ITFI20120139A1 - Enzimi immobilizzati su matrici polimeriche di stirene-divinil benzene e loro impiego in produzioni industriali. - Google Patents
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Description
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
ENZIMI IMMOBILIZZATI SU MATRICI POLIMERICHE DI STIRENE-DIVINIL BENZENE E LORO IMPIEGO IN PRODUZIONI INDUSTRIALI CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo degli enzimi immobilizzati su matrici polimeriche, in particolare si riferisce all’immobilizzazione di enzimi, del tipo idrolasi, su matrici di stirene-divinil benzene, non funzionalizzate o funzionalizzate con gruppi amminici terziari, tramite la formazione di un legame stabile tra la matrice attivata con glutaraldeide e l’enzima.
STATO DELL’ARTE
L’uso degli enzimi immobilizzati su supporti solidi insolubili nei processi produttivi industriali à ̈ noto da tempo. L’immobilizzazione delle molecole enzimatiche permette il loro riutilizzo in successivi cicli di reazione con conseguente abbattimento dei costi di produzione e semplificazione delle operazioni di isolamento dei prodotti della reazione enzimatica. A tale scopo, si à ̈ resa necessaria la ricerca di supporti insolubili particolarmente economici e di metodiche di immobilizzazione semplici ed efficienti.
Le tecniche di immobilizzazione più diffuse possono essere raggruppate in quattro categorie:
1) adsorbimento con formazione di legami deboli di tipo ionico o Van der Waals tra il supporto e l’enzima;
2) intrappolamento delle molecole enzimatiche in gel polimerici;
3) cross-linking con formazione di legami covalenti tra le varie molecole proteiche; detto cross-linking può essere effettuato sull’enzima tal quale, dopo adsorbimento su di una matrice polimerica priva di gruppi amminici primari oppure dopo intrappolamento in un gel polimerico;
4) legame covalente con formazione di un legame stabile tra il supporto e l’enzima.
L’adsorbimento à ̈ un metodo semplice ed economico che comporta però lo svantaggio di un facile desorbimento delle molecole enzimatiche dal carrier; il desorbimento può essere causato anche da piccoli cambiamenti delle condizioni di reazione come la variazione del pH, della temperatura, della salinità o della concentrazione del substrato. Anche nel caso dell’intrappolamento, si possono verificare perdite di attività dovute alla fuoriuscita di enzima dal reticolo del gel. Questi inconvenienti possono essere in parte eliminati o diminuiti tramite crosslinking tra le varie molecole di enzima ma questa tecnologia non à ̈ applicabile a tutti i supporti e a tutti gli enzimi e spesso porta a perdite di attività considerevoli rispetto all’uso dell’enzima libero. La formazione di un legame covalente con una matrice solida insolubile à ̈ un metodo efficace per stabilizzare l’immobilizzazione dell’enzima. Non tutti i carrier però presentano gruppi funzionali adatti alla formazione di legami covalenti, generalmente tramite un linker divalente che consente la formazione di basi di Schiff, fra il supporto solido e il legante e tra il legante e l’enzima. In molti casi inoltre il costo del carrier o la complessità del processo di immobilizzazione rendono questo metodo economicamente svantaggioso rispetto all’utilizzo dell’enzima libero.
L’uso di leganti bifunzionali come la glutaraldeide per l’immobilizzazione degli enzimi tramite il legame covalente o cross-linking rappresenta un metodo relativavente economico ed ampiamente diffuso (David R. Walt, Venetka I. Agayn, The chemistry of enzyme and protein immobilization with glutaraldehyde, TrAC Trends in Analytical Chemistry, Volume 13, Issue 10, November–December 1994, pages 425-430, P. Monsan, Optimization of glutaraldehyde activation of a support for enzyme immobilization, Journal of Molecular Catalysis, volume 3, Issue 5, February 1978, pages 371–384, Hee Jeong Chae, Man-Jin In and Eui Yong Kim Optimization of protease immobilization by covalent binding using glutaraldehyde Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 73, Numbers 2-3 (1998), pages 195-204).
