JPH02227077A - 固定化酸素及び利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、医薬品を工業的に生産するのに有用な固定化
酵素及びそれを用いたポリヌクレオチドの製造法に関す
る。 さらに詳しくは、ポリヌクレオチドフォスフォリラーゼ
（以下ＰＮＰａｓｅと略す）を多孔質キトサンビーズに
固定化した固定化酵素及びこれを用いたポリヌクレオチ
ドの製造法に関する。 即ち、 （１）多孔質キトサンビーズにポリヌクレオチドフォス
フォリラーゼを固定化した固定化酵素、（２）上記（−
１）記載の固定化酵素を用いることを特徴とするポリヌ
クレオチドの製造法、（３）多孔質キトサンビーズに架
橋剤で架橋処理しパた後にポリヌクレオチドフォスフォ
リラーゼを固定化した固定化酵素、 （４）上記（３）記載の固定化酵素を用いることを特徴
とするポリヌクレオチドの製造法、に関する。

【従来の技術】

ＰＮＰａｇｅが、ヌクレオシド−５゛−ニリン酸から、
Ｍｇ２◆又はＭ　ｎ　２　＋の存在下、無機リン酸を遊
離させてポリヌクレオチドを合成することは、よく知ら
れている。この反応において、ヌクレオシド−５“−二
リン酸として、例えば、シチジン−５°−ニリン酸（以
下ＣＵＰ）を基質として用いるとポリヌクレオチドＣ（
以下ポリＣ）が合成され、イノシン−５゛−二リン酸（
以下ＩＤＰ）を基質とするとポリヌクレオチド■　（ポ
リＩ）が合成される。これらのポリＣおよびポリＩは、
インターフェロンインデューサーとして知られているポ
リ■・Ｃの原料として極めて有用である。 ポリヌクレオチドの製造においては、ヌクレオシドの溶
液にＰＮＰａｇｅを添加して合成反応を行い、反応終了
後は、ＰＮＰａｓｅをフェノール、クロロホルム、ブタ
ノール、界面活性剤等で変性失活させた後、ポリヌクレ
オチドの精製を行う、いわゆるバッチ反応が行なわれて
いる。 一方、ＰＮＰａｓｅを■ＤＢＡＲセルロース（Ｊ、Ｆｅ
ｒｍｅｎｔ。 Ｔｅｃｈｎｏｌ、　、　６４．５１７−５２２．１９８
６）　、■アガロースゲル（Ｆｅｂｓ　　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ　　３０．　２４６−２４８＞、　■ＣＰＧ（Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ−Ｐａｒｅ　Ｇｌａｓｓ）　（■に同じ
）に固定化した固定化酵素は、知られている。

【発明が解決しようとする課題】

上記の固定化酵素では、粘性が上がり、圧損を受けるた
めに、連続反応を行うことができず、工業化には不適で
あった。また、■、■においては、長鎖のポリヌクレオ
チドしか合成できず、■では、燵鎮のものしかできない
ので、鎖長をコントロールできないという欠点を有して
いた。 また、従来の製造法では、収率が低く、生産量を高めよ
うとすると、反応タンクの規模が大きくなり、また、Ｐ
ＮＰａｓｅを変性失活させてからポリヌクレオチドの精
製を行うために、ＰＮＰａｓｅは、使い捨てになり、酵
素の使用コストが高くなり、さらには、合成されたポリ
ＩやポリＣへのＰＮＰａｓｅ酵素タンパクの混入を完全
に除去することは、不可能であるという欠点があった。

【課題を解決するための手段】

本発明の要旨は、特定の担体、即ち多孔質キトサンビー
