natriumhydroxid, ein oberflächenaktives Mittel oder Äthylenglykol, wieder die ursprüngliche Aktivität des Enzyms erhalten werden, nachdem dieses anschliessend mit Wasser gewaschen wurde.
Wie vorgängig erwähnt wurde, adsorbieren die genannten wasserunlöslichen Tanninpräparate keine Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Nukleinsäuren und hochmolekulare Verbindungen, die nicht Proteine sind, sondern sie binden nur Proteine spezifisch und reversibel. Unter Ausnützung dieser Eigenschaften können die wasserunlöslichen Tanninpräparate des erfindungsgemässen Verfahrens als Adsorbenzien zur Trennung und Isolierung von Proteinen aus einer rohen Proteinlösung verwendet werden. So kann z.B. ein Protein aus einer rohen Proteinlösung dadurch isoliert werden, dass die genannte Proteinlösung mit dem wasserunlöslichen Tanninpräparat kontaktiert wird, wobei das gewünschte Protein an dem Tanninpräparat adsorbiert wird, worauf das Tanninpräparat abgetrennt wird und das Protein daraus eluiert wird. Enzyme, Albumin, Globulin, Hormonproteine und andere therapeutisch oder industriell verwendbare Proteine können leicht auf diese Weise gewonnen werden. Ferner können Extrakte von tierischen oder pflanzlichen Geweben, Fermentationslösungen oder zellfreie Extrakte von Mikroorganismen, tierische oder pflanzliche Sekretionsprodukte und irgendwelche andere Proteinlösungen für das genannte Verfahren zur Abtrennung von Proteinen Verwendung finden, vorausgesetzt, dass die Proteine in gelöster Form vorliegen. Die Proteine können am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsorbiert werden, indem dieses Tanninpräparat zu der rohen Proteinlösung gegeben wird, worauf das Gemisch während ca. 1 bis 24 h gerührt wird. Vorzugsweise erfolgt diese Adsorption bei einer Temperatur von 0-60 °C und bei einem pH von 2-12. Bei der Durchführung des Adsorptionsschrittes ist bevorzugt eine rohe Proteinlösung zu verwenden mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit von 0-400 m • ohm-1. Nach Durchführen des Adsorptionsschrittes können die wasserunlöslichen Tanninpräparate mit den daran adsorbierten Proteinen leicht durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden, worauf durch Elution der genannten Tanninpräparate mit einem geeigneten Lösungsmittel die Proteine in hoher Reinheit gewonnen werden können. Stark saure Lösungen (z.B. 0,01-1 N-Salzsäure), stark alkalische Lösungen (z.B. 0,01-1 N-Natriumhydroxid), wässrige Lösungen von oberflächenaktiven Stoffen, wässrige Lösungen von 3 bis 6M Harnstoff, Äthanol und n-Butanol sind geeignete Elutionsmittel. Wenn die adsorbierten Proteine Enzyme sind, kann auch eine Lösung, enthaltend Enzyminhibitoren als Elutionsmittel verwendet werden. Ferner kann das genannte Adsorptions- und Elutionsverfahren auf einer Säule erfolgen. Das wasserunlösliche Tanninpräparat wird z.B. in eine Säule gegeben, worauf nach Waschen mit Wasser und/oder einer Pufferlösung eine Proteinlösung (pH 3-10) in einer geeigneten Durchflussrate (z.B. mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,01-100 h-1) durch die Säule geschickt wird. Dadurch werden die in der Lösung enthaltenen Proteine am Tanninpräparat adsorbiert und andere in der Lösung enthaltene Verbindungen passieren die Säule ungehindert. Die adsorbierten Proteine können anschliessend unter Verwendung eines der oben genannten Elutionsmittels aus der Säule gewaschen werden. In jedem Fall kann die Adsorption und die nachfolgende Elution ohne Denaturierung der Proteine erfolgen und es können bei Verwendung roher Enzymlösungen Enzyme hoher biologischer Aktivität erhalten werden, die nicht durch Aminosäuren, organische Säuren, Nukleinsäuren und andere hochmolekulare Verbindungen verunreinigt sind.
Alkoholische Getränke wie «Japanese Sake» (ein fermen-tierter Likör, hergestellt aus Reis), Bier oder Wein, flüssige Würzmittel wie Essig oder Sojasauce und Fruchtsäfte wie Orangen-, Apfel- oder Traubensaft sind normalerweise durch Proteine verunreinigt, entweder stammend von den Ausgangsprodukten oder von Mikroorganismen, wie sie bei der Fermentierung verwendet werden. Die enthaltenen Proteine vermindern die Qualität der genannten flüssigen Produkte und sie bewirken auch eine schlechte Haltbarkeit derselben. Die genannten Produkte müssen deshalb vor dem Verkauf speziell
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behandelt werden, um die Sedimentierung der genannten Proteine zu verhindern und demzufolge die Haltbarkeit der Produkte zu verbessern. Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten wasserunlöslichen Tanninpräparate können nun als Adsorbenzien zur Entfernung der genannten Proteine aus den genannten flüssigen Produkten verwendet werden. So können z.B. die in den genannten Produkten enthaltenen Proteine einfach durch Kontaktieren mit den wasserunlöslichen Tanninpräparaten an denselben adsorbiert werden, worauf die Tanninpräparate mit den daran adsorbierten Proteinen durch Filtrieren oder Zentrifugieren vom Gemisch getrennt werden. Da die wasserunlöslichen Tanninpräparate weder Aminosäuren, Nukleinsäuren, noch andere Verbindungen adsorbieren, die den Geschmack, den Geruch und/oder die Farbe der genannten löslichen Produkte ausmachen, sind die Tanninpräparate besonders geeignet zur Entfernung von Proteinverunreinigungen aus den genannten flüssigen Produkten, ohne deren Qualität in irgendeiner Weise zu beeinträchtigen. In gleicher Weise können auch Heilmittel oder andere chemische Reagenzien, die durch Proteine verunreinigt sind, wie oben beschrieben gereinigt werden. Da die Tanninpräparate nach dem erfindungsgemässen Verfahren stabil sind und kein Tannin in die Lösung abgeben, können in jedem Fall die verschiedensten Lösungen (z.B. alkoholische Getränke, flüssige Würzstoffe, Fruchtsäfte und wässrige Lösungen von Heilmitteln oder chemischen Reagenzien) gereinigt werden, ohne dass sie mit Tannin verunreinigt werden. Ferner können die Tanninpräparate mit daran adsorbierten Proteinen nach Entfernung aus den flüssigen Produkten durch Behandeln mit Elutionsmit-teln-vie 0,01-1 N-Salzsäure, 0,01-1 N-Natriumhydroxid, wässrigen Lösungen von oberflächenaktiven Stoffen, wässrigen Lösungen von 3-6M Harnstoff, Äthanol oder n-Butanol, von den genannten adsorbierten Proteinen befreit werden. Tanninpräparate können so regeneriert werden und wieder eingesetzt werden.
Schliesslich können die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten wasserunlöslichen Tanninpräparate zum Steuern von enzymatischen Reaktionen verwendet werden. So kann z.B. nach Umsetzen eines Enzyms mit einem Substrat während einer gewissen Zeit die Reaktion durch Zugabe des Tanninpräparats zum Gemisch von Enzym und Substrat in der Weise gestoppt werden, dass das Enzym am Tanninpräparat adsorbiert wird, worauf das Tanninpräparat abfiltriert oder abzentrifugiert werden kann. Dadurch können auch Substrate und Reaktionsprodukte die Hitze instabil sind oder die empfindlich sind auf pH-Änderungen, ohne Zersetzung aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, da die Beendigung der enzymatischen Reaktion und die Entfernung des Enzyms ohne Erhitzen oder Verändern des pH im Gemisch erfolgen kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren soll durch die nachfolgend genannten Beispiele näher erläutert werden. In all diesen Beispielen wurde der Anteil von Protein nach der Kupfer-Folin-Methode, beschrieben in «Journal of Biological Chemi-stry», 193,265 (1951), bestimmt.
Beispiel 1
(1) 4 g Cellulosepulver (hergestellt durch Toyo Roshi Co., unter dem Handelsnamen «Cellulose Powder C») wurden in 40 ml einer wässrigen Natriumhydroxidlösung aufgeschlämmt. Zu der Suspension wurden 10 ml Epichlorhydrin gegeben und das erhaltene Gemisch bei 60 °C während 30 min kräftig gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Epichlorhydrin-akti-vierte Zellulose abfiltriert, mit Wasser gewaschen und anschliessend in 80 ml einer wässrigen Lösung (pH 10), enthaltend Hexamethylendiamin (Gehalt von Hexamethylendiamin: 2,2 g/80 ml) suspendiert. Diese Suspension wurde während 2 h bei 60 °C gerührt, worauf der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Was634101
ser gewaschen wurde. Man erhielt 10,5 g (Feuchtgewicht) Ami-nohexyl-Cellulose.
(2) 10,5 g chinesisches Galläpfeltannin wurden in 240 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 10 eingestellt und 0,3 ml Epichlorhydrin wurden zugegeben. Das Gemisch wurde während 2 h bei 30 °C gerührt, wodurch eine Epichlorhydrin-aktivierte Galläpfeltanninlösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurden 10,5 g (Feuchtgewicht) Aminohexyl-Cellulose wie oben erhalten (1) gegeben und das erhaltene Gemisch wurde während 6 h bei 45 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert, und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 11,3 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Galläpfeltannin, kovalent gebunden an Cellulose durch die Bindung: -CH2-CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-).
