JPS63198985A - プロテア−ゼの固定化方法 - Google Patents
プロテア−ゼの固定化方法Info
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- JPS63198985A JPS63198985A JP3291087A JP3291087A JPS63198985A JP S63198985 A JPS63198985 A JP S63198985A JP 3291087 A JP3291087 A JP 3291087A JP 3291087 A JP3291087 A JP 3291087A JP S63198985 A JPS63198985 A JP S63198985A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はプロテアーゼの固定化方法に関し、特に大豆タ
ンパク質の部分分解に使用されるプロテアーゼを適当な
担体に固定化した固定化酵素の調製方法に関するもので
ある。
ンパク質の部分分解に使用されるプロテアーゼを適当な
担体に固定化した固定化酵素の調製方法に関するもので
ある。
従来、大豆タンパク質のような食用タンパク質を酵素で
加水分解し、高度に分解したペプチド混合物を得る方法
として、酵素を担体上に固定させた固定化酵素を用いる
方法が知られている。この方法は従来の遊離酵素による
バッチ法に比べ、連続反応が可能であり、生産性を大幅
に向上させることができ、また機能的にも酵素の熱安定
性が向上し、高温下においても長期の使用に耐えること
ができる。
加水分解し、高度に分解したペプチド混合物を得る方法
として、酵素を担体上に固定させた固定化酵素を用いる
方法が知られている。この方法は従来の遊離酵素による
バッチ法に比べ、連続反応が可能であり、生産性を大幅
に向上させることができ、また機能的にも酵素の熱安定
性が向上し、高温下においても長期の使用に耐えること
ができる。
しかし、固定化酵素を用いた場合、基質となる大豆タン
パク質の分子サイズが大きいため、立体障害を引き起こ
し、固定化された酵素との接触が妨げられ、見掛は上の
酵素活性が著しく低下するという問題がある。また酵素
の固定化を吸着法またはイオン交換法によって行なうと
、酵素反応の進行とともに酵素の離脱が激しく、固定化
酵素の活性が低下するという欠点がある。
パク質の分子サイズが大きいため、立体障害を引き起こ
し、固定化された酵素との接触が妨げられ、見掛は上の
酵素活性が著しく低下するという問題がある。また酵素
の固定化を吸着法またはイオン交換法によって行なうと
、酵素反応の進行とともに酵素の離脱が激しく、固定化
酵素の活性が低下するという欠点がある。
本発明の目的は、このような固定化酵素の欠点を無くし
、酵素活性の低下が生じに（＜、かつ酵素の離脱を起こ
しにくいプロテアーゼの固定化方法を提供することにあ
る。
、酵素活性の低下が生じに（＜、かつ酵素の離脱を起こ
しにくいプロテアーゼの固定化方法を提供することにあ
る。
本発明の第１は、担体にプロテアーゼを結合させるプロ
テアーゼの固定化方法において、予め担体にグルタール
アルデヒドを結合させた後、プロテアーゼを結合させる
ことを特徴とする。
テアーゼの固定化方法において、予め担体にグルタール
アルデヒドを結合させた後、プロテアーゼを結合させる
ことを特徴とする。
本発明の第２は、担体にプロテアーゼを結合させるプロ
テアーゼの固定化方法において、予め担体にグルタール
アルデヒドを結合させた後、グルタールアルデヒドと結
合可能なスペーサーを結合させ、再びグルタールアルデ
ヒドを結合させた後、プロテアーゼを結合させることを
特徴とする。
テアーゼの固定化方法において、予め担体にグルタール
アルデヒドを結合させた後、グルタールアルデヒドと結
合可能なスペーサーを結合させ、再びグルタールアルデ
ヒドを結合させた後、プロテアーゼを結合させることを
特徴とする。
本発明に用いる固定化用担体としては、アミノ基を有す
る陰イオン交換樹脂または天然高分子担体が好ましく用
いられ、具体的に陰イオン交換樹脂としてはアンバーラ
イトＩＲＡ−９３（ローム・アンド・ハース社の商品名
）、ダイヤイオンＷＡ−３０（三菱化成社の商品名）等