ズにＰＮＰａｓｅを固定化することにある。さらには、
この固定化酵素を使ってポリヌクレオチドを製造するこ
とにある。 本発明者らは、上記の目的を達成するために、ＰＮＰａ
ｓｅを固定化する技術について鋭意研究した。 その結果、多孔質キトサンビーズにＰＮＰａｓｅを固定
化することにより、ＰＮＰａｓｅがきわめて効果的に吸
着固定化され、高活性が保持・発現されることを見いだ
した。さらにこの固定化酵素を用いることにより、ポリ
ヌクレオチドが収率よく、安価に製造されることを見い
だした。またカラム型リアクターや水圧圧着型バイオリ
アクター等においても充分にポリヌクレオチドの連続生
産が、可能であることも見いだし、本発明を完成するに
至った。 以下、本発明について詳細に説明する。 本発明において用いるＰＮＰａｓｅは、動植物の組織ま
たは微生物の菌体（胞子も含む）などに由来するものを
用いることができる。精製物の他、粗製物であってもよ
い。細菌由来のものとしては、例えば、ミクロコツカス
・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）　
、エシェリキア・コリ（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）　、アゾトバクタ−・ビネランディ　（＾ｚｏｔｏ
−ｂａｃｔａｒ　　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）　、バシラ
ス参ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が好ましい。Ｐ
ＮＰａｓｅは、公知の方法によってその酵素源から得る
ことができる。 本発明に用いる固定化担体の多孔質キトサンビーズは、
甲殻類由来のキチンを脱アセチル化してキトサンとし、
粒状化、多孔質化して表面積を大きくして吸着能を高め
たものである。多孔質キトサンビーズの粒径としては、
圧力損失や粒子表面積等を考慮して、０．５〜３．０ｍ
ｍが好ましく、さらに好ましいのは、０．５〜１．５ｖ
ｎである。 例えば、キトバール８ＣＷ−３０１０，ＢＣＷ−３５１
０，ＢＣＩ！ｌ−３５０５等を挙げることができる。 本発明に用いるヌクレオシド−５−二リン酸としては、
シチジン−５°−ニリン酸（ＣＤＰ）、イノシン−５゜
ニリン酸（ＩＤＰ）　、アデノシン−５−ニリン酸（八
〇Ｐ）、グアノシン−５°−ニリン酸（ＧＤＰ）、ウリ
ジン−５−二リン酸（Ｕ叶）、チミジン−５°−ニリン
酸（ＴＯＰ）等を挙げることができる。 また、置換基を有しているヌクレオシド−５°−二リン
酸も用いることができる。 架橋剤としては、キトサンビーズと接触したときに、キ
トサンピーズのアミノ基と結合する能力のあるものなら
制限なく用いることができる。例えば、ゲルタールアル
デヒド、カルボジイミド等を用いることができる。 多孔質キトサンビーズの担体にＰＮＰａｓｅを固定化す
る方法としては、特に制限はなく、例えば、水または適
当な緩衝液中で担体と酵素を接触させる方法を用いるこ
とができる。 緩衝液としては、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス
緩衝液、グリシン・Ｎａ０）１等を用いることができ、
とりわけ、その濃度が０．０５〜０．１モル濃度で、ｐ
Ｈが約６〜１０程度である！１衝液が好ましい。 酵素に対する担体の量は、通常０．０１〜５０％（Ｗ／