In questo caso l’mmobilizzazione può avvenire sostanzialmente con due modalità : 1) qualora siano presenti gruppi amminici primari sul supporto insolubile, attivazione con glutaraldeide dei gruppi amminici primari e successivo legame dell’enzima alla matrice attivata; in questo caso un gruppo aldeidico della glutaraldeide reagisce con un gruppo amminico del supporto solido formando una base di Schiff e successivamente l’altro gruppo aldeidico della glutaraldeide reagisce con gruppo amminici primari (generalmente catene laterali di residui di lisina) presenti sull’enzima;
2) nel caso in cui non siano presenti sul supporto insolubile gruppi amminici primari e quindi non sia possibile la formazione della base di Schiff fra supporto ed un gruppo aldeidico della glutaraldeide, adsorbimento o intrappolamento delle molecole enzimatiche al supporto e successiva stabilizzazione mediante crosslinking con glutaraldeide; in questo caso le molecole di enzima risultano connesse l'una all'altra tramite legami stabiliti con il linker, questo cross-linking può influenzare negativamente l’attività dell’enzima o la possibilità di riutilizzo per numerosi cicli (Lorena Betancor, et al, Glutaraldehyde in Protein Immobilization – A Versatile reagent – Methods in Biotechnology<TM>, 1, Volume 22, Immobilization of Enzymes and Cells, pages 57-64, Bayraktar H,et al. Immobilization and stabilization of α-galactosidase on Sepabeads EC-EA and EC-HA., Int J Biol Macromol 2011 Nov 1;49(4):855-60. Epub 2011 Aug 19).
Così ad esempio in JP3015387 i gruppi amminici primari del carrier (poliglicidil metacrilato funzionalizzato con etanolammina) vengono attivati con una soluzione di glutaraldeide tamponata a pH 8 e successivamente il supporto così preparato viene messo in contatto con una soluzione contenente l’enzima nel medesimo tampone.
In CN101560511 l’enzima fruttosil transferasi viene prima adsorbito sul supporto macroporoso, tramite legame ionico e successivamente stabilizzato tramite crosslinking con una soluzione di glutaraldeide. L’attività dell’enzima può arrivare all’81% e può essere riciclato per circa 10 volte.
Tra i vari supporti insolubili derivatizzati con gruppi amminici primari utilizzati per l’immobilizzazione con glutaraldeide vi sono le resine polimeriche a matrice acrilica (come ad esempio la Sepabeads<®>EC-EA Resindion, la Sepabeads<®>EC-HA Resindion, la PUROLITE<®>ECR8310F e la PUROLITE<®>ECR8310F), le resine polimeriche a matrice stirene-divinil benzene (come ad esempio la PUROLITE<®>A109) e le resine a matrice polisaccaridica (come ad esempio la EAH Sepharose<TM>4B). Questi supporti sono commercialmente disponibili quasi esclusivamente per applicazioni speciali (e generalmente in scala di laboratorio), come appunto l’immobilizzazione degli enzimi e provengono in generale da processi produttivi piuttosto costosi. In conseguenza di ciò , questi supporti presentano costi molto elevati che ne limitano l’impiego su scala industriale.
Per tale motivo à ̈ sorta la necessità di disporre di enzimi immobilizzati su resine più economiche e conseguentemente anche la necessità di metodi per l’immobilizzazione, mediante legami stabili, di enzimi su resine più economiche. Fra le resine più economiche si trovano in commercio quelle funzionalizzate con gruppi amminici terziari come ad esempio PUROLITE<®>A100, PUROLITE<®>A100S, PUROLITE<®>A120 S, Rohm and Haas Amberlite<TM>IRA-94S, e la Rohm and Haas Amberlite<TM>FPA 51 o non funzionalizzate come ad esempio Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX66 e Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX68 che sono commercializzate per applicazioni su larga scala quali ad esempio per la produzione di acqua demineralizzata o per la deionizzazione di soluzioni a basso valore aggiunto.
Suddette resine non derivatizzate o portanti gruppi amminici terziari, non potendo, in teoria, formare basi di Schiff, si presume non possano essere utilizzate per immobilizzare enzimi mediante formazione di un legame covalente con glutaraldeide ma tutt’al più mediante adsorbimento e successivo cross-linking con glutaraldeide.
Risulta pertanto evidente la necessità di fornire un processo per l’immobilizzazione di enzimi, mediante legami stabili, su matrici polimeriche economiche e prive di gruppi amminici primari.
E’ sentita anche la necessità di disporre di enzimi, soprattutto del tipo idrolasi, che siano immobilizzati su supporti solidi, possibilmente molto economici, mediante legami stabili in modo tale da preservare l’efficienza enzimatica in condizioni di reazione stressanti come l'alta salinità o l'alta temperatura e per un numero elevato di cicli di reazione, così da poter essere utilizzati per produzioni su scala industriale.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Sorprendentemente à ̈ stato scoperto che resine polimeriche a base di copolimero stirene-divinilbenzene non derivatizzate o portanti gruppi amminici terziari, che in teoria non possono formare basi di Schiff, reagiscono con leganti bi funzionali, in particolare come la glutaraldeide, formando un legame covalente e dando luogo ad un intermedio attivato che a sua volta à ̈ particolarmente adatto per l’immobilizzazione di enzimi tramite legame covalente. Gli enzimi così immobilizzati risultano particolarmente stabili e mantengono la loro efficienza catalitica per numerosissimi cicli di reazione anche se mantenuti per lunghi periodi in condizioni drastiche di temperatura e salinità .