が挙げられ、天然高分子担体としてはキトサンビーズが
挙げられる。
る陰イオン交換樹脂または天然高分子担体が好ましく用
いられ、具体的に陰イオン交換樹脂としてはアンバーラ
イトＩＲＡ−９３（ローム・アンド・ハース社の商品名
）、ダイヤイオンＷＡ−３０（三菱化成社の商品名）等
が挙げられ、天然高分子担体としてはキトサンビーズが
挙げられる。
本発明において、上記酵素およびグルタールアルデヒド
の結合反応は０．５〜１．０ｍｏｌ／ｉ！、好ましくは
０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのリン酸バッファー中で行な
うことが好ましい。
の結合反応は０．５〜１．０ｍｏｌ／ｉ！、好ましくは
０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのリン酸バッファー中で行な
うことが好ましい。
本発明で使用されるリン酸バッファーとしては、リン酸
水素二ナトリウム（Ｎａ２ ＨＰＯ４） 、リン酸二水
素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）等の水溶液が好適に用いら
れ、任意のｐＨに調製して使用される。
水素二ナトリウム（Ｎａ２ ＨＰＯ４） 、リン酸二水
素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）等の水溶液が好適に用いら
れ、任意のｐＨに調製して使用される。
本発明に用いるスペーサーとしては、グルタールアルデ
ヒドと結合可能なアミノ基を有する物質が通し、例えば
ヘキサメチレンジアミン、ポリエチレンイミン、または
アルブミン等のタンパク質が挙げられる。
ヒドと結合可能なアミノ基を有する物質が通し、例えば
ヘキサメチレンジアミン、ポリエチレンイミン、または
アルブミン等のタンパク質が挙げられる。
本発明において、担体にプロテアーゼを固定化する基本
的な手順は以下の通りである。
的な手順は以下の通りである。
（１）担体の水洗浄、脱気等必要な前処理を行なう。
（２）１〜５％（重量％、以下同じ）グルタールアルデ
ヒドを含む０．５〜１．Ｑｍｏｌ／ｌのリン酸バッファ
ー中に該担体を分散させ、１〜２時間室温で攪拌する。
ヒドを含む０．５〜１．Ｑｍｏｌ／ｌのリン酸バッファ
ー中に該担体を分散させ、１〜２時間室温で攪拌する。
（３）グルタールアルデヒドが実質的に認められなくな
るまで担体を水で洗浄する。
るまで担体を水で洗浄する。
（４）０．１〜１％プロテアーゼを含む０．５〜１．０
ｍ ｏ １ ／ １２のリン酸バッファー中に担体を分
散し、１〜２時間室温で攪拌し、酵素を固定化させる。
ｍ ｏ １ ／ １２のリン酸バッファー中に担体を分
散し、１〜２時間室温で攪拌し、酵素を固定化させる。
以上の方法により、酵素反応中に酵素の固定化担体から
の離脱が少なく、安定で、活性の高い固定化酵素を調製
することができる。
の離脱が少なく、安定で、活性の高い固定化酵素を調製
することができる。
一方、スペーサーを用いた場合の本発明のプロテアーゼ
の固定化方法の手順を以下に述べる。
の固定化方法の手順を以下に述べる。
（１）担体の水洗浄、脱気等の必要な前処理を行なう。
（２）１〜５％グルクールアルデヒドを含む０．５〜１
．０ｍｏｌ／Ｉｌのリン酸バッファー中に該担体を分散
させ、１〜２時間室温で攪拌する。
．０ｍｏｌ／Ｉｌのリン酸バッファー中に該担体を分散
させ、１〜２時間室温で攪拌する。
（３）グルタールアルデヒドが認められなくなるまで該
担体を水で洗浄する。
担体を水で洗浄する。
（４）（３）の担体を０．５〜５％スペーサー成分を含
む０．５〜１．０ｍｏｌ／ｌリン酸バッファー中に分散
し、１〜２時間室温で攪拌する。
む０．５〜１．０ｍｏｌ／ｌリン酸バッファー中に分散
し、１〜２時間室温で攪拌する。
（５）スペーサー成分が実質的に認められなくなるまで
該担体を水で洗浄する。
該担体を水で洗浄する。
（６）（５）の担体を再度１〜５％グルタールアルデヒ
ドを含む０．５〜１．Ｑｍｏｌ／ｊｔのリン酸バッファ
ー中に分散し、１〜２時間室温で攪拌する。
ドを含む０．５〜１．Ｑｍｏｌ／ｊｔのリン酸バッファ
ー中に分散し、１〜２時間室温で攪拌する。