１１）、好ましくは、０．５〜３０％（Ｗ／Ｗ）　テあ
る。 −例を示すと、キトバールＢＣＷ−３５１０２ｍ１（ｖ
／ｖ）を１０〜１００ｍＭの緩衝液（ｐＨ６〜１０）で
十分に平衡化した後、担体１ｍｊ！（ｖ／ｖ）に対して
、５〜３０ｍｇのＰＮＰａｓｅ溶液を加え、０．５〜２
４時間、４〜３０℃、好ましくは、室温で往復振とう処
理（６０〜８０ストロ一ク／分、ストローク幅２．５ｃ
ｍ）　　Ｌ、ＰＮＰａｓｅを担体に吸着固定化させる。 未吸着のＰＮＰａｓｅは、ガラスフィルター上にて、濾
過洗浄により除去する。 このような方法でも十分な固定化酵素を得ることができ
るが、架橋剤で前処理した担体を用いるとさらに有利に
固定化酵素を得ることができる。 前処理の方法としては、水または上記の如き緩衝液中、
担体に架橋剤を接触させる方法を用いることができる。 架橋剤の濃度は、担体に対して、通常、０．０１〜５％
の範囲が好ましい。例えば、キトバールＢＣＷ−３０１
０２ｍ１（Ｖ／Ｖ）を２．５％（Ｖ／Ｖ）ゲルタールア
ルデヒド（以下ＧＬＡと略す）溶液４艷に浸漬し、静置
又は振とう（３０〜８０ストロ一ク／分、２、５ｃｍ幅
ストローク）を室温で０．５〜３時間行い、ＧＬＡ処理
後、グラスフィルター（Ｇ−２）上にて、過剰のＧＬＡ
を除去・洗浄する。 ＧＬ＾処理したキトバール　ＢＣＷ−３０１０を上記と
同様に緩衝液中で５〜ｂ 酵素を固定化する。固定化の場合も、ＧＬＡ処理と同様
の条件で静置又は振とうを行い、酵素の固定化を行う。 未固定の酵素は、タンパク質の溶出がなくなるまで、グ
ラスフィルター上にて洗浄を行うか、又は、振とうによ
り洗浄をすることができる。上記のような方法で固定化
した場合の見かけ上の固定化率を次式で算出した。 その結果、見かけ上の固定化率は、後述するように４０
％以上であった。 また、酵素の固定化法としては、上記に述べた他に、多
孔質キトサンビーズ担体をカラムに充填した後１．２．
５％（ｖ／ｖ）　ＧＬ＾溶液を２〜３時間通液させ、滅
菌蒸留水で充分洗浄した後、タンパク溶液を通液させる
ことにより固定化する方法を採用することができる。 本発明による固定化酵素を用いた場合のポリヌクレオチ
ドの製造方法は、特に限定されないが、例えば、固定化
酵素をカラムに充填し、ｐＨ８〜９、温度３０〜５０℃
で、基質として１０％（Ｗ／Ｖ）ヌクレオシドをカラム
に連続通液することにより、ポリヌクレオチドを効率的
に製造することができる。 カラム法で行う場合は、担体をカラムに充填し、このカ
ラムに架橋剤を含む水または緩衝液を流下し、次いでＰ
ＮＰａｓｅ溶液を流下し、その後、基質を通液すること
もできる。 本発明で生成された固定化酵素は、反応タンク中の支持
体に保持させて反応させるバッチ式においても利用でき
ることは、いうまでもない。 このようにして得られたポリヌクレオチドは、自体公知
の方法（例えば、限外濾過、透析等）により単離精製す
ることができる。 このようにして得られた本発明の固定化酵素は、本来の
酵素（ネイティブ）と比較すると、その性状は、殆ど変
わらないが、反応の至適１１）１は、酸性側に傾く傾向
が認められた。

【実施例】

以下に実施例及び試験例を掲げて本発明を更に詳しく説
明する。 これらの実施例中のポリヌクレオチドの濃度の測定は、
次の条件でＨＰＬＣにより行った。 カラム；アサヒバツクＧ５−５１０（６Ｘ　５００ｍｍ