(3) 200 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 4000 jx Mole/h) erhalten aus Aspergillus orizae wurden in 6 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung (pH 8,0) enthaltend 0,2 Vol.-% n-Butanol gelöst. 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (2) wurden zu dieser Ami-noacylaselösung gegeben und das Gemisch bei 37 °C während 30 min gerührt. Anschliessend wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Prä-parats (d.h. Aminoacylase adsorbiert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Es zeigte sich, dass die Aminoacylase-Aktivi-tät 9,376 |j, Mole/h pro 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats betrug. (Die Aminoacylase-Aktivität wird gemessen in Mikromolen von L-Methionin, das bei der Reaktion mit N-Acetyl-DL-methionin bei 37 °C und bei pH 7,0 gebildet wird.)
Beispiel 2
(1) 10,5 g (Feuchtgewicht) Aminohexyl-cellulose wurden aus 4 g Cellulosepulver in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Aminohexyl-cellulose wurde in 100 ml einer wässrigen 1 N Natriumhydroxidlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 6 ml Epichlorhydrin gegeben und das Gemisch anschliessend bei 60 °C während 30 min gerührt. Die so erhaltene Epichlorhydrin aktivierte Aminohexyl-cellu-lose wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Eine Lösung (pH 10) von 5,2 g chinesischem Gallotannin in 100 ml Wasser wurde zu der Epichlorhydrin aktivierten Aminohexyl-cellulose gegeben und das erhaltene Gemisch bei 45 °C während 6 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit einer wässrigen 0,1 M Natrium-carbonatlösung und anschliessend mit Wasser gewaschen. Man erhielt 11,4 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose durch die Bindung: -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2-CH(OH)CH2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparates, erhalten nach Abschnitt (2) und 200 mg Aminoacylase wurde ein gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 525 mg eines immobilisierten Amino-acylase-Präparats. Dieses Präparat zeigte die Aminoacylase-Aktivität von 8,900 [i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 3
(1) 4 g Cellulosepulver wurden in 40 ml einer wässrigen 25%igen Natriumhydroxidlösung bei 25 °C während 30 min gerührt und anschliessend mit Wasser gewaschen. 10 g der feuchten Cellulose wurden in 100 ml einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert, die Suspension auf pH 11,5 eingestellt und mit 0,4 g Cyanogenbromid versetzt. Das
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Gemisch wurde anschliessend während ca. 8 min bei 20-25 °C gerührt, wobei durch Zugabe von wässriger 5 N Natriumhydroxidlösung das pH auf 11-11,5 gehalten wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung 5 gewaschen, auf ca. 4 °C abgekühlt und mit kaltem Wasser gewaschen. Man erhielt so eine Cyanogenbromid aktivierte Cellulose.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin werden in 100 ml Wasser gelöst, die Lösung auf pH 11,5 eingestellt und bei einer Tempe- 10 ratur von 20 °C werden 0,2 g Cyanogenbromid zugegeben und bei derselben Temperatur während 8 min gerührt. Während der Reaktion wurde das pH auf zwischen 11 und 11,5 gehalten. Die auf diese Weise erhaltene Lösung von Cyanogenbromid aktiviertem chinesischem Gallotannin wurde auf pH 10 einge- 15 stellt und mit einer Lösung (pH 10) von 2,3 g Hexamethylendiamin in 30 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wurde anschliessend bei 25 °C während 2 h gerührt, wobei eine Aminohexyl-chinesisches Gallotannin-Lösung erhalten wurde. Die gemäss Abschnitt ( 1 ) erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Cellulose 20 wurde zu der Aminohexylchinesischen-Gallotannin-Lösung gegeben und das Gemisch bei 25 °C während 20 h gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen. Man 25 erhielt 11,4 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-).
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des nach Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tanninpräparats und 200 mg Aminoacy- 30 läse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 530 g (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Aminoacylase. Die Aminoacylase-aktivität betrug 10,600 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats. 35
Beispiel 4
(1) 4 g Cellulosepulver und 0,4 g Cyanogenbromid wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 3-(l) beschrieben verarbeitet. Die auf diese Weise erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Cel- 40 lulose wurde in 100 ml einer wässrigen Lösung (pH 10), enthaltend Hexamethylendiamin suspendiert (Gehalt von Hexamethylendiamin: 2,3 g/100 ml). Die Suspension wurde bei 25 °C während 2 h gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der Niederschlag abfiltriert, mit einer wässrigen 0,1 M Natrium-45 bicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 10,6 g (Feuchtgewicht) von Aminohexyl-cellulose.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin und 0,2 g Cyanogenbromid wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 3-(2) beschrieben verarbeitet. Die Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung 50 wurde auf pH 10 eingestellt durch Zugabe von 5 N Salzsäure und eine Lösung (pH 10) von 2,0 g e-Aminocapronsäure in 30 ml Wasser wurde dazugegeben. Das Gemisch wurde anschliessend während 2 h bei 25 °C gerührt, wobei eine Carboxypentyl-gallotanninlösung erhalten wurde. In dieser Carboxypentyl-gal- 55 lotanninlösung wurden 10,6 g (Feuchtgewicht) der nach Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-cellulose suspendiert und das pH der Suspension auf 4,8 eingestellt. 4 ml einer wässrigen 20% 1 -Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Lösung wurden tropfenweise zu der Suspension während 5 min gege- 60 ben. Während dieser tropfenweisen Zugabe wurde das pH der Suspension durch Zugabe von 0,5 N-Salzsäure auf ca. 4,8 gehalten. Die Suspension wurde anschliessend während 20 h bei
28 °C gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit einer wässrigen 0,1 M Natri- 65 umbicarbonatlösung und anschliessend mit Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 11,5 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparates (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)s-CONH-(CH2)6-NHCO-).
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des nach Abschnitt (2) erhaltenen wasserunlöslichen Tanninpräparats und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 7,400 |_i Mol/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 5
(1) 10,5 g (Feuchtgewicht) von Aminohexyl-cellulose wurden aus 4 g Cellulosepulver in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben hergestellt.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin und 0,2 g Cyanogenbromid wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 3-(2) beschrieben verarbeitet. Die Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung wurde anschliessend auf pH 10 durch Zugabe von 5 N Salzsäure eingestellt und eine Lösung (pH 10) von 3,1 g Äthylendi-amin in 30 ml Wasser wurden zugegeben. Das Gemisch wurde anschliessend bei 25 °C während 2 h gerührt, worauf 0,2 ml Epichlorhydrin zum Gemisch gegeben wurden und worauf dieses während weiterer 2 h bei 25 °C gerührt wurde. Man erhielt eine Epichlorhydrin aktivierte Aminoäthyl-gallotanninlösung. 10,5 g (Feuchtgewicht) der nach Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-cellulose wurden zu der Epichlorhydrin aktivierten Aminoäthyl-gallotanninlösung gegeben und das Gemisch während 2 h bei 45 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Man erhielt 11,1g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONHCH2CH2NHCH2CH(OH)CN2NH-(CH2)5NHCH2CH(OH)CH2-).
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (2) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 505 mg (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Aminoacylase. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 2,900 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 6
(1) 10,6 g (Feuchtgewicht) Aminohexyl-cellulose wurden aus 4 g Cellulosepulver wie in Beispiel 4-(l) beschrieben hergestellt.
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin wurden in 100 ml Wasser gelöst und die Lösung auf pH 11,5 eingestellt, und anschliessend mit 0,2 g Cyanogenbromid versetzt. Das Gemisch wurde während 8 min bei einer Temperatur von 20-25 °C gerührt, wobei während der Reaktion das Gemisch durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxidlösung auf pH 11-11,5 gehalten wurde. Die auf diese Weise erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung wurde auf pH 11,0 eingestellt. 10,6 g (Feuchtgewicht) der nach Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexyl-cellulose wurden in der Cyanogenbromid aktivierten Gallotanninlösung suspendiert und die Suspension während 2 h bei 40 °C langsam gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Man erhielt 11,6 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-).
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten nach Abschnitt (2) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten
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Aminoacylase-Präparats wurden erhalten. Die Aminoacylase-Aktiviät betrug 11,000 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 7 5
(1) 10,5 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. Galläpfeltannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-) wurden aus 5 g Galläpfeltannin in gleicher Weise wie in Beispiel 6-(2) beschrieben hergestellt. io
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten nach Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 525 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase- i s Aktivität betrug 9,800 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 8
(1) 10,9 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tannin- 20 präparats (d.h. Dattelpflaumentannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-) wurden aus 100 ml Dattelpflaumentannin in gleicher Weise in Beispiel 6-(2) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats erhalten nach Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 7,600 (i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
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Beispiel 9
(1) 10,5 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. Catecholtannin, kovalent gebunden an Cellulose 35 über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-) wurden aus 3 g Catecholtannin in gleicher Weise wie in Beispiel 6-(2) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten nach Abschnitt (1 ) und 200 mg Aminoacy- 40 läse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats, das die Aktivität von 2,100 [x Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aufwies. 45
Beispiel 10
(1) Eine Aminohexyl-chinesisches Gallotanninlösung wurde aus 5,2 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 3-(2) beschrieben hergestellt. Zu der Lösung wurden 0,3 ml 50 Epichlorhydrin gegeben und das Gemisch anschliessend während 2 h bei 30 °C gerührt, wobei eine Epichlorhydrin aktivierte Aminohexylgallotanninlösung erhalten wurde. 10 g Cellulose (vorbehandelt mit einer Natriumhydroxidlösung wie in Beispiel Hl) beschrieben) wurden zu der Epichlorhydrin aktivierten 55 Aminohexylgallotanninlösung gegeben und das Gemisch während 20 h bei 45 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert, und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Man erhielt 11,0 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen. 60 Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt ( 1 ) und 200 mg Amino- 65 acylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 510 mg eines immobilisierten Ami-noacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug
1,200 p, Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 11
(1) Epichlorhydrin aktivierte Cellulose wurde aus 4 g Cellulosepulver in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben hergestellt. Diese Epichlorhydrin aktivierte Cellulose wurde in 80 ml einer wässrigen Lösung (pH 10) enthaltend 2-Aminoäthanol (Gehalt von 2-Aminoäthanol: 3,1 g/80 ml) suspendiert. Die Suspension wurde während 20 h bei 60 °C gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 10,4 g (Feuchtgewicht) Aminoäthylcellulose.