（７）グルタールアルデヒドが実質的に認められなくな
るまで該担体を水で洗浄する。
るまで該担体を水で洗浄する。
（８）０．１〜１％プロテアーゼを含む０．５を１．０
ｍ ｏ ｌ ／βリン酸バッファー中に該担体を分散さ
せ、１〜２時間室温で攪拌することにより酵素を固定化
する。
ｍ ｏ ｌ ／βリン酸バッファー中に該担体を分散さ
せ、１〜２時間室温で攪拌することにより酵素を固定化
する。
上記のようにスペーサーを用いることにより、担体、グ
ルタールアルデヒドおよびプロテアーゼ間の反応の立体
障害を低減させ、さらに活性の高い固定化酵素を得るこ
とができる。
ルタールアルデヒドおよびプロテアーゼ間の反応の立体
障害を低減させ、さらに活性の高い固定化酵素を得るこ
とができる。
以下、本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説明する
。
。
・ 実施例１
担体として粒径１ｍｍのキトサンビーズ（富士紡績社製
キトパール）を水洗浄し、減圧脱気を行なった後、４Ｍ
量％グルタールアルデヒドを含む第１表の濃度のリン酸
バッファー中に分散し、約２時間室温で攪拌した。次に
グルタールアルデヒドの存在が認められなくなるまで該
担体を水洗浄した後０．５％プロテアーゼ（大和化成社
製プロチン−ＡＣ）を含む第１表の濃度のリン酸バッフ
ァー中に前記担体を分散し、約２時間室温で攪拌して酵
素の固定化を行なった。この場合の固定化酵素量および
活性発現率（同量の遊離酵素が示す活性に対する固定化
酵素の活性の割合）は第１表のようであった。
キトパール）を水洗浄し、減圧脱気を行なった後、４Ｍ
量％グルタールアルデヒドを含む第１表の濃度のリン酸
バッファー中に分散し、約２時間室温で攪拌した。次に
グルタールアルデヒドの存在が認められなくなるまで該
担体を水洗浄した後０．５％プロテアーゼ（大和化成社
製プロチン−ＡＣ）を含む第１表の濃度のリン酸バッフ
ァー中に前記担体を分散し、約２時間室温で攪拌して酵
素の固定化を行なった。この場合の固定化酵素量および
活性発現率（同量の遊離酵素が示す活性に対する固定化
酵素の活性の割合）は第１表のようであった。
なお固定化酵素の活性測定条件は以下の通りである。
基質： １％大豆タンパク質
温度： ６０℃
ｐＨ＝８．５
第１表
上表の結果から、担体にグルタールアルデヒドとプロテ
アーゼとを別々に結合させる方法において、高濃度リン
酸バッファー中で酵素を固定化した方が、低濃度リン酸
バッファー中よりも固定化酵素量は若干増加し、活性発
現率では２倍以上の値を示すことが分かった。
アーゼとを別々に結合させる方法において、高濃度リン
酸バッファー中で酵素を固定化した方が、低濃度リン酸
バッファー中よりも固定化酵素量は若干増加し、活性発
現率では２倍以上の値を示すことが分かった。
実施例２）比較例１〜２
担体として陰イオン交換樹脂アンバーライト■ＲＡ−９
３（ローム・アンド・ハース社の商品名）を水洗浄、減
圧脱気した後、４％グルタールアルデヒドを含むｐＨ７
，０、Ｑ、３ ｍ ｏ Ｉｔ ／ ｌのリン酸バッファ
ー中に分散し、約２時間室温で攪拌し、次にグルタール
アルデヒドが認められなくなるまで担体を水で洗浄し、
さらに該担体を０．５％のスペーサー成分（ヘキサメチ
レンジアミン）を含む上記と同じリン酸バッファー中に
分散し、約２時間室温で攪拌し、その後スペーサー成分
が認められなくなるまで担体を水で洗浄した。洗浄され
た担体を再度４％グルタールアルデヒドを含む上記リン
酸バッファー中に分散し、約２時間室温で攪拌した後、
グルタールアルデヒドが認められなくなるまで担体を水
で洗浄し、最後に洗浄後の担体を０．５％プロテアーゼ
（大和化成社製、プロチン−ＡＣ）を含む上記リン酸バ
ッファー中に分散さ廿、約２時間室温で攪拌し、酵素を
固定化した。
３（ローム・アンド・ハース社の商品名）を水洗浄、減
圧脱気した後、４％グルタールアルデヒドを含むｐＨ７
，０、Ｑ、３ ｍ ｏ Ｉｔ ／ ｌのリン酸バッファ
ー中に分散し、約２時間室温で攪拌し、次にグルタール
アルデヒドが認められなくなるまで担体を水で洗浄し、
さらに該担体を０．５％のスペーサー成分（ヘキサメチ
レンジアミン）を含む上記と同じリン酸バッファー中に