）移動層；　０．　ＬＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ
　７，５．０．３ＭＮａＣ１１ｍＭ　ＲＯＴ＾） 検出；ｕｖ法（２７０ｎｍ／ポリＣ，２５１ｎｍ／ポリ
Ｉ）分子サイズ測定に用いたＨＰＬＣの条件は、カラム
：アサヒバツクＧ５−７１０（６ｘ　５００ｍｍ）移動
層；　０．　ＬＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５゜
０．３Ｍ　　　ＨａＣｌ　　　１ｍＭ　　ＢＤＴＡ　　
）検出；ｕｖ法（２７０ｎａ＋／ポリＣ，２５１ｎｍ／
ポリ■）実施例１ （１）　ＰＮＰａｇｅの固定化 整粒し、オートクレーブ滅菌したキトパール８ＣＷ−３
０１０を２ｍＭ　（Ｖ／Ｖ）分取シ、コレラカラスフィ
ルター（Ｇ−２）にて集め、十分に水を除去した後、４
ｍＭのＰＮＰａｓｅ溶液（Ｑ、　ＬＭ　）リス塩酸、ｐ
Ｈ１１，１、タンパク濃度３０ｍｇ／ｍｌ　；　ＰＮＰ
ａｓｅ　　７アアルマシア社製）に入れ、低温下（４〜
６℃）で−夜（１６時間）振とう（７０ストロ一ク／分
）し、固定化をおこなった。未結合のタンパクは、振と
う洗浄を繰り返し、検出できなくなるまで行った。 （２）ポリＣの合成 この固定化した担体２ｍｌをｌＯ％ＣＤ？溶液（０，１
１４）リス−塩酸、ｐＨ９，０，４（ｂｎＭ　ＭｇＣｌ
２．０．４ｍＭ　［！ＤＴ＾）１０−に入れ、４８時間
反応を３７℃で行った。反応終了後、ポリＣ量を測定し
、この固定化酵素を蒸留水で洗浄した。反応を繰り返し
、安定性を測定した。 その結果を表に示す。 凱）４８時間でのポリＣ合成量（４４０ｍｇ）を１００
とした。 実施例２ （１）担体のＧＬ＾処理 固定化用担体として、キトパールＢＣＷ−３０１０を用
い、オートクレーブ滅菌した後、２＋ｎｌ　（Ｖ／Ｖ）
の担体を分取し、６ｍ１（７）２．５％（Ｖ／Ｖ）　Ｇ
ＬＡ溶液に入れ、室温下で２．５時間振とう（７０スト
ロ一ク／分、ストローク幅２．５ｃｍ）処理した。処理
後、グラスフィルター上にてＧＬＡ処理した担体を集め
、振とう洗浄を５回行った。 （２）　ＰＮＰａｓｅの固定化 上記と同様にしてＧＬ＾処理した担体を、４ｍＭのＰＮ
Ｐ−ａｓｓ溶液（０，ＩＭ　）リス−塩酸緩衝液、ｐＨ
８，ｉ。 酵素濃度１５ｍｇ／ｍｌ　：　ＰＮＰａｓｅ　　ファル
マシア社製）に入れ、室温下で１５５時間振う（５０ス
トロ一ク／分、ストローク幅２．５ｃｍ）　して固定化
を行った。 酵素処理後、未結合の酵素は、固定化の振とつと同じ条
件にて、タンパクが洗浄液中に検出されなくなるまで、
振とう洗浄を行った。このようにして得られた固定化酵
素は、担体ｌ−当り、１７ｍｇのＰＮＰａｇｅを見かけ
上、固定化していた。 （３）ポリＣの合成 上記のようにして得た固定化酵素２ｍｌ　（Ｖ／Ｖ）を
１ＯＩＩ１１の１０％ＣＯＰ溶液（０，ＩＭ　）リスー
塩酸！ｌ衝液、４０ｍＭＭｇＣ１ｚ、０．４ｍＭ　　！
！ＤＴ＾、ｐＨ９，０）に入れ、３７℃で振とう（７０
ストロ一ク／分、ストローク幅２．５ｃｍ）によりポリ
Ｃを合成した。経時的にポリＣ濃度を測定した結果を表
に示した。 表から明かなように、１０００ｍｇのＣＯＰより、４４
０ｎｇのポリＣが４８時間で得られた。得られたポＩＪ
　Ｃの分子サイズをＨＰＬＣにより測定したところ、反
応時間２４時間では１２　Ｓ　（沈降定数）以上（分子