(2) 10,5 g chinesisches Gallotannin wurden in 240 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 10 eingestellt und mit 0,3 ml Epichlorhydrin versetzt. Das Gemisch wurde anschliessend während 2 h bei 30 °C gerührt, wobei eine Epichlorhydrin aktivierte Gallotanninlösung erhalten wurde. 10,4 g (Feuchtgewicht) der Aminoäthylcelluloe-Lösung, erhalten nach Abschnitt (1) wurde zu der Epichlorhydrin aktivierten Gallotanninlösung gegeben und das Gemisch bei 45 °C während 3 h gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert wurde und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 11,1 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparates (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CH2CH-(OH)-CH2NHCH2CH20CH2CH(0H)CH2-).
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten nach Abschnitt (2) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 2,410 |x Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 12 1
(1) Epichlorhydrin aktiverte Cellulose und eine Aminohe-xyl-Gallotanninlösung wurden aus 4 g Cellulosepulver und 5,2 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel Hl) bzw. Beispiel 3-(2) beschrieben hergestellt. Die Epichlorhydrin aktivierte Cellulose wurde zu der Aminohexyl-Gallotan-ninlösung gegeben und das Gemisch während 4 h bei 45 °C gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 10,9 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)ó-NHCH2CHCOH)CH2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 9,430 (i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats.
Beispiel 13
(1) 15 g 2-Hydroxy-3-[4-(2,3-epoxypropyloxy)-butyloxy]-pro-pyl-agarose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals unter dem Handelsnamen «Epoxy-activated Sepharose 6B») wurden mit 500 ml Wasser, 500 ml einer wässrigen 0,5 M Natriumchloridlösung und nochmals mit 500 ml Wasser gewaschen. 1 g chinesisches Gallotannin, gelöst in 100 ml einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung wurden zu der genannten Agarose gegeben. Das Gemisch wurde anschliessend mit einer
634101 12
wässrigen 8 N Natriumhydroxidlösung auf pH 10,5 eingestellt Weise wie in Beispiel 14-(2) beschrieben hergestellt und während 26 h bei 37 °C geschüttelt. Nach Beendigung der (2) 500img (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin-
Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und präparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Amino-
nache'ilnander mit 1 Liter Wasser, 500 ml einer 0,2 M Carbonat- acylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrie-
Pufferlösung (pH 10) und 1 Liter Wasser gewaschen. Man 5 ben verarbeitet. Man erhielt 505 mg (Feuchtgewicht) eines erhielt 14,9 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tannin- immobilisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase-
präparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Aktivität betrug 1,720 p. Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des
Agarose über die Bindung: -CH2CH(0H)CH20-(CH2)4- wasserunlöslichen Tanninpräparats.
OCH2CH(OH)CH2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin- '<> Beispiel 16
präparats, erhalten in Abschnitt ( 1 ) und 200 mg Aminoacylase (1 ) 1,3 g chinesisches Gallotannin wurden in 50 ml Wasser wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben ver- gelöst, das pH der Lösung durch Zugabe einer wässrigen 5 N
arbeitet. Man erhielt 490 mg (Feuchtgewicht) eines immobili- Natriumhydroxidlösung auf 11,5 eingestellt und mit 200 mg sierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität Cyanogenbromid versetzt. Das Gemisch wurde während 8 min betrug 800 (i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlös- 15 bei 25 °C gerührt, wobei während der Reaktion das pH auf liehen Tanninpräparats. 11-11,5 gehalten wurde. Die auf diese Weise erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung wurde zu 1 g Amino-
Beispiel 14 hexyl-Agarose gegeben (hergestellt durch Pharmacia Fine
( 1 ) 4 g Agarose (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemi- Chemicals unter dem Handelsnamen «AH-Sepharose 4B»)
cals unter dem Handelsnamen «Sepharose 4B») wurden nach- 20 (vorgängig gewaschen mit 500 ml Wasser, 500 ml einer wässri-
einander mit 500 ml Wasser, 500 ml einer wässrigen 0,5 M gen 0,5 M Natriumchloridlösung und 500 ml Wasser) und das
Natriumchloridlösung und nochmals mit 50 ml Wasser gewa- Gemisch wurde während 16 h bei 30 °C gerührt, worauf nach sehen. Die genannte Agarose wurde anschliessend in 500 ml Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbo-
und die Suspension auf pH 11,5 eingestellt. Nachher wurden 25 natlösung und Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 1,1 g
0,4 g Cyanogenbromid zu der Suspension gegeben und das (Trockengewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats
Gemisch während ca. 8 min bei einer Temperatur von 20-25 °C (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Agarose gerührt. Während der Reaktion wurde das pH im Gemisch auf über die Bindung: -CONH-(CH2)e-NHCO-).
11 -11,5 gehalten, worauf anschliessend der gebildete Nieder- (2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninschlag abfiltriert und nacheinander mit 1 Liter einer wässrigen 30 präparats, erhalten nach Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacy-0,1 M Natriumbicarbonatlösung (ca. 4 °C) und 1 Liter kaltem läse wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben Wasser gewaschen wurde. Man erhielt eine Cyanogenbromid verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobi-aktivierte Agarose. lisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase-Aktivität
(2) 5,2 g chinesisches Gallotannin wurden in 100 ml Wasser betrug 2,270 n Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserungelöst und das pH der Lösung auf 11,5 eingestellt. 0,2 g Cyano- 35 löslichen Tanninpräparats.
genbromid wurden zu der Lösung bei einer Temperatur von
20 °C gegeben und das Gemisch bei derselben Temperatur Beispiel 17
während 8 min gerührt. Während der Reaktion wurde das pH (1) 3,6 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tannin-
im Gemisch auf 11 -11,5 gehalten und nach Beendigung der präparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an
Reaktion durch Zugabe von 5 N Salzsäure auf pH 10 einge- 40 Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCOCH2-)
stellt. Eine Lösung (pH 10) von 2,3 g Hexamethylendiamin in wurden hergestellt aus 1,3 g chinesischem Gallotannin und 1 g
30 ml Wasser wurde zum Reaktionsgemisch gegeben und die- Aminohexylcellulose (hergestellt durch Merck Co. unter dem ses während weiterer 2 h bei 25 °C gerührt, wobei eine Amino- Handelsnamen «AH-Cellulose») in gleicher Weise wie in Bei-
hexyl-Gallotanninlösung erhalten wurde. Die gemäss Abschnitt spiel 16-(1) beschrieben.
( 1 ) erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Agarose wurde zu 15
der Aminohexyl-Gallotanninlösung gegeben und das Gemisch Beispiel 18
bei 25 °C während 2 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktion (1) 2 g p-Aminobenzylcellulose (hergestellt durch Seravac wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander Co. unter dem Handelsnamen «PAB-Cellulose») wurden mit mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Was- 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend in 50 ml 2 N Salz-
ser gewaschen. Man erhielt 3,6 g (Trockengewicht) eines was- so säure suspendiert und auf 4 °C abgekühlt. 10 ml einer wässrigen serunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, 14%igen Natriumnitritlösung, die auf ca. 4 °C abgekühlt wurde,
kovalent gebunden an Agrose über die Bindung: wurde tropfenweise zu der Suspension während 5 min und
-CONH-(CH2)6-NHCO-). unter Umrühren gegeben. Die genanne Suspension wurde bei
(3) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin- 0 °C während einer weiteren Stunde gerührt. Die auf diese präparats, erhalten gemäss Abschnitt (2) und 200 mg Amino- 55 Weise erhaltene diazotierte p-Aminobenzylcellulose wurde acylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrie- abfiltriert und nacheinander mit 100 ml einer wässrigen l%igen ben verarbeitet. Man erhielt 480 mg (Feuchtgewicht) eines Sulfonsäurelösung, die auf ca. 4 °C abgekühlt wurde und 300 ml immobilisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase- kaltem Wasser gewaschen. Eine Lösung von 1,3 g chinesischem Aktivität betrug 2,600 |x Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des Gallotannin in 40 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10) wasserunlöslichen Tanninpräparats. 60 wurde zu der diazotierten p-Aminoenzylcellulose gegeben. Das
Gemisch wurde anschliessend durch Zugabe von 8 N Natrium-
Beispiel 15 hydroxidlösung auf pH 9,2 eingestellt und während 20 min bei
( 1 ) 4,5 g (Trockengewicht) eines wasserunlöslichen Tannin- 25 °C geschüttelt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der präparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinaner mit 0,1 M
Divinylsulfon-kreuzvernetztes Dextran über die Bindung: 65 Carbonatpufferlösung (pH 10) und Wasser gewaschen. Man
-CONH-(CH2)6-NHCO-) wurden aus 4 g Divinylsulfon-kreuz- erhielt 4,7 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tannin-
vernetztem Dextran (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemi- präparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an cals unter dem Handelsnamen «Sephadex G-l 00») in gleicher Cellulose über die Bindung
13
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-N=N-^>>ch2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Aminoacylase. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 540 p. Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 19
(1) 4,9 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tannin-präparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung:
-CONH o CH2-)
wurden aus 1,3 g chinesischem Gallotannin und 2 g p-Aminobenzylcellulose in gleicher Weise wie in Beispiel 16-( 1 ) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines imn/-»bilisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 610 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats.