分散し、約２時間室温で攪拌し、その後スペーサー成分
が認められなくなるまで担体を水で洗浄した。洗浄され
た担体を再度４％グルタールアルデヒドを含む上記リン
酸バッファー中に分散し、約２時間室温で攪拌した後、
グルタールアルデヒドが認められなくなるまで担体を水
で洗浄し、最後に洗浄後の担体を０．５％プロテアーゼ
（大和化成社製、プロチン−ＡＣ）を含む上記リン酸バ
ッファー中に分散さ廿、約２時間室温で攪拌し、酵素を
固定化した。
結果を第２表に示す。
なお、比較例として担体をグルタールアルデヒドのみを
用いて処理した場合、および担体をグルタールアルデヒ
ドとへキサメチレンジアミンを同時に含むリン酸バッフ
ァー液中で処理した場合のプロテアーゼの固定化結果も
第２表に示した。
用いて処理した場合、および担体をグルタールアルデヒ
ドとへキサメチレンジアミンを同時に含むリン酸バッフ
ァー液中で処理した場合のプロテアーゼの固定化結果も
第２表に示した。
第 ２ 表
第２表の結果からスペーサーの導入により酵素活性発現
率は４倍以上に増加することが分かる。
率は４倍以上に増加することが分かる。
なおスペーサーを添加する場合、グルタールアルデヒド
とへキサメチレンジアミンを同時に添加した場合はその
効果は認められなかった。
とへキサメチレンジアミンを同時に添加した場合はその
効果は認められなかった。
実施例３
担体として陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ−３０（
三菱化成社の商品名）に従来のイオン結合法で前記プロ
テアーゼを結合した固定化酵素Ａ、吸着樹脂ダイヤイオ
ンｔ（Ｐ−５０（三菱化成社の商品名）に吸着法により
プロテアーゼを結合した固定化酵素Ｂ、およびキトサン
ビーズ（富士紡績社製キトバール）に本発明の方法に従
いプロテアーゼを結合した固定化酵素Ｃのそれぞれ２５
ｇを反応容量１５０ｍｊ？の反応容器に充填し、これに
温度６０℃、ｐＨ８，５の条件で、１％大豆分離タンパ
クを基質として６０ ｍ ｉｔ ／ ｈ ｒで連続的に
供給し、固定化酵素の活性の経時変化を測定した。
三菱化成社の商品名）に従来のイオン結合法で前記プロ
テアーゼを結合した固定化酵素Ａ、吸着樹脂ダイヤイオ
ンｔ（Ｐ−５０（三菱化成社の商品名）に吸着法により
プロテアーゼを結合した固定化酵素Ｂ、およびキトサン
ビーズ（富士紡績社製キトバール）に本発明の方法に従
いプロテアーゼを結合した固定化酵素Ｃのそれぞれ２５
ｇを反応容量１５０ｍｊ？の反応容器に充填し、これに
温度６０℃、ｐＨ８，５の条件で、１％大豆分離タンパ
クを基質として６０ ｍ ｉｔ ／ ｈ ｒで連続的に
供給し、固定化酵素の活性の経時変化を測定した。
その結果を第１図に示す。
第１図によれば、イオン交換法、吸着法によって固定化
酵素を鋼製した場合（Ａ）、（Ｂ）は固定化酵素の活性
低下が著しく、これは酵素の担体からの親離によるもの
と考えられた。一方、本発明方法により固定化したキト
サンビーズの場合（Ｃ）はその活性低下はごく僅かであ
った。
酵素を鋼製した場合（Ａ）、（Ｂ）は固定化酵素の活性
低下が著しく、これは酵素の担体からの親離によるもの
と考えられた。一方、本発明方法により固定化したキト
サンビーズの場合（Ｃ）はその活性低下はごく僅かであ
った。
本発明によれば、担体にグルタールアルデヒドとプロテ
アーゼを別々に作用させ、グルタールアルデヒドと酵素
（プロテアーゼ）を直接接触させないことにより、該酵
素のグルタールアルデヒドによる活性低下を防止し、ま
た担体とグルタールアルデヒドの結合、グルタールアル
デヒドと酵素との結合をスペーサーの存在下で、好まし
くは高濃度のリン酸バッファー中で行なうことにより、
さらに安定で活性の高い固定化酵素の調製を行なうこと
ができる。
アーゼを別々に作用させ、グルタールアルデヒドと酵素
（プロテアーゼ）を直接接触させないことにより、該酵
素のグルタールアルデヒドによる活性低下を防止し、ま
た担体とグルタールアルデヒドの結合、グルタールアル
デヒドと酵素との結合をスペーサーの存在下で、好まし
くは高濃度のリン酸バッファー中で行なうことにより、
さらに安定で活性の高い固定化酵素の調製を行なうこと
ができる。