量１ｘ１０７ダルトン以上）、３６時間では１２　Ｓ、
　４８時間では１０　Ｓ、　６０時間では８Ｓの分子サ
イズであることがわかった。 実施例３ （１）　ＰＮＰａｓｅの固定化 実施例２と同様の方法にてＧＬ＾処理した２ｍＭ　（Ｖ
／Ｖ）のキトパールＢＣＷ−３０１０を４ｍＭのＰＮＰ
ａｓｅ溶液（２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液、ｐｔ＋ａ、
　５、タンパク濃度２ｍｇ／ｍｌ、ＰＮＰａｓｅ　ユ＝
チカ製）に入れ、室温下で１５５時間振うして固定化を
行った。酵素処理後、未結合のタンパクは、振とうによ
り除去洗浄した。得られた固定化酵素は、担体１艷当り
、１．９ｍｇのＰＮＰａｇｅを固定化していた。 （２）ポリ■の合成 上記（１）と同様にして得た固定化酵素２ｍｌ　（Ｖ／
Ｖ）を５ｍｌノ１０％（Ｉｌｌ／Ｖ）　ＩＤＰ溶液（０
，ＬＭ　）リス−塩酸緩衝液、５ｍＭ　ＭｎＣｌ２．０
．４ｍＭ８０ＴＡ％ｐ）１８．５）に入れ、３５℃にて
振とうしてポリＩを合成した。その経時変化を表に示し
た。 １８時間の反応により６００ａ＋ＨのＩ［ＪＰより２５
２＋ｎｇのポリＩが生成した。得られたポリ■の分子サ
イズをＨＰＬＣにより測定したところ、反応時間８時間
では１２ｇ以上であるが、１２時間では１２Ｓ１その後
、反応時間が２時間経過するに従い、ＩＳずつ小さくな
っていき、１８時間反応して得られたポリ■のＳ値は、
９８以上であった。 実施例４　ポリＡの合成 実施例２で作製したと同じ固定化酵素２ｍｌを用い、１
０ａ＋１の１０％＾ＯＰ溶％Ｃ０，ＩＭ）リス−）ＩＣ
Ｉ緩衝液ｐＨ９，０，４０ｍＭ　ＭｇＣ１＊、０．４ｍ
Ｍ　ＢＤＴＡ）と混合し、３７℃にて振とう（７０スト
ロ一ク７分、ストローク幅２．５ｃｍ）によりポリＡ合
成を行った。４８時間後、反応液中のポリＡをＨＰＬＣ
により定量したところ、４００ｍｇのポリＡが合成され
ていた。 実施例５　ポリＴの合成 実施例３で得た固定化酵素２．Ｏｍｌに１０ｍ１の１０
％ＴＯＰ溶液（０，ＬＭ　）リス−１１ｃＩ緩衝液、ｐ
）ｌｉｔ、　５．２０ｍＭ硫酸マンガン、０．４ｍＭ　
ＢＤＴＡ）を混合し、３５℃で１５時間振とう（７０ス
トロ一ク７分、ストローク幅２．５Ｃａ＋）によりポＩ
ＪＴ合成を行った。その結果、ポ！Ｊ　Ｔ　３３０ｍｇ
を得た。 実施例６　バイオリアクターによるポリＣの合成実施例
２と同じ方法で、固定化酵素１００ｍ１　（Ｖ／Ｖ）を
作成した。この固定化酵素をサクラバイオリアクターＴ
ＢＲ−２（サクラ精機）に入れ、６００ｍ１の１０％Ｃ
口Ｐ（０，１Ｍ　）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９，０）
溶液を加え、回転数２０Ｏｒｐｍ、温度３７±０．５℃
でポリＣの大量合成を行った。その結果を第１図に示し
た。ポリＣの生成量は、５３時間で２４．７ｇに達した
。このことから、回分式水圧バイオリアクターにおいて
も十分に活性が発現しており、大量合成が連続的に可能
であることが明かとなった。 実施例７　　ＰＮＰａｇｅの調製 ミクロコッカス−ルテウス（ミクロコツカス・リゾディ
クティカス）　ＡＴＣＣ４６９８の乾燥菌体（シグマ社
製）２５ｇを０．５％食塩水２５０ｍ１に懸濁させ、Ｉ
Ｎ水酸化ナトリウムでｌｌＨ８，０とし、１００１１１