Beispiel 20
(1) 1 g p-Aminobenzylcellulose wurde mit Wasser gewaschen und anschliessend in 25 ml 2-N Salzsäure, gekühlt auf ca. 4 °C suspendiert. 5 ml einer wässrigen 14%igen Natriumnitritlösung wurde tropfenweise zu der Suspension gegeben, die auf
4 °C gehalten wurde, worauf die Suspension während 1 h bei
5 °C gerührt wurde. Die auf diese Weise erhaltene diazotierte p-Aminobenzylcellulose wurde abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die diazotierte p-Aminobenzylcellulose wurde in 30 ml einer 0,1 M Boratpufferlösung (pH 8) suspendiert und mit 500 mg Hexamethylendiamin versetzt. Die diazotierte p-Aminobenzylcelluloe-Suspension wurde anschliessend auf pH 9,5 eingestellt und während 20 h bei 25 °C gerührt. Die auf diese Weise erhaltene p-Aminohexylazobenzyl-cellulose wurde abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Eine Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung, hergestellt aus 0,7 g chinesischem Gallotannin wie in Beispiel 16-(1) beschrieben, wurde zu der p-Aminohexylazobenzyl-cellulose gegeben und das Gemisch während 16 h bei 10,5 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 2,3 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, koalent gebunden an Cellulose über die Bindung:
-CONH- (CH2) 6-N=N~£^ CH2- ).
10
betrug 745 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 21
(1) 1,1 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an poröses Glas über die Bindung:
-CCim-( CH2 ) 6-N=NCONH-( CH) V-
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase-Aktivität wurden hergestellt aus 1 g p-Aminobenzamidopropyl-porösem Glas (hergestellt durch Corning Glass Works unter dem Hanls delsnamen «Enchol») und 0,7 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 20-(l) beschrieben.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrie-20 ben verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylasepräparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 4,530 |i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats.
25 Beispiel 22
(1) 500 mg Wolle wurden in 30 ml einer wässrigen 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) dispergiert. 500 mg Hexamethylendiamin und 200 mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-car-bodiimid wurden zu der Dispersion gegeben, worauf diese auf
30 pH 6,0 eingestellt wurde und während 20 h bei 25 °C gerührt wurde. Die auf diese Weise erhaltene Aminohexyl-Wolle wurde abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Eine Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung, hergestellt aus 5,2 g 35 chinesischem Gallotannin wie in Beispiel 16-( 1 ) beschrieben, wurde zu der Aminohexyl-Wolle gegeben und das Gemisch während 16 h bei 10 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Was-40 ser gewaschen. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Wolle über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NH-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin-45 präparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 420 jj, Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des so wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 23
(1) 530 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden
55 an Polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacryl-amid über die Bindung: -CONH-(CH2)e-NHCOCH2-) wurden aus 500 mg Carboxymethyl-polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid (hergestellt durch Bio-Rad Co. unter dem Handelsnamen «Bio-Gel CM-2») und 0,6 g chinesi-60 schem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 22-(l) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrie-
65 ben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 1,920 [i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats.
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14
Beispiel 24
(1) 505 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Polymethacrylsäure, kreuzvernetzt mit Divinylbenzol über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NH-) wurden hergestellt aus 500 mg Polymethacrylsäure, kreuzvernetzt mit Divinylbenzol (hergestellt durch Rohm & Haas Co., unter dem Handelsnamen «Amberlite IRC-50») und 0,6 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 22-(l) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 1,010 (j, Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 25
(1) 1 g Chitosan (hergestellt durch Kyowa Yushi Kogyo Co, unter dem Handelsnamen «Fronac N») wurden in 30 ml einer wässrigen 0,1 N Natriumhydroxidlösung suspendiert und mit 0,5 ml Epichlorhydrin versetzt. Das Gemisch wurde während 24 h bei 30 °C gerührt, worauf das auf diese Weise erhaltene Epichlorhydrin aktivierte Chitosan abfiltriert und nacheinander mit wässriger 0,1 M Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen wurde. Das Epichlorhydrin aktivierte Chitosan wurde anschliessend in 30 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend chinesisches Gallotannin (Gehalt vom Tannin: 1 g/30 ml) suspendiert. Die Suspension wurde während 16 h bei 45 °C gerührt, worauf nach Beendigung der Reaktion der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen wurde. Man erhielt 1,1 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Chitosan über die Bindung: -CH2CH(OH)CH2-).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 510 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 480 ja. Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 26
(1) 1,1 g (Trockengewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid über die Bindung:
-CONH- (CH2) 6-N=N-^)- )
wurde hergestellt aus 1 g p-Aminophenyl-polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid und 0,6 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 20-(l) beschrieben.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 640 u Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 27
(1) 1,1 g (Trockengewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Polyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid über die Bindung: -CONH-(CH2)s-) wurden hergestellt aus 1 g Hydrazinopolyacrylamid, kreuzvernetzt mit N,N'-Methylen-5 bisacrylamid (hergestellt durch Koch-Light Labs Ltd., unter dem Handelsnamen «Enzacryl AH») und 0,6 g chinesischem Gallotannin in gleicher Weise wie in Beispiel 20-(l) beschrieben hergestellt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin-10 präparats, erhalten gemäss Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 520 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylasae-Präparats. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 480 ji Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des '5 wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 28
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: 20 -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde hergestellt wie in Beispiel l-(2) beschrieben. 25 mg Glucoseiso-merase (totale Aktivität: 690 Einheiten) wurden in 20 ml einer wässrigen 0,1 M Natriumchloridlösung gelöst und zu 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats gege-25 ben und das Gemisch während 20 min bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 500 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Glucoseisomerase-Präparats (d.h. Glucoseiso-merase adsorbiert an wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die 30 Isomerase-Aktivität betrug 326 Einheiten. (1 Einheit Glucose-isomerase ist definiert als die enzymatische Aktivität, die bei der Reaktion mit einer 3,6% Glucoselösung und bei 70 °C während 1 h in Gegenwart von 0,025 M Magnesiumsulfat 1 mg Fruktose liefert.)
35
Beispiel 29
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)ó-NHCO-) wurde in gleicher Weise wie in Bei-io spiel 6-(2) beschrieben hergestellt. 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats und 25 mg Glucoseisome-rase (totale Aktivität: 690 Einheiten) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 28 beschrieben verarbeitet. Man erhielt 500 mg (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Glucoseisomerase (d.h. « Glucoseisomerase adsorbiert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Die Aktivität der Glucoseisomerase betrug 319 Einheiten.
Beispiel 30
so 250 mg Papain wurden zu 100 ml einer wässrigen 0,01 M Zitronensäure-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 6,2) enthaltend 5 mM Cystein und 1 mM Äthylendiamintetraessigsäure, gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 min gerührt und anschliessend filtriert. 500 mg (Feuchtge-55 wicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CH2CH(OH)-CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-), hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben, wurden zu 20 ml des Filtrats (Papain-Aktivität: 64 Einheiten) 6o gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 500 mg eines immobilisierten Papainpräparats (d.h. Papain, adsorbiert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Die Papain-Aktivität betrug 20 Einhei-65 ten. (Eine Einheit von Papain ist definiert als diejenige enzymatische Aktivität, die 1 ji. Mol vom a-Benzoyl-arginin-äthylester durch Reaktion mit diesem Ester bei pH 6,2 während 1 min zersetzt.)
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Beispiel 31 immobilisierten ß-Galactosidase-Präparats erhalten wurden
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches (d.h. ß-Galactosidase, adsorbiert an wasserunlöslichem Tannin-Gallotannin, koralent gebunden an Cellulose über die Bindung: präparat). Die ß-Galactosidase-Aktivität betrug 75 Einheiten. -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde (Eine Einheit ß-Galactosidase ist definiert als diejenige enzyma-in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt. 5 tische Aktivität, die bei der Reaktion mit o-Nitrophenol-ß-galac-20 ml einer wässrigen Lösung (pH 5,0) Glucoseoxidase (totale topyranosid bei 37 °C und pH 6,5 während 1 min p Mol o-Nitro-Aktivität: 376 Einheiten) erhalten aus Aspergillus niger, wurden phenol erzeugt.)
zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C gerührt. Beispiel 35
Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser 10 Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches gewaschen. Man erhielt 1,1g (Feuchtgewicht) eines immobili- Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: sierten Glucoseoxidase-Präparats (d.h. Glucoseoxidase, adsor- -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde biert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Die Glucoseoxy- in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt. dase-Aktivität betrug 162 Einheiten. (Eine Einheit Glucoseoxy- 4 ml einer wässrigen Lösung von Aspartase (totale Aktivität: dase ist definiert als diejenige enzymatische Aktivität, die 1 p 15 40,000 p Mole/h) wurden zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserun-Mol Glucose bei einer Temperatur von 35 °C, einem pH von 5,1 löslichen Tanninpräparats gegeben und das Gemisch während und während 1 min in Gluconsäure und H2O2 umsetzt.) 30 min bei 25 °C geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man Beispiel 32 erhielt 1,05 g (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aspartase-
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches 20 Präparats (d.h. Aspartase, adsorbiert an wasserunlöslichem Galloannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: Tanninpräparat). Die Aspartase-Aktivität betrug 14,410 p -CONH-(CH2)6-NHCO-) wurde in gleicher Weise wie in Bei- Mole/h. (Die Aspartase-Aktivität ist angegeben in Mikromolen spiel 6-(2) beschrieben hergestellt. 50 mg Hesperiginase (totale L-Asparaginsäure, die durch Reaktiofi mit 1 M Ammoniumfu-Aktivität: 1,900 Einheiten), gelöst in 100 ml einer 0,01 M Acetat- marat bei 37 °C und pH 8,5 gebildet wurde.)