La presente invenzione ha per oggetto un supporto polimerico a struttura di copolimero stirene-divinilbenzene attivato per trattamento con un composto dialdeidico di formula OHC-(CH2)n-CHO in cui n à ̈ un numero intero compreso fra 1 e 10, preferibilmente n à ̈ compreso fra 2 e 4, più preferibilmente n=3 ovvero glutaraldeide, dove detto supporto polimerico, in partenza, à ̈ non funzionalizzato oppure à ̈ funzionalizzato con gruppi amminici o ammonici esclusi i gruppi amminici primari, in cui fra detto copolimero e il composto di-aldeidico (ad es. la glutaraldeide) si à ̈ formato un legame covalente.
Il supporto attivato secondo la presente invenzione à ̈ stabile e conservabile per mesi mantenendo la sua reattività in successivi utilizzi.
Oggetto della presente invenzione à ̈ quindi anche un metodo per la preparazione di suddetto supporto attivato ed il suo utilizzo per l’immobilizzazione su di esso di un enzima tramite la formazione di un legame covalente fra l’enzima ed un gruppo aldeidico del composto di-aldeidico di formula OHC-(CH2)n-CHO (ad es. glutaraldeide) legato al supporto.
Oggetto dell’invenzione à ̈ quindi anche un enzima immobilizzato su di un supporto attivato come sopra descritto e il metodo per la preparazione di detto enzima immobilizzato.
La presente invenzione unisce i vantaggi di un metodo di immobilizzazione semplice ed efficace, all’uso di resine commerciali a basso costo come ad esempio la PUROLITE<®>A100, PUROLITE<®>A100S, PUROLITE<®>A120 S, Rohm and Haas Amberlite<TM>IRA-94S, e la Rohm and Haas Amberlite<TM>FPA 51.
In questo caso, contrariamente a ciò che à ̈ noto allo stato dell’arte, viene utilizzata la stessa procedura di attivazione delle resine derivatizzate con gruppi amminici primari su resine terziarie prive di gruppi amminici primari e quindi chimicamente (in teoria) non disponibili per la formazione di basi di Schiff con la glutaraldeide portando, sorprendentemente, a risultati sovrapponibili in entrambi i casi. Quindi, per la presente invenzione, la natura della matrice insolubile risulta particolarmente importante e deve essere necessariamente costituita da un polimero di stirene-divinil benzene. Infatti, la stessa procedura applicata sulle resine amminiche terziarie ma con diversa matrice (Es.polimetacrilica) non porta al medesimo risultato della presente invenzione.
Gli enzimi immobilizzati secondo la presente invenzione hanno presentato una elevata stabilità dell’attività sia in condizioni di estrema salinità che di temperature di lavoro per lavorazioni in ciclo continuo per più di 2 mesi
Gli enzimi immobilizzati secondo la presente invenzione sono risultati particolarmente utili in processi di produzione industriale del galattosio e tagatosio.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Preferibilmente secondo la presente invenzione il supporto di partenza per la preparazione del supporto attivato à ̈ scelto nel gruppo consistente in PUROLITE<®>A100, PUROLITE<®>A100S, PUROLITE<®>A120 S, Rohm and Haas Amberlite<TM>IRA-94S,Rohm and Haas Amberlite<TM>FPA 51, Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX66 e Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX68.
Preferibilmente secondo l’invenzione per l’attivazione di detto supporto si impiega una soluzione di composto di-aldeidico (preferibilmente glutaraldeide) al 1-50% in peso, più preferibilmente al 3-7%, tamponata ad un pH adeguato generalmente compreso fra 2 e 9, preferibilmente 5.
Il trattamento con la soluzione di composto di-aldeidico à ̈ condotto a temperatura compresa fra 4 e 60°C, preferibilmente a temperatura ambiente (20-30°C) per 2-120 ore, preferibilmente 18-36 ore, mantenendo la miscela in lenta agitazione. La resina attivata così ottenuta viene poi isolata per filtrazione e lavata con acqua e successivamente con una soluzione tamponata a pH come quella impiegata per l’attivazione.
La resina attivata può essere usata per l’immobilizzazione di enzimi tramite legame covalente (fra la funzione aldeidica e un gruppo amminico dell’enzima). Per l’immobilizzazione dell’enzima à ̈ preferibile preparare una soluzione tamponata a pH 2-9 (in dipendenza dall’enzima) dell’enzima ad una concentrazione in media di 50-5000 ppm di proteine totali in soluzione che viene aggiunta alla resina attivata come precedentemente descritto. La miscela viene mantenuta in lenta agitazione ad una temperatura compresa tra 4 e 60 °C preferibilmente ad una temperatura di 20-30°C, per 6-240 ore. Il tempo di immobilizzazione così come il pH di lavoro varia da enzima ad enzima.