ｇのリゾチームを加え、３７℃で３０分間インキニベー
トし、水冷後、２０．０００ｘ　ｇ　３０分間遠心し、
その上清を分取する。上清に３３％飽和になるように硫
安を加え、３０分間放置した後、遠心し、その上清を得
た。上清と等容の飽和硫安（ｐ）１８．０）を加え、十
分に撹はんし、３０分放置後、遠心分離する。沈澱を３
７ｓｌの０．１Ｍ）リス−）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ８，１
％１ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶かし、同液
に対して透析する。 透析後、タンパク濃度が、ｌＯωｇ／ｍｌになるように
０．１Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，１）で希釈後、１００
ｎ１当り、２４、４ｇの粉末硫安を加え、２０．０００
　Ｋ　ｇ、　３０分間遠心分離する。その上清を分取し
、１００ｍ１あたり、８．７ｇの粉末硫安を加え、遠心
分離する。沈澱を４０ａ＋１の０．１Ｍ）リスーＨＣｌ
！ｌＩｒ液（ｐＨ８，１，１０ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール、１ｍＭ　８０ＴＡ）に溶かし、同液に対して
透析し、粗ＰＮＰａｓａ分画７５０ａ＋ｇを得た。 この粗ＰＮＰａｓａを実施例２と同様にして、固定化酵
素を調製した。この固定化酵素２ｍｌを用いて、実施例
２と同様にしてポリＣ合成を行った。その結果を下表に
示した。 菌体から抽出した粗ＰＮＰａｇｅを多孔質キトパールＢ
ＣＷ−３０１０（ＧＬ＾処理）に固定化することも可能
であり、そのポリマー合成能は、極めて高いことが、認
められた。 実施例８ 実施例２と同じ方法にて固定化酵素２−を作成した。こ
の固定化酵素２ｒｎｌを２５０ｍ１！賽の三角フラスコ
に入れ、さらに７．５％Ｃ叶溶液溶液、２Ｍ　）リス塩
酸緩衝液、ＰＨ９，５０，２５ｍＭ　ＭｇＣ１＊、　０
．４ｍＭ　ＢＤＴＡ）を５０１ｎｌ加え、３０℃にて振
とうによりポリＣ合成を行った。結果を下の表に示した
。 表でも明らかなように、合成されてくるポリＣの鎖長（
分子量）は、反応時間に伴って小さくなっていくことが
認められ、その変化は極めて緩慢であった（０．５〜１
．０ｍ１ｎ／ｄａｙ）　。このことは、本発明の固定化
酵素により各種分子量のポリＣを反応時間を変化させる
ことにより合成することができることを示している。更
に、反応液に用いる基質を！叶に変えることによって、
各種サイズのポリ■をも合成することができた。 試験例１　ポリＣ合成における酵素活性９９０μｌ　（
７）１０％（１１／Ｖ）　ＣＯＰ溶液（０，１Ｍ　）リ
ス−塩酸、４０ｍＭ　　ＭｇＣ１１，０，４ｍＭ　ＢＤ
ＴＡ、　ｐｆｌ　９．０）に１０μ＋の酵素液（１，６
ｍｇ　ＰＮＰａｓｅ　、　　ＰＬ−ファルマシア社製、
プロダクトＮｏ、　２７−０３０２）を加え、３７℃で
１６時間反応する。反応終了後、ポリＣ生成量を求め、
１時間でのポ’）Ｃ１ｍｇを合成する酵素量を１ユニツ
トとした。ネイティブ酵素（ファルマシア社、Ｎｏ、２
７−０３０２）では、２．３４ユニット／ｍｇタンパク
の特異活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を
示した。 本発明における酵素活性は、１６時間反応でのポリヌク