Pufferlösung (pH 4,3) wurden zu 500 mg (Feuchtgewicht) des 25 wasserunlöslichen Tanninpräparats gegeben und das Gemisch Beispiel 36
während 30 min bei 35 °'C gerührt. Der gebildete Niederschlag Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen, Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: wobei 500 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Hesperi- -CH2CH(OH)CH2NH-(CHz)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde ginase-Präparats erhalten wurden (d.h. Hesperiginase, adsor- 30 in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt, biert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die Hesperigi- 5 ml einer wässrigen Lösung von Fumarase (totale Aktivität: nase-Aktivität betrug 703 Einheiten. (Eine Einheit Hesperigi- 43,000 p Mole/h), erhalten aus Brevibacterium ammoniagenes nase ist definiert als diejenige enzymatische Aktivität, die bei wurden zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninder Reaktion mit 0,1% Hesperidin bei 40 °C und pH 3,8 wäh- präparats gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C rend 30 min ein mg Ramnose produziert.) 35 geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 0,98 g (Feuchtge-Beispiel 33 wicht) eines immobilisierten Fumarase-Präparats erhalten wur-
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches den (d.h. Fumarase, adsorbiert an wasserunlöslichem Tannin-Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: präparat). Die Fumarase-Aktivität betrug 7,300 ji Mole/h. (Die -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)«-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde 40 Fumarase-Aktivität ist angegeben in Mikromolen L-Malein-in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt. säure, die bei der Reaktion mit 0,2 M Natriumfumarat bei 37 °C Eine Lösung (pH 4,3) von 6 mg Amylase (totale Aktivität: 3,600 und pH 7,0 gebildet wird.)
Einheiten), erhalten aus Bacillus subtilis in 20 ml Wasser wurde zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats Beispiel 37
gegeben und das Gemisch während 2 h bei 20 °C gerührt. Der 45 Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: Wasser gewaschen, wobei 0,98 g (Feuchtgewicht) eines immo- -CH2CH(OHCH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde in bilisierten Amylase-Präparats erhalten wurden (d.h. Amylase, gleicher Weise wie in Beispiel 1 -(2) beschrieben hergestellt, adsorbiert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Die Amy- 4 ml einer wässrigen Lösung von L-Asparaginsäure-ß-decarbo-lase-Aktivität betrug 480 Einheiten. Die Amylase-Aktivität 50 xylase (totale Aktivität: 5,640 |i Mole/h), erhalten aus Pseudo-wurde dadurch bestimmt, dass die Reaktion mit 1% Stärkelöse monas dacuhae wurden zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserun-bei 40 °C während 10 min durchgeführt wurde, worauf die löslichen Tanninpräparats gegeben und das Gemisch während genannte Stärke mit Jod gefärbt wurde. (Eine Einheit Amylase 30 min bei 25 °C geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wurde ist definiert als diejenige enzymatische Aktivität, die 1% der abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 0,95 g (Feuchtge-charakteristischen blauen Färbung der genannten Stärke pro 55 wicht) eines immobilisierten L-Asparaginsäure-ß-decarboxy-min ausbleicht.) lase-Präparats erhalten wurden (d.h. L-Asparaginsäure-ß-decar-
boxylase, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Beispiel 34 Die L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität betrug 180 p.
Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches Mole/h. (Die Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität ist Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: 60 angegeben in Mikromolen L-Alanin, das bei der Reaktion mit -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)e-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde o,2 M L-Asparaginsäure bei 37 °C und pH 5,5 gebildet wurde.) in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt.
100 mg ß-Galactosidase (totale Aktivität: 184 Einheiten), gelöst Beispiel 38
in 4 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung wurden zu Ein wasserunlösliches Tanninpräparat (d.h. chinesisches 1 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats 65 Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C gerührt. -CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)6-NHCH2CH(OH)CH2-) wurde Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und }n gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) beschrieben hergestellt, mit Wasser gewaschen, wobei 0,97 g (Feuchtgewicht) eines 2 ml einer wässrigen Lösung von Aspartase (totale Aktivität:
634101
16
20,000 |i Mole/h), erhalten aus Pseudomonas dacunhae, wurden zu 1 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 1,0 g (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Enzympräparats erhalten wurde (d.h. Enzym . adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die L-Ala-nin-Produktivität betrug 180 jj. Mole/h. (Die L-Alanin-Produkti-vität ist angegeben in Mikromolen von L-Alanin, das bei der Reaktion mit 0,2 M Asparaginsäure bei 37 °C und pH 5,5 gebildet wurde.)
Tabelle 1
10
Beispiel 39
( 1 ) 4 g Cellulosepulver wurden in 200 ml einer wässrigen 25% Natriumhydroxidlösung bei 25 °C während 30 min suspen- 15 diert und anschliessend mit Wasser gewaschen. 10 g der feuchten Cellulose wurden in 80 ml einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung suspendiert und die Suspension auf pH 11,5 eingestellt. Zu der Suspension wurden anschliessend Cyanogenbromid gegeben (in einem Anteil wie in Tabelle 1 angegeben) 20 und das Gemisch wurde unter 30 °C während 8 min gerührt. Während der genannten Reaktion wurde das pH durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxidlösung auf 11-11,5 gehalten. Der Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert, mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, die auf ca. 10 °C abgekühlt 25 wurde, und anschliessend mit kaltem Wasser gewaschen. Die auf diese Weise erhaltene Cyanogenbromid-aktivierte Cellulose wurde in 10 ml einer wässrigen Lösung (pH 10), enthaltend Hexamethylendiamin (Gehalt von Hexamethylendiamin: 2,3 g/ 100 ml) suspendiert und die erhaltene Suspension während 2 h bei 25 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Man erhielt 10,5 g (Feuchtgewicht) Aminohexyl-cellu-lose.
(2) Cyanogenbromid wurde zu einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 11,5) gegeben (Anteil von Cyanogenbromid und von chinesischem Gallotannin wie in Tabelle 1 angegeben). Das Gemisch wurde während 8 min bei 20 °C gerührt, wobei während der Reaktion das pH auf zwischen 11 und 11,5 gehalten wurde. Die auf diese Weise erhaltene Cyanogenbromid aktivierte Gallotanninlösung wurde zu der nach Abschnitt (1) erhaltenen Aminohexylcellulose gegeben und das Gemisch während 2 h bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und nacheinander mit einer wässrigen 0,1 M Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Man erhielt 11,2 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-).
(3) 200 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 4,000 u Mole/h) wurden in 6 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung, enthaltend 2 Vol.-% n-Butanol, gelöst. 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Abschnitt (2) wurden zu der Lösung gegeben und das Gemisch während 30 min bei 37 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 530 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats (d.h. Aminoacylase, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die Aminoacylase-Aktivi-tät des immobilisierten Präparats ist in unten stehender Tabelle 1 angegeben.
Experi
Anteil des in
Anteil des in Abschnitt (2)
Aminoacy ment
Abschnitt (1) genannten Gallotannins und lase Aktivität
Nr.
genannten
Cyanogenbromids der
Cyanogen chinesisches
Cyanogen immobilisier
bromid (g)
Gallotanniti bromid ten
(g)
(g)
Präparate*
(i)
0,4
1,5
0,02
8,480
(ü)
0,4
2,6
0,04
9,056
(Üi)
0,4
5,2
0,1
9,280
(iv)
0,4
21,0
0,4
10,080
(V)
0,2
10,5
0,2
10,400
(vi)
0,1
5,2
0,1
6,176
(vii)
0,05
2,6
0,05
3,136
(viii)
0,02
1,05
0,02
2,176
30
35
40
45
50
55
60
* (j, Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 40
96 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 1920 |i Mole/h) wurden in 12 ml einer wässrigen Natriumchloridlösung (deren Konzentration (Gew.-%) in folgender Tabelle 2 angegeben ist) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch Zugabe von NaOH auf pH 8,0 eingestellt. Zu der Lösung wurden anschliessend 250 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-) gegeben, das in gleicher Weise hergestellt worden war wie in Experiment (v) von Beispiel 39 beschrieben, worauf das erhaltene Gemisch während 30 h bei 25 °C gerührt wurde. Anschliessend wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 260 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats (d.h. Aminoacylase, adsorbiert an wasserunlöslichem Tanninpräparat). Die Aminoacylase-Aktivi-tät des immobilisierten Präparats ist in nachfolgender Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Konzentration von Natriumchlorid (Gew.-%)
Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats ([i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats)
0
1,100
0,05
4,300
0,1
10,550
0,2
11,050
0,3
10,900
0,4
10,100
0,5
8,800
Beispiel 41
96 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 1,920 |i Mole/h) wurden in 12 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung gelöst. Die Lösung wurde auf pH 8,0 eingestellt und mit Äthylenglykol, n-Butanol oder Harnstoff versetzt (der jeweils verwendete Anteil ist in nachfolgender Tabelle 3 angegeben). 200 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CHz)6-NHCO-), das in gleicher Weise wie in Beispiel 6-(2) beschrieben hergestellt wurde, wurde zu der Lösung gegeben und das Gemisch während 30 min bei 4 °C geschüttelt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 210 mg (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Amino-
17
634101
acylase-Präparats (d.h. Aminoacylase, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats ist in nachfolgender Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
zugegebene Verbindungen Aminoacylase-Aktivität des und deren Konzentration immobilisierten Präparats (|i Mole/h per
(Gew.-%) 200 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats)
gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 210 mg (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Aminoacylase (d.h. Aminoacylase adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats ist in nachfolgender Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5
Äthylen
50%
120
glykol
30%
140
17%
128
8%
140
n-Butanol
8%
172
4%
186
2%
172
1%
172
Harnstoff
2M
140
1,3 M
148
0,6 M
168
0,3 M
140
keine
128
Zugabe
Temperatur
Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats ([j. Mole/h per 200 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen T anninpräparats)
4°C
184
25 °C
280
37 °C
280
45 °C
291
25
Beispiel 42
32 mg Aminoacylase (totale Aktivität 640 jj, Mole/h) wurden in 4 ml Wasser gelöst und die Lösung auf das in nachfolgender Tabelle 4 genannte pH eingestellt. 200 mg (Feuchtgewicht) 3o eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-), das in gleicher Weise hergestellt wurde wie in Beispiel 6-(2) beschrieben, wurde zu der Lösung gegeben und das Gemisch während 30 min bei 25 °C gerührt. 35 Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 200 mg (Feuchtgewicht)
eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats (d.h. Aminoacylase, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat). Die Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats ist in 40 nachfolgender Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Beispiel 44
(1) 2 g Aminoacylase (totale Aktivität: 40,000 Mole/h) wurden in 250 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung, enthaltend 2 Vol.-% n-Butanol gelöst. Die Lösung wurde auf pH 8,0 eingestellt, worauf 5 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO-) gegeben wurden, das in gleicher Weise hergestellt wurde wie in Beispiel 6-(2) beschrieben, worauf das erhaltene Gemisch während 1 h bei 25 °C gerührt wurde. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 5,2 g (Feuchtgewicht) eines immobilisierten Aminoacylase-Präparats (d.h. Aminoacylase, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat).