Ad avvenuta immobilizzazione la resina viene poi isolata per filtrazione e lavata con acqua e poi con una soluzione tamponata.
L’enzima immobilizzato così ottenuto può essere utilizzato secondo le sue ottimali condizioni di lavoro.
Ai fini della presente invenzione può essere immobilizzato un qualunque enzima ed in maniera preferita l’enzima à ̈ scelto fra le idrolasi e le isomerasi, quindi ad esempio: beta-galattosidasi, L-arabinosio isomerasi, α-fucosidasi.
In una forma realizzativa particolarmente preferita l’enzima beta-galattosidasi immobilizzato secondo la presente invenzione à ̈ stato usato in maniera particolarmente vantaggiosa per la preparazione di tagatosio da lattosio contenuto in acque madri di cristallizzazione o anche in permeato di siero di latte.
In particolare ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un processo per la preparazione di tagatosio da lattosio, detto processo comprendente i seguenti passaggi:
a- idrolisi del lattosio con enzima beta-galattosidasi immobilizzato come sopra descritto a dare glucosio e galattosio;
in cui, preferibilmente perchà ̈ particolarmente conveniente, detto lattosio à ̈ quello contenuto in:
- acque madri di cristallizzazione da processo di produzione industriale aventi una conducibilità di circa 24 mS/cm;
- permeato di siero di latte con il 21-23 % di sostanza secca con il 18 % circa di lattosio e una conducibilità di circa 10 mS/cm.
b- Deglucosazione con lievito per panificazione;
c- Epimerizzazione del galattosio a tagatosio mediante calce ventilata.
Opzionalmente il processo di cui sopra può comprendere anche il seguente passaggio
d- degalattosazione finale con lievito per ottenere un prodotto privo di galattosio .
La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.
PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi) da Aspergillus orizae su resina stirenica-DVB ammina terziaria secondo la presente invenzione -scala laboratorio.
62,5 ml di resina a matrice polimerica stirene-divinil benzene funzionalizzata con gruppi amminici terziari Amberlite<TM>Rhom and Haas FPA 51 sono stati lavati su imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 400 ml di acqua demineralizzata e successivamente con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. Al termine dei lavaggi la resina à ̈ stata trasferita in un pallone in vetro da 250 ml provvisto di asta agitatrice e unita a 43 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore. Dall’analisi HPLC di campioni del surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 5,95 %
[Glutaraldeide finale] = 3,22 %
La resina à ̈ stata poi trasferita in un imbuto filtrante Gooch e lavata con 400 ml di acqua demineralizzata e con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente.
2 g di enzima lattasi (β−galattosidasi) Kerry Biolactase F CONC sono stati sciolti in 175 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 in un pallone in vetro da 250 ml provvisto di asta agitatrice in cui à ̈ stata trasferita la resina attivata e filtrata e mantenuti in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore.
La resina à ̈ stata recuperata e lavata con 40 ml di acqua demineralizzata.
Dall’analisi delle proteine totali nel surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 1650 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 11 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere superiore al 90%.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata verificata trasferendo 10 ml di resina derivatizzata in un reattore in vetro da 2,5 litri e unendola a 2 Kg di una soluzione acquosa di lattosio al 20 % (W/W) a pH 4,9 sotto lenta agitazione ad una temperatura di 50°C. Durante la reazione di idrolisi sono stati prelevati campioni per l’analisi HPLC ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 17,3 - -24 ore 5,6 6,4 4,1
120 ore 1,1 9,3 8,4
ESEMPIO 2
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi ) da Aspergillus orizae su resina stirenica non derivatizzata
62 ml di resina Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX 68 a matrice polimerica di stirene-divinil benzene non derivetizzata sono stati lavati su imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 400 ml di acqua demineralizzata e successivamente con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. Al termine dei lavaggi la resina à ̈ stata trasferita in un pallone in vetro da 250 ml provvisto di asta agitatrice e unita a 43 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore. Dall’analisi HPLC di campioni del surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 4,35 %
[Glutaraldeide finale] = 1,99 %
La resina à ̈ stata poi trasferita in un imbuto filtrante Gooch e lavata con 400 ml di acqua demineralizzata e con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. 2 g di enzima lattasi (β−galattosidasi) Kerry Biolactase F CONC sono stati sciolti in 175 ml di una soluzione acquosa di Naacetato 100 mM a pH 5 in un pallone in vetro da 250 ml provvisto di asta agitatrice e mantenuti in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore.
La resina à ̈ stata recuperata e lavata con 400 ml di acqua demineralizzata.