第１図は本発明の実施例の結果を示す説明図である。
Claims (4)
- （１）担体にプロテアーゼを結合させるプロテアーゼの
固定化方法において、予め担体にグルタールアルデヒド
を結合させた後、プロテアーゼを結合させることを特徴
とするプロテアーゼの固定化方法。 - （２）特許請求の範囲第１項において、前記結合を０．
５〜１．０ｍｏｌ／ｌのリン酸バッファー中で行なうこ
とを特徴とするプロテアーゼの固定化方法。 - （３）担体にプロテアーゼを結合させるプロテアーゼの
固定化方法において、予め担体にグルタールアルデヒド
を結合させた後、グルタールアルデヒドと結合可能なス
ペーサーを結合させ、再びグルタールアルデヒドを結合
させた後、プロテアーゼを結合させることを特徴とする
プロテアーゼの固定化方法。 - （４）前記プロテアーゼおよびグルタールアルデヒドの
結合を０．５〜１．０ｍｏｌ／ｌのリン酸バッファー中
で行なうことを特徴とするプロテアーゼの固定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3291087A JPS63198985A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | プロテア−ゼの固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3291087A JPS63198985A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | プロテア−ゼの固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198985A true JPS63198985A (ja) | 1988-08-17 |
Family
ID=12372053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3291087A Pending JPS63198985A (ja) | 1987-02-16 | 1987-02-16 | プロテア−ゼの固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63198985A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITFI20120139A1 (it) * | 2012-07-06 | 2014-01-07 | Inalco S A S Di Giovanni Cipollett I & C | Enzimi immobilizzati su matrici polimeriche di stirene-divinil benzene e loro impiego in produzioni industriali. |
-
1987
- 1987-02-16 JP JP3291087A patent/JPS63198985A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITFI20120139A1 (it) * | 2012-07-06 | 2014-01-07 | Inalco S A S Di Giovanni Cipollett I & C | Enzimi immobilizzati su matrici polimeriche di stirene-divinil benzene e loro impiego in produzioni industriali. |
| WO2014006606A1 (en) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Inalco S.A.S. Di Giovanni Cipolletti & C. | Enzymes immobilised on styrene-divinyl benzene polymer matrices and the use thereof in industrial productions |
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