(2) Eine Säule mit einem Durchmesser von 0,5 cm und einer Höhe von 10 cm wurde mit 2 g (Feuchtgewicht) des immobilisierten Aminoacylase-Präparats aus Abschnitt (1) beschickt. Anschliessend wurde eine wässrige 0,6 M N-Acetyl-DL-methio-ninlösung (pH 7,0,5 x 10~4M Co++) oder eine wässrige 0,2 M N-Acetyl-DL-tryptophan-lösung (pH 7,0,5 x 10~4M Co++) mit einer Durchflussrate von 1,7 ml/h bzw. 2,0 ml/h durch die Säule geschickt. Der Anteil von L-Methionin oder L-Tryptophan im Eluat wurde in Intervallen gemessen und die Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats daraus berechnet.
pH Aminoacylase-Aktivität des immobilisierten Präparats
(|i Mole/h per 200 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats)
45
Tabelle 6
10
11
17 34 45 58 62 64 58 28
50
Beispiel 43
96 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 1,920 ja Mole/h) wurden in 12 ml einer wässrigen 0,2 M Natriumchloridlösung gelöst. 0,2 ml n-Butanol wurden zu der Lösung gegeben und die Lösung anschliessend auf pH 8,0 eingestellt. 200 mg (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, kovalent gebunden an Cellulose über die Bindung: -CONH-(CH2)6-NHCO das in gleicher Weise wie in Beispiel 6-(2) beschrieben hergestellt wurde, wurde zu der Lösung gegeben und das erhaltene Gemisch während 30 min bei der in unten stehender Tabelle 5 genannten Temperatur
60
Zeit (Tage)
0,6 M
N-Acetyl-DL-methionin
Aminoacylase-Aktivität (|i Mole/h)
0,2 M
N-Acetyl-DL-tryptophan
Aminoacylase-Aktivität ((i Mole/h)
0
1,512(100)
972(100)
2
1,836(121)
1,138(117)
6
1,174(78)
731 (75)
10
1,315(87)
731 (75)
17
962 (64)
498(51)
18
1,047 (69)
435(45)
22
1,106(73)
554(57)
26
1,106(73)
499(51)
30
976 (65)
523(54)
34
749(50)
515(53)
40
599(40)
515(53)
44
623(41)
488(50)
65
Bemerkung: Die numerischen Werte in Klammern stehen für einen Faktor der potenzierenden Wirkung der enzymatischen Aktivität, berechnet nach der folgenden Formel:
634101
18
f Aktivität des immobilisierten Aminoacylase-Prä- \ / parats, geschätzt nach einer Zeitdauer wie in \ I Tabelle 6 angegeben
Tabelle 8
\ Anfangsaktivität des immobilisierten Aminoacy-Vlase-Präparats x 100
J
Beispiel 45
Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats, erhalten gemäss Beispiel 17, beschickt. Die Säule wurde nacheinander mit 100 ml einer 0,1 M Carbonat-Pufferlösung, 50 ml Wasser und 50 ml einer Acetat-Pufferlösung (pH 4,3,1 m mho) gewaschen. Ein Enzym (in Tabelle 7 angegeben) wurde in einer Acetat-Pufferlösung gelöst (pH 4,3,1 m mho) und 200 ml dieser Enzymlösung (Proteingehalt 1 mg/ml) (im folgenden als «Probelösung» bezeichnet) wurde mit einer Durchflussrate von 20 ml/h durch die Säule geschickt. Die Säule wurde anschliessend mit einer 0,1 M Acetat-Pufferlösung (pH 4,3) und mit Wasser gewaschen. Anschliessend erfolgte die Elution mit einer Carbonat-Pufferlösung (pH 10,50 mho) und der Anteil von Protein im Eluat (d.h. Anteil von Protein adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat) wurde mit Hilfe der Kupfer-Folin-Methode gemessen. Zum Vergleich wurde ferner der Anteil von Protein, adsorbiert am Aminohexylcellulsoe (hergestellt durch Merck Co., unter dem Handelsnamen «AH-Cellulose») durch Behandeln der genannten Cellulose in gleicher Weise wie oben beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
Enzym
Anteil von Protein
Ausbeute*
Anteil von
adsorbiert am
(%)
Protein,
wasserunlöslichen
adsorbiert an
Tanninpräparat
«AH-Cellulose»
(mg/ml)
(mg/ml)
Lysozym
37,0
89
0,2
Trypsin
96,0
94
0,2
Asparaginase
47,4
95
0,1
a-Amylase
51,6
75
0,5
Säurephospha- 37,4
94
1,1
tase
* «Ausbeute (%)» wurde nach folgender Formel berechnet: / Totale Aktivität des Enzyms, enthalten im Eluat
45
(totale Aktivität der Probelösung) - (totale Aktivi-\ tät des Enzyms, nicht am wasserunlöslichen Tan-ninpräparat adsorbiert)
X100
50
Beispiel 46
Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 13-(2) 55 beschickt. Die Säule wurde mit 50 ml einer wässrigen 1 M Natriumchloridlösung und 30 ml einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0,1 m mho) gewaschen. Eine Testverbindung, wie in Tabelle 8 genannt, wurde in Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0,1 m mho) gelöst. 2 ml der genannten Testverbindungslösung 60
(Gehalt von Testverbindung: 1 (i Mole/ml) wurden durch die Säule gegeben und die Säule wurde anschliessend mit 15 ml einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0,1 m mho) gewaschen. Anschliessend wurde der Anteil der Testverbindung, enthaltend im Eluat und in der Waschlösung gemessen und den Anteil 65 der genannten Verbindung, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat wurde daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in unten stehender Tabelle 8 angegeben.
10
25
Testverbindung
Anteil der Testverbindung, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat (|i g/ml)
(Proteine)
a-Amylase
12,000
Albumin
7,000
y-Globulin
30,000
(L-Aminosäuren)
Arginin
1,0
Histidin
0
Alanin
2,1
Leucin
5,8
Isoleucin
0
Valin
9,6
Tryptophan
2,2
Asparagin
3,6
Asparaginsäure
6,9
(Organische Säuren)
Fumarsäure
0
L-Äpfelsäure
0
(Saccharide)
Glucose
0
Fructose
0
Ribose
0
(Nucleoside)
Adenosin
0
Guanidin
0
Cytidin
0
Uridin
0
Thymidin
0
35
Beispiel 47
Eine Säule mit 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt. Die Säule wurde ansschliessend mit 5 ml einer wässrigen 0,1 M Natriumchloridlösung und einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,1 m mho) gewaschen. Eine Testverbindung,
genannt in Tabelle 9, wurde in einer Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0,1 m mho) gelöst und 2 ml dieser Lösung (Gehalt an Testverbindung: 1 p. Mole/ml) wurden auf die Säule gegeben und diese anschliessend mit 15 ml einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0, 1 m mho) gewaschen. Anschliessend wurde der Anteil der Testverbindung, enthaltend im Eluat und in der Waschlösung gemessen und der Anteil der genannten Verbindung, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat wurde daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben.
Tabelle 9
Testverbindung
Anteil Testverbindung, adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat (|i g/ml)
(Proteine)
Asparaginase 41,000 Saure Phosphatase 39,000
Lysozym 11,000 (L-Aminosäuren)
Arginin 1,5
Histidin 1,9
Alanin 2,3
Valin 4,9
Asparaginsäure 3,7
Tryptophan 2,3
19
634101
Testverbindung
Anteil Testverbindung, adsorbiert am wasserunlöslichen T anninpräparat (H g/ml)
(Organische Säuren)
Fumarsäure
0
L-Äpfelsäure
0
(Saccharide)
Glucose
0
Fructose
0
(Nucleoside)
Adenosin
0
Guanosin
0
Cytidin
0
Uridin
0
Thymidin
0
Beispiel 48
Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tannin-präparats aus Beispiel 16-(2) beschickt. Die Säule wurde mit 50 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10,50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml Carbonatpufferlösung (pH 9,0,1 m mho) gewaschen. Eine Testlösung (Proteingehalt 100 jj, g/ml) wurde durch Auflösen von Lysozym in einer Carbonatpufferlösung (pH 9,0, l.m mho) hergestellt und 980 ml dieser Testlösung wurden auf die Säule gegeben. Im Endzustand wurde die Konzentration von Protein im Elut gleich wie diejenige von Protein in der Testlösung. Die Säule wurde anschliessend mit einer wässrigen 0,01 N Natriumhydroxidlösung, abgekühlt auf ca. 4 °C, eluiert. Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthielt 23,2 mg Protein. Ausbeute: 96%.