Dall’analisi delle proteine totali nel surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 1298 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 69 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere superiore al 90%.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata verificata trasferendone 25 ml in un reattore in vetro da 1 litro equipaggiato con asta agitatrice, termostatato a 50 °C e contenente 500 g di una soluzione di lattosio al 20% (w/w) a pH 4,9
Durante la reazione di idrolisi sono stati prelevati campioni a vari tempi per l’analisi HPLC che hanno mostrato i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 18,0 - -24 ore 0,6 8,9 8,3
La stessa resina à ̈ stata utilizzata per una seconda reazione di idrolisi preparata come la precedente ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 20,0 - -24 ore 0,5 10,1 9,6
ESEMPIO 3 - Esempio comparativo
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi ) da Aspergillus orizae su resina stirenica ammina primaria.
13,4 Kg di resina a matrice polimerica stirene-divinil benzene funzionalizzata con gruppi amminici primari Purolite<®>A 109 sono stati introdotti in un filtro in acciaio sotto vuoto e lavati, a temperatura ambiente, con 2 aliquote da 25 litri ciascuna di alcool isopropilico, con 3 aliquote da 25 litri ciascuna di acqua demineralizzata e con 25 litri di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5. La resina à ̈ stata trasferita in un reattore in acciaio da 250 litri e unita a 70 litri una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore. Dall’analisi HPLC sul surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 5,57 %
[Glutaraldeide finale] = 3,35 %
La resina à ̈ stata trasferita in un filtro in acciaio sotto vuoto e lavata con 100 litri di acqua demineralizzata e con 25 litri di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5.
400 g di enzima lattasi (β−galattosidasi) Kerry Biolactase F CONC sono stati sciolti nel reattore in acciaio da 250 litri, in 60 litri di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5 e uniti alla resina mantenendo in lenta agitazione a temperatura ambiente per 72 ore.
Dall’analisi delle proteine totali nel surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 1200 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 10 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere superiore al 90%.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata verificata trasferendo 10 ml di resina derivatizzata in un reattore in vetro da 2,5 litri e unendola a 2 Kg di una soluzione acquosa di lattosio al 20 % (W/W) a pH 4,8 sotto lenta agitazione ad una temperatura di 50°C. Durante la reazione di idrolisi sono stati prelevati campioni per l’analisi HPLC ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 19,3 -
24 ore 5,8 5,9 3,8
96 ore 1,0 8,7 7,8
ESEMPIO 4 - Esempio comparativo
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi) da Asperigillus orizae su resina ammina terziaria non stirenica.
33,5 g di resina Amberlite<TM>Rhom and Haas FPA 55 a matrice acrilica sono stati lavati in un imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 125 ml di alcool isopropilico, con 400 ml di acqua demineralizzata ed equilibrati con 250 ml di una soluzione di Naacetato 100 mM a pH 5. La resina à ̈ stata unita in un pallone in vetro da 250 ml corredato di asta agitatrice a 175 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore.
La resina à ̈ stata poi trasferita in un imbuto filtrante Gooch e lavata con 400 ml di acqua demineralizzata e con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. In un pallone in vetro da 250 ml corredato di asta agitatrice vengono sciolti 2 g di enzima lattasi (β−galattosidasi) Kerry Biolactase F CONC in 175 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5. La resina à ̈ stata unita alla soluzione enzimatica e mantenuta in lenta agitazione per 24 ore.
La resina à ̈ stata recuperata e lavata con 400 ml di aqua demineralizzata.
Dall’analisi delle proteine totali nel surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 2108 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 1632 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere del 22,6 %.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata verificata trasferendo 7,5 ml di resina derivatizzata in un reattore in vetro da 2,5 litri e unendola a 1,5 Kg di una soluzione acquosa di lattosio al 20 % (W/W) a pH 4,8 sotto agitazione ad una temperatura di circa 50°C. Durante la reazione di idrolisi sono stati prelevati campioni per l’analisi HPLC ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 19,0 - -24 ore 18,9 0,1 0,01
ESEMPIO 5
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi ) da Aspergillus orizae su resina stirenica ammina terziaria secondo metodo della presente invenzione scala industriale 1500 litri.
1500 litri di resina Amberlite<TM>Rhom and Haas FPA 51 sono stati lavati, in un reattore in acciaio da 10 m<3>provvisto di filtro a rete sulla valvola di fondo, tre volte con 3 aliquote da 1500 Kg ciascuna di acqua demineralizzata e una volta con 1500 Kg di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5. Al termine dei lavaggi le soluzioni sono state drenate lasciando depositare la resina umida sul fondo del reattore.