レオチド合成能により求めた。 試験例２　ポリ１合成における酵素活性９９（Ｊｕｌ）
１０％（Ｗ／Ｖ）　Ｉ　Ｏｒ溶液（０，ＩＭ）！ＪＸ−
塩酸緩衝液、５ｍＭ　　ＭｎＣｌ２．０．４ｍＭ　［！
口Ｔ＾、ｐＨ８，５）に１０μｌの酵素液（０，１ｍｇ
タンパク、ユニチカ社製）を加え、３５℃で１７時間反
応する。反応終了後、ポリＩ量を求め、１時間にｌｆｆ
１ｇ生成する酵素量を１ユニツトとした。ネイティブ酵
素では、３２．９ユニツ）　７ｍｇタンパクの特異活性
を示した。 試験例３ 実施例２と同様にして固定化酵素をつくった。 同様の反応条件にて、ポ＋Ｊ　Ｃ合成反応を連続的に繰
り返し、固定化酵素の安定性を調べた。その結果を表に
示した。 ３０回の連続バッチ反応を繰り返しても活性は、初期活
性の９０％以上保持しており、この固定化酵素は、安定
性が高いことがわかった。 試験例４ 実施例３と同様の方法で固定化酵素を作成し、同一の反
応条件で反応を連続的に繰り返し、安定性を測定した。 その結果を表に示した。 表から明かなように、反応回数が４０回においても初期
活性の８３％を保持しており、安定性が高いことがＳ忍
められた。 試験例５ 合成されたポリヌクレオチド中のエンドトキシンの量を
トキシカラーテスト（生化学工業）を用いて、測定した
。実施例２で得たポリＣ中のエンドトキシン量は、０．
０２〜０．５　Ｂ、　Ｌｌ、　／ｍｇ、実施例３で得た
ポリＩ中のエンドトキシン量は、０．００４〜０．０５
　Ｅ、　１１．　／ｍｇであった。

【発明の効果】

以上の事実から明かなように、ＰＮＰａｓｅを多孔質キ
トサンビーズに効果的に固定化することにより、■酵素
活性を実質的に失活させることなく、安定な固定化酵素
を得ることができ、■ＰＮＰａｇｅの活性も長期にわた
り、安定化し、■使い捨てにすることなく、連続的に使
用できるようになり、■それを用いることにより、ポリ
ヌクレオチドの生産効率を高めることができ、■合成さ
れたポリヌクレオチドへの異種タンパクの混入を防ぎ、
さらにパイロジエンを除去するこができ、精製処理工程
の省力化ができ、高品質のポリスクレオチドを収率良く
合成することができるようになった。 また、■ＰＮＰａｓｅを変性失活処理する必要がないの
で、大型の反応タンク等を用いずに、カラム型リアクタ
ーや水流圧着型バイオリアクターで連続的に大量合成が
可能となった。さらに、■まったく予期しなかったこと
であるが、反応時間を変えることにより任意の分子サイ
ズのポリヌクレオチドを得ることができた。

【図面の簡単な説明】

第１１！Ｉは、バイオリアクターＴＢＲ−２によるポリ
Ｃの合成を表す。縦軸は、ポリＣ濃度（＋ｎｇ／ｍｌ）
と保持時間（分）、横軸は、反応時間を示す。 ・はポリＣの濃度を、マは分子サイズを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔質キトサンビーズにポリヌクレオチドフォス
   フォリラーゼを固定化した固定化酵素。
2. （２）請求項１記載の固定化酵素を用いることを特徴と
   するポリヌクレオチドの製造法。
3. （３）多孔質キトサンビーズに架橋剤で架橋処理した後
   にポリヌクレオチドフォスフォリラーゼを固定化した固
   定化酵素。
4. （４）請求項３記載の固定化酵素を用いることを特徴と
   するポリヌクレオチドの製造法。