Beispiel 49
Lysozym wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 48 beschrieben verarbeitet, wobei jedoch 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 anstelle des wasserunlöslichen Präparats aus Beispiel 16 verwendet wurde. Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthielt 54 mg Protein. Ausbeute: 97%.
Beispiel 50
Eine Säule mit 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt. Die Säule wurde mit 100 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung, 50 ml Wasser und einer Acetatpufferlösung (pH 4,3, 1 m mho) gewaschen. Eine Testlösung (Proteingehalt: 100 \i g/ml) wurde hergestellt durch Auflösen von... in einer Acetatpufferlösung (pH 4,3,1 m mho) und 1,200 ml der genannten Testlösung wurden auf die Säule gegeben. Im Endzustand, betrug die Proteinkonzentration im Eluat gleich viel wie die Proteinkonzentration in der Testlösung. Die Säule wurde anschliessend mit einer wässrigen 0,01 N Natriumhydroxidlösung, gekühlt auf ca. 4 °C, eluiert. Das auf diese Weise erhaltene Eluat enthielt 48,7 mg Protein. Ausbeute: 75%.
Beispiel 51
Eine Säule mit 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 18-(1) beschickt. Die Säule wurde mit einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10,50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml Acetatpufferlösung (pH 5,5,1 m mho) nacheinander gewaschen. Eine Testlösung (Proteingehalt: 100 |x g/ml) wurde hergestellt durch Auflösen von Trypsin in einer Acetatpufferlösung (pH 5,5,1 m mho), und 540 ml der genannten Testlösung wurden mit einer Durchflussrate von 30 ml/h durch die Säule geschickt. Im Endzustand betrug die Konzentration von Protein im Eluat gleich viel wie die Proteinkonzentration in der Testlösung. Die Säule wurde anschliessend mit einer wässrigen 1 M Natriumchloridlösung eluiert und das erhaltene Eluat enthielt 8,9 mg Protein. Ausbeute: 98%.
5 Beispiel 52
Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt. Die Säule wurde mit 50 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10,50 m mho), 100 ml Wasser und 50 ml Carbo-lo natpufferlösung (pH 9,0,1 m mho) nacheinander gewaschen. Eine Testlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 10 mg Lysozym, 10 mg L-Arginin, 10 mg L-Histidin, 10 mg L-Alanin, 10 ml L-Leucin, 10 mg L-Valin, 10 mg L-Tryptophan und 10 mg L-Asparaginsäure in 200 ml Carbonatpufferlösung (pH 9,01 m 15 mho) hergestellt, und die genannte Lösung wurde auf die Säule gegeben. Das auf diese Weise erhaltene Eluat zeigte beim Erhitzen auf 60 °C während 10 min und anschliessendem Stehenlassen bei Raumtemperatur während einer Woche keine Trübung. Andererseits zeigte die genannte Testlösung ohne 20 Behandlung in der Säule nach Erhitzen auf 60 °C während 10 min eine Trübung und nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während einer Woche bildete sich ein weisser Niederschlag. Die Ergebnisse einer Aminosäureanalyse zeigten, dass im Eluat dieselben Anteile Aminosäure vorlagen wie in der genannten 25 Testlösung.
Aus diesen Tatsachen ist klar, dass Lysozym am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsorbiert wurde, die Aminosäuren jedoch nicht.
3o Beispiel 53
Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt. Die Säule wurde nacheinander mit 50 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10,50 m mho), 100 ml Wasser und 35 50 ml einer Carbonatpufferlösung (pH 9,0,1 m mho) gewaschen. Eine Testlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 20 mg Lysozym, 20 mg Fumarsäure und 20 mg L-Äpfelsäure in 200 ml einer Carbonatpufferlösung (pH 9,0,1 m mho) und die genannte Lösung wurde auf die Säule gegeben. Das erhaltene 40 Eluat enthielt keine Anteilen von Protein. Ferner waren die genannten organischen Säuren in gleicher Menge wie in der oben genannten Testlösung im Eluat enthalten.
Beispiel 54
45 Eine Säule von 0,3 cm Durchmesser und 5 cm Höhe wurde mit 1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt. Die Säule wurde nacheinander mit 100 ml einer 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10), 50 ml Wasser und 50 ml einer Acetatpufferlösung (pH 5,5,1 m mho) gewaschen. Eine so Testlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 10 mg a-Amylase, 0,1 mg L-Arginin, 0,1 mg L-Histidin, 0,1 mg L-Alanin, 0,1 mg L-Leucin, 0,1 mg L-Valin, 0,1 mg L-Tryptophan, 0,1 mg L-Asparagin und 0,1 mg L-Asparaginsäure in 200 ml einer Acetatpufferlösung (pH 5,5,1 m mho) hergestellt, und die genannte 55 Testlösung wurde auf die Säule gegeben. Das erhaltene Eluat zeigte beim Erhitzen während 10 min auf 60 °C keine Trübung. Andererseits bildete sich in der unbehandelten Probelösung beim Erhitzen auf 60 °C während 10 min eine Trübung. Ferner zeigten die Ergebnisse der Aminosäureanalyse, dass im Eluat 60 dieselben Anteile Aminosäuren vorhanden waren wie in der genannten Testlösung.
Beispiel 55
1 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 65 wurde zu 500 ml einer Tris-Pufferlösung (pH 7,0,1 m mho), enthaltend 100 n g/ml kristalline Asparaginase (isoliert aus Proteus vulgaris) gegeben und das erhaltene Gemisch während 4 h unter Abkühlen gerührt und anschliessend filtriert. Das Filtrat
634101
20
enthielt 4,5 a g/ml Protein. Anschliessend wurde das wasserunlösliche Tanninpräparat mit einer 1 M Natriumchloridlösung eluiert, wobei dieses Eluat anschliessend 45,5 mg Protein enthielt.
5
Beispiel 56
Eine wässrige Asparaginaselösung (im folgenden als «Testlösung« bezeichnet) wurde aus Proteus vulgaris hergestellt, entsprechend der Methode beschrieben in Biochemistry, II,
217-222 (1972). Die Testlösung (pH 8,0,4 m mho, Proteingehalt: to 23,2 mg/ml Asparaginase-Aktivität: 13,9 Einheiten/ml) wurde durch Zugabe von wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt und anschliessend mit dem 5fachen Volumen Wasser verdünnt. Eine Säule von 1 cm Durchmesser und 10 cm Höhe wurde mit 5 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats 15 aus Beispiel 16-(1) beschickt und 300 ml der verdünnten Lösung wurden durch die Säule gegeben. Dabei wurden 152 Einheiten Asparaginase am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsorbiert. Nach Waschen der Säule mit 50 ml einer Tris-Pufferlö-sung (pH 7,0,1 m mho) wurde die genannte Säule mit 50 ml 20 einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0,5 m mho) enthaltend 0,05 M L-Asparaginase, eluiert. 24 ml des auf diese Weise erhaltenen Eluats, enthielten 42 mg Protein und die Asparaginase-Aktivität im Eluat betrug 149 Einheiten. Dies zeigte, dass 98% der Asparaginase am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsor- 25 biert waren und durch die Phosphatpufferlösung eluiert werden konnten, und dass die Asparaginase-Aktivität des Proteins im Eluat ca. 6mal höher war, als die Aktivität des Proteins in der genannten Testlösung. (Eine Einheit ist definiert als diejenige enzymatische Aktivität, die bei der Reaktion mit 0,03 M 30
L-Asparagin bei 37 °C und pH 8,0 während 1 min 1 (x Mol/ Ammoniak liefert.)
Beispiel 57
Eine Hesperiginase-Lösung (im folgenden als «Testlösung» bezeichnet) wurde hergestellt durch Filtrieren einer Fermentationslösung von Aspergillus niger. Die Testlösung (pH 4,8,14 m mho, Proteingehalt: 19,2 mg/ml, Hesperiginase-Aktivität: 8,6 Einheiten/ml) wurde durch Zugabe von wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt und anschliessend mit dem 5fachen Volumen Wasser verdünnt. Eine Säule von 1 cm Durchmesser und 10 cm Höhe wurde mit 5 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 17 beschickt und 400 ml der verdünnten Lösung (totale Aktivität: 1,242 Einheiten) wurde auf die Säule gegeben. 270 Einheiten Hesperiginase wurden dabei am wasserunlöslichen Tanninpräparat adsorbiert. Nach Waschen der Säule mit 50 ml einer Tris-Pufferlösung (pH 7,0,1 m mho) wurde diese mit 50 ml einer Carbonatpufferlösung (pH 10,50 m mho) eluiert. 25 ml des auf diese Weise erhaltenen Eluats enthielten 42 mg Protein und die Hesperiginase-Aktivität betrug 149 Einheiten. Dies zeigte an, dass 98% der Hesperiginase adsorbiert am wasserunlöslichen Tanninpräparat mit der Carbonatpufferlösung eluiert wurden und die Hesperiginase-Aktivität des Proteins im Eluat waren ca. 2mal höher als diejenige des Proteins in der genannten Test*-lösung.
Eluat aufgefangen. Das auf diese Weise erhaltene Eluat zeigte beim Erhitzen auf 60 °C während 10 min und anschliessendem Stehenlassen bei Raumtemperatur während 50 Tagen keine Trübung. Andererseits wurde eine Testlösung ohne Behandeln auf der Säule beim Erhitzen unter den oben genannten Bedingungen trübe. Ferner enthielt das Eluat die gleichen Anteile von Aminosäuren, Sacchariden und organischen Säuren wie im Fall des oben genannten «Japanese Sake».