Alla resina sono stati aggiunti nuovamente 950 Kg di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5 e 105 Kg di una soluzione acquosa di glutaraldeide al 50% (W/W) mantenendo in lenta agitazione a 25 °C per 30 ore. Dall’analisi HPLC del surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 1,83 %
[Glutaraldeide finale] = 0,51 %
Dopo aver scaricato il surnatante di reazione, la resina à ̈ stata lavata tre volte con 3 aliquote da 1500 Kg ciascuna di acqua demineralizzata e una volta con 1500 Kg di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5. Alla resina sono stati aggiunti 4000 Kg di una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5 e 60 Kg di enzima lattasi (β−galattosidasi) Kerry Biolactase F CONC mantenendo in lenta agitazione a 25°C per 65h. Durante la reazione sono stati prelevati campioni di surnatante a vari tempi per la determinazione delle proteine totali mediante metodo Bio Rad ottenendo i seguenti risultati:
[Proteine totali inizio reazione] = 1053 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo 48 ore] = 11,1 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo 61 ore] = 10,3 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo 65 ore] = 11,1 Î1⁄4g/ml
Pertanto già dopo 48 ore la percentuale di proteine immobilizzate era superiore al 90%.
La resina à ̈ stata quindi lavata con 4000 kg di acqua demineralizzata e scaricata umida dal reattore.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata verificata trasferendo 20 ml di resina in un reattore in vetro da 1 litro e aggiungendo 500 ml di siero di latte bovino arricchito in lattosio fino ad una concentrazione del 20% (W/W) ad un pH di 4,9 e mantenendo in lenta agitazione per 45,5 ore. Durante la reazione di idrolisi sono stati prelevati campioni per l’analisi HPLC ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Partenza 17,9 - -4,5 ore 2,7 7,2 5,6
45 ore 0,2 9,2 9,0
ESEMPIO 6
Idrolisi di lattosio da acque madri di cristallizzazione ad alta conducibilità (con la resina dell’ESEMPIO 5).
L’enzima immobilizzato preparato come nell’esempio 5 e stato utilizzato per la reazione di idrolisi del lattosio contenuto in acque madri di cristallizzazione, del processo industriale di produzione del lattosio, ad alta salinità .
In un pallone in vetro da 250 ml provvisto di asta agitatrice sono stati introdotti 250 g di acque madri di cristallizzazione ad una conducibilità di 23,6 mS/cm (a 17,5 °C). La soluzione à ̈ stata portata a pH 5 e dopo averla scaldata alla temperatura di 50°C sono stati aggiunti 12,5 ml di resina derivatizzata come nell’esempio 4. La reazione à ̈ stata mentenuta in lenta agitazione a 50°C per 24 ore. L’analisi HPLC dei campioni prelevati all’inizio e alla fine della reazione di idrolisi ha mostrato i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Ac.Lattico % (W/W) Partenza 13,0 - 2,2 2,1
24 ore 0,7 6,8 8,9 2,2
La resina à ̈ stata poi recuperata e riutilizzata per una successiva reazione di idrolisi ottenendo i seguenti risultati:
Tempo Lattosio % (W/W) Glucosio % (W/W) Galattosio % (W/W) Ac.Lattico % (W/W) Partenza 13,0 - 2,2 2,1
24 ore 0,4 7,7 9,9 2,5
ESEMPIO 7
Immobilizzazione dell’enzima lattasi (β−galattosidasi ) da Bacillus circulans su resina stirenica ammina terziaria secondo metodo della presente invenzione su scala laboratorio.
134 g di resina a matrice polimerica stirene-divinil benzene funzionalizzata con gruppi amminici terziari Purolite<®>A 120 S sono stati lavati in un imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 400 ml di acqua demineralizzata e successivamente con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. Al termine dei lavaggi la resina à ̈ stata trasferita in un pallone in vetro da 500 ml provvisto di asta agitatrice e unita a 175 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 24 ore. Dall’analisi HPLC del surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 5,64 %
[Glutaraldeide finale] = 2,18 %
La resina à ̈ stata poi trasferita in un imbuto filtrante Gooch e lavata sotto vuoto con 400 ml di acqua demineralizzata e successivamente con 250 ml di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. 40 g di enzima lattasi (β−galattosidasi) da Bacillus Circulans Biolactasa NTL CONC Biocon sono stati diluiti a 700 ml con una soluzione di Na-acetato 100 mM a pH 5 e uniti alla resina in un pallone in vetro da 1000 ml provvisto di asta agitatrice e mantenuti in lenta agitazione per 72 ore a temperatura ambiente.
Dall’analisi delle proteine totali del surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 849 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 15,1 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere superiore al 90%.
La funzionalità della resina à ̈ stata valutata in una reazione di formazione di GOS (galatto-oligosaccaridi) a partire da siero di latte bovino arricchito in lattosio fino ad una concentrazione del 40% (W/W) a pH 5.
In un reattore in vetro da 1 litro sono stati introdotti 400 ml di siero arricchito e 16 ml di resina funzionalizzata. La reazione à ̈ stata mantenuta alla temperatura di 50°C in lenta agitazione per 48. Dall’analisi HPLC dei campioni prelevati durante la reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
Tempo Lattosio (area %)GOS (area %) Glucosio (area %) Galattosio (area %) Partenza 95 - - -19 ore 37,6 37,9 21,4 1,9
48 ore 28,8 44,3 22,8 3,4
ESEMPIO 8
Immobilizzazione dell’enzima L-arabinosio isomerasi su resina stirenica ammina terziaria secondo metodo della presente invenzione
2 litri di resina Amberlite<TM>Rhom and Haas FPA 51 sono stati lavati su imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 6 litri di acqua demineralizzata e successivamente con 2 litri di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente. La resina à ̈ stata trasferita in un pallone in vetro a quattro colli provvisto di asta agitatrice e unita a 4 litri di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 contenente il 5% di glutaraldeide e mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 72 ore. Dall’analisi HPLC del surnatante di reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
[Glutaraldeide iniziale] = 4,7 %
[Glutaraldeide finale] = 3,9 %
La resina à ̈ stata recuperata e lavata su imbuto filtrante Gooch sotto vuoto con 6 litri di acqua demineralizzata e successivamente con 2 litri di una soluzione acquosa di Na-acetato 100 mM a pH 5 a temperatura ambiente.
250 ml di una soluzione contenente 12700 ppm di enzima termostabile L-arabinosio isomerasi Nutrilab NV sono stati diluiti mediante aggiunta di 750 ml di tampone Na-fosfato 100 mM a pH 7 e uniti a 1 litro di resina attivata in un pallone in vetro da 3 litri corredato di asta agitatrice. La reazione à ̈ stata mantenuta in lenta agitazione a temperatura ambiente per 96 ore.
Dall’analisi delle proteine totali del surnatante di immobilizzazione secondo il metodo Bio-Rad sono stati osservati i seguenti risultati:
[Proteine totali prima dell’immobilizzazione] = 1349 Î1⁄4g/ml
[Proteine totali dopo l’immobilizzazione] = 96 Î1⁄4g/ml
Pertanto la percentuale di proteine immobilizzate sulla resina risulta essere superiore al 90%.
L’attività dell’enzima immobilizzato à ̈ stata valutata in una reazione di conversione del galattosio a tagatosio. A tale scopo, 60 ml di resina derivatizzata sono stati uniti a 150 g di una soluzione di galattosio al 35 % (W/W) a pH 7,3 contenente MnCl21 mM in un pallone in vetro a 4 colli corredato di asta agitatrice, di sistema pH-stat e immerso in un bagno di glicerina termostatato a 60°C. La reazione à ̈ stata mantenuta in lenta agitazione per 161 ore. Dall’analisi HPLC dei campioni prelevati durante la reazione sono stati osservati i seguenti risultati:
Tempo Tagatosio Galattosio
(area %TGT/ area %TGT+ area %GLT) (area %GLT/ area %TGT+ area %GLT) Partenza - 100
19 ore 7,8 92,2
40 ore 10,7 89,3
65,5 ore 13 87
88 ore 14,5 85,5
161 ore 18,4 81,6
ESEMPIO 9
Utilizzo in continuo dell’enzima Lattasi (β-galattosidasi) da Asperillus orizae immobilizzato su resina a matrice polimerica di stirene-divinil benzene derivatizzata con gruppi amminici terziari.
75 ml di enzima immobilizzato su resina a matrice polimerica di stirene-divinil benzene derivatizzata con gruppi amminici terziari Purolite A 120 S preparato come in esempio 1 sono stati impaccati in una colonna in vetro (à ̃ 25 mm) ed utilizzati per successive reazioni di idrolisi di lattosio in soluzione acquosa sia al 10% che al 20% (w/w). La soluzione di substrato à ̈ stata preparata in un reattore in vetro incamiciato e corredato di asta agitatrice portandola ad un pH di 4,7 e ad una temperatura di 50°C. La soluzione à ̈ stata caricata sulla colonna facendola fluire in continuo dal basso verso l’alto tramite una pompa peristaltica posizionata tra il reattore e la colonna. L’enzima immobilizzato à ̈ stato utilizzato per varie reazioni di idrolisi eseguite in un periodo di tempo di circa sei mesi al termine del quale non à ̈ stata osservata un’apprezzabile perdita di attività . Infatti, l’analisi HPLC di campioni istantanei prelevati in uscita dalla colonna dopo sei mesi dall’inizio dei cicli di reazione hanno mostrato una percentuale di idrolisi del lattosio > 90%.