Nach Beendigung des oben genannten Vorgehens wurde die Säule mit 0,01 N Salzsäure eluiert. Dabei konnten 104 mg Amylase gewonnen werden.
Beispiel 59
(1) 10,5 g (Feuchtgewicht) Aminohexylcellulose wurden aus 4 g Cellulosepulver in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben hergestellt. 100 ml einer wässrigen 5% chinesischen Gallotanninlösung (pH 5,7 oder 9) wurden zu 4 g (Trok-kengewicht) der Aminohexylcellulose gegeben und das Gemisch während 2 h bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 12,5 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an Aminohexylcellulose).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase (totale Aktivität: 4000 ji Mole/h) oder 25 mg Glucoseisomerase (totale Aktivität: 690 Einheiten) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) oder Beispiel 28 beschrieben verarbeitet Eine immobilisierte Aminoacylase oder Glucoseisomerase wurde auf diese Weise erhalten. Die enzymatische Aktivität der genannten immobilisierten Präparate ist in nachfolgender Tabelle 10 genannt.
Tabelle 10
pH der
Enzymatische Aktivität des immobilisierten
Gallotanninlösung
Präparats
Aminoacylase-
Glucoseisomerase-
Aktivität*
Aktivität**
5
7,650
9
7
9,054
45
9
9,468
237
Beispiel 58
Eine Säule von 1 cm Durchmesser und 10 cm Höhe wurde mit 5 ml des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Beispiel 16-(1) beschickt. Die Säule wurde mit 1 Liter 0,1 M Carbonatpufferlösung (pH 10) und 1 Liter Wasser nacheinander gewaschen. Amylase (hergestellt durch Tanabe Seiyaku Co., Ltd., unter dem Handelsnamen «Morotomine») wurde gelöst in «Japanese Sake» (ein fermentierter Likör, hergestellt aus Reis) die Lösung (pH 4,3,0,6 m mho, Proteingehalt: 100 n g/ml) (im folgenden als «Testlösung» bezeichnet) wurde auf die Säule unter Abkühlen gegeben und anschliessend wurden 500 ml
45 * [J. Mole pro h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats
** mg pro h per 100 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats
50 Beispiel 60
(1) 11,0 g (Feuchtgewicht) von n-Octylcelluloe (d.h. Cellu-lose-0-CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)7-CH3) wurde hergestellt durch Behandeln von 4 g Cellulosepulver (Handelsname «Cellulose Powder C») in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1)
53 beschrieben, jedoch unter Verwendung von 1,2 ml n-Octylamin anstelle von Hexamethylendiamin. 4 g (Trockengewicht) der n-Octylcellulose wurden zu 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) gegeben und das erhaltene Gemisch während 2 h bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde 60 abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 12,7 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats erhielt (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an n-Octylcel-lulose).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin-65 präparats aus Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt ein immobilisiertes Aminoacylase-Präparat. Die Aminoacylase-Aktivität betrug 14,400 u Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
21
634 101
Beispiel 61
(1) 10,9 g (Feuchtgewicht) n-Dodecyl-Cellulose (d.h. Cellu-lose-0-CH2CH(OH)CH2NH-(CH2)n-CH3) wurde hergestellt durch Behandeln von 4 g Cellulosepulver (Handelsname «Cellulose Powder C») in gleicher Weise wie in Beispiel 1 -(1 ) s beschrieben, jedoch unter Verwendung von 1,5 g n-Dodecyl-amin anstelle von Hexamethylendiamin. 4 g (Trockengewicht) der n-Dodecylcellulose wurden zu 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) gegeben und das Gemisch während
2 h bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde io anschliessend abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 12,4 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an n-Dode-cylcellulose).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin- is präparats aus Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt eine immobilisierte Aminoacylase mit der Aktivität von 7,389 (i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats. 20
25
30
Beispiel 62
(1) 4 g Cellulosepulver (hergestellt durch Toyo Roshi Co., unter dem Handelsnamen «Cellulose Powder D») wurden in 15 ml einer wässrigen 25% Natriumhydroxidlösung bei 10 °C während 30 min aufgeschlämmt. Anschliessend wurden 0,5 ml n-Butylglycidyläther (d.h. n-Butyläther von 2,3-Epoxypropanol) und 35 ml Wasser zu der feuchten Cellulose gegeben und das Gemisch während 2 h bei 60 °C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhielt 11,1g n-Butylcellulose (d.h. Cellul0se-0-CH2CH(0H)CH20-(CH2)3-CH3). 500 mg (Feuchtgewicht) der Butylcellulose wurden zu 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) gegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 35 12,3 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats erhielt (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an der Butylcellulose).
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden 40 in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt eine immobilisierte Aminoacylase mit der Aktivität von 11,160 [i Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
von 12,420 n Mole/h per 10 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats.
Beispiel 64
(1) 14 g (Feuchtgewicht) Aminohexylcellulose wurden aus 4 g Cellulosepulver (Handelsname «Cellulose Powder D») in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben hergestellt. 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) wurden zu 4 g (Trockengewicht) der Aminohexylcellulose gegeben und das Gemisch während 2 h bei 25 °C gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 16,4 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats erhielt (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an Aminohexylcellulose).
(2) 5 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (1) und 2 g Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt 5,5 g (Feuchtgewicht) einer immobilisierten Aminoacylase.
(3) Eine Säule von 1 cm Durchmesser und 10 cm Höhe wurde mit 2 g (Feuchtgewicht) der immobilisierten Aminoacylase aus Abschnitt (2) beschickt. Eine wässrige 0,6 M N-Acetyl-DL-methioninlösung (pH 7,0,5x 10~4 M Co++) oder eine wässrige 0,2 M N-Acetyl-DL-tryptophalösung (pH 7,0,5 x IO-4 M Co++) wurde mit einer Durchflussrate von 6 ml/h durch die Säule gegeben. Der Anteil von L-Methionin oder L-Tryptophan im Eluat wurde in Intervallen gemessen und die Aminoacylase-Aktivität der immobilisierten Aminoacylase wurde daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben.
Tabelle 11
Zeit (Tage) Potenzierungsfaktor der enzymatischen
Aktivität
0,6 M 0,2 M
N-Acetyl-DL-methionin N-Acetyl-DL-trypto-phan
0
100
100
1
145
89
3
126
76
7
109
60
10
82
58
15
79
50
45
Beispiel 63
(1) 4 g Cellulosepulver (Handelsname «Cellulose Powder D») wurden in 15 ml einer wässrigen 25% Natriumhydroxidlö-sung während 30 min bei 10 °C aufgeschlämmt. 0,5 ml Phenylglycidyläther (d.h. Phenyläther von 2,3-Epoxypropanol) und : 35 ml einer wässrigen 50% Äthanollösung wurden zu der feuchten Cellulose gegeben und das Gemisch bei 60 °C während 2 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die so erhaltene Phenoxypropylcellulose d.h.
Cellulose-0-CH2CH(OH)CH20 -0-)
zu 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) gegeben. Der gebildete Niederschlag wurde anschliessend abfil- < triert und mit Wasser gewaschen, wobei man 12,1 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an Phenoxypropylcellulose), erhielt.
(2) 500 mg (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tannin- i präparats aus Abschnitt (1) und 200 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet. Man erhielt eine immobilisierte Aminoacylase mit der Aktivität
* Potenzierungsfaktor der enzymatischen Aktivität berechnet aus der Formel in der Fussnote der Tabelle 6.
Beispiel 65
(1) 14,5 g (Feuchtgewicht) n-Octyl-cellulose (d.h. Cellulose-0-CH2CH(0H)CH2NH-(CH2)7-CH3) wurden hergestellt durch Behandeln von 4 g Cellulosepulver (Handelsname «Cellulose Powder D») in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, jedoch unter Verwendung von 1,2 ml n-Octylamin anstelle von
55 Hexamethylendiamin. 100 ml einer wässrigen 5% Gallotanninlösung (pH 7,0) wurden zu 4 g (Trockengewicht) der n-Octyl-cellulose gegeben und das Gemisch während 2 h bei 25 °C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 16,7 g (Feuchtgewicht) eines wasserunlöslichen Tanninpräparats (d.h. chinesisches Gallotannin, adsorbiert an n-Octylcellulose) erhielt.
(2) 5 g (Feuchtgewicht) des wasserunlöslichen Tanninpräparats aus Abschnitt (1) und 20 mg Aminoacylase wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(3) beschrieben verarbeitet Man erhielt 5,6 g einer immobilisierten Aminoacylase.
(3) Eine Säule von 1 cm Durchmesser und 10 cm Höhe wurde mit 2 g (Feuchtgewicht) der immobilisierten Aminoacylase aus Abschnitt (2) beschickt. Eine wässrige 0,6 M N-Acetyl-
634101
22
DL-methioninlösung (pH 7,0,5 x 10-4 M Co++) oder eine wäss- phan im Eluat wurde in Intervallen gemessen und die Amino-rige 0,2 M N-Acetyl-DL-tryptophanlösung (pH 7,0,5 x IO-4 M acylase-Aktivität der immobilisierten Aminoacylase wurde Co++) wurde durch die Säule mit einer Durchflussrate von daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angegeben.
6 ml/h gegeben. Der Anteil von L-Methionin oder L-Trypto-
Tabelle 12
Zeit (Tage) Potenzierungsfaktor der enzymatischen
Aktivität*
0,6 M 0,2 M
N-Acetyl-DL-methionin N-Acetyl-DL-trypto-phan
9
100
100
1
137
112
3
121
104
7
94
87
10
79
69
15
79
70
* Potenzierungsfaktor der enzymatischen Aktivität, berechnet gemäss der Formel in Fussnote zu Tabelle 6.
7 Blatt Zeichnungen
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