ESEMPIO 10
Preparazione di tagatosio dalle acque madri di cristallizzazione del processo di produzione industriale del lattosio
450 g di soluzione ottenuta come in esempio 6 dall’idrolisi enzimatica di acque madri di cristallizzazione provenienti dal processo di produzione industriale del lattosio sono stati introdotti in un reattore in vetro incamiciato da 1 litro e portati ad una temperatura di 36 °C in agitazione e con insufflazione di aria. La soluzione à ̈ stata sottoposta ad un processo di deglucosazione mediante aggiunta di 0,6 g di lievito liofilizzato Saccharomyces Cerevisiae per panificazione. La reazione à ̈ stata mantenuta in lenta agitazione per 24 ore al termine delle quali à ̈ stato prelevato un campione per l’analisi HPLC che ha mostrato i seguenti risultati:
Lattosio % (w/w) Glucosio % (w/w) Galattosio % (w/w)
0,33 0,04 8,65
In 415 g della soluzione così deglucosata, contenenti 35,9 g di galattosio sono stati sospesi 20 g di calce ventilata Ca(OH)2e la reazione di epimerizzazione à ̈ stata mantenuta ad una temperatura compresa tra 10 e 25°C per circa 27 ore al termine delle quali à ̈ stata portata a pH 3,1 mediante l’aggiunta di Ac. Solforico al 50%.
Durante la reazione sono stati prelevati campioni per l’analisi HPLC che hanno mostrato i seguenti risultati:
Tempo Tagatosio % (w/w) Galattosio % (w/w)
3 ore 2,8 3,0
5 ore 4,3 2,0
27 ore 4,4 1,1
Sono stati ottenuti 470,8 g di soluzione con una conducibilità di circa 32 mS/cm contenente il 4,4 % (w/w) di tagatosio (HPLC).
ESEMPIO 11
Preparazione di tagatosio da permeato di siero di latte
In un pallone a quattro colli in vetro da 10 litri equipaggiato con asta agitatrice sono stati introdotti 8498 g di permeato di siero di latte con un contenuto di lattosio del 14,92 % (w/w). Dopo aver corretto il pH a circa 5 mediante l’aggiunta di NaOH al 30%, la temperatura à ̈ stata portata a 50°C e e sono stati introdotti nel reattore 100 ml di resina sulla quale à ̈ stato immobilizzato l'enzima lattasi (β- galattosidasi) da Aspergillus orizae Kerry Biolactase F Conc. come in esempio 1. La reazione di idrolisi del lattosio à ̈ stata mantenuta in lenta agitazione per circa 72 ore al termine delle quali à ̈ stato prelevato un campione per l’analisi HPLC che ha mostrato i seguenti risultati:
Lattosio % (w/w) Glucosio % (w/w) Galattosio % (w/w) 0,51 6,7 6,57
La soluzione idrolizzata à ̈ stata recuperata per semplice filtrazione.
1001,7 g di permeato di siero idrolizzato sono stati trasferiti in un reattore in vetro da 2 litri incamiciato e provvisto di agitazione meccanica. Mediante l’aggiunta di una soluzione di NaOH al 30% il pH à ̈ stato portato a 7,05 e la temperatura à ̈ stata regolata a 32°C. Sono stati introdotti nel reattore 5,01 g di lievito Saccharomyces Cerevisiae per panificazione fresco e la reazione à ̈ stata mantenuta in lenta agitazione sotto insufflazione d’aria per circa 24 ore al termine delle quali à ̈ stato verificato che il contenuto di glucosio fosse inferiore allo 0,1% (g/dl) mediante l’uso di strisce reattive colorimetriche Diabur-Test<®>Roche. Dopo aver abbassato la temperatura a 10°C, sono stati introdotti nel reattore circa 90 g di una sospensione acquosa di calce ventilata Ca(OH)2al 50%. Durante le reazione di epimerizzazione sono stati prelevati dei campioni a vari tempi per l’analisi HPLC che hanno mostrato i seguenti risultati:
Tempo Tagatosio % Galattosio % Galattosio % / Galattosio% Tagatosio %
(w/w) (w/w)
2 ore 3,68 1,06 0,22
3 ore 3,92 0,83 0,17
4 ore 3,89 0,63 0,13
5 ore 4,01 0,55 0,12
Dopo circa 17 ore la reazione à ̈ stata neutralizzata portandola a pH 6.03 mediante l’aggiunta di 247,4 g di Ac.solforico al 20% ed à ̈ stato prelevato un campione per l’analisi HPLC che ha mostrato i seguenti risultati: Tagatosio 3,1 % (w/w), Galattosio 0,4 % (w/w).
Degalattosazione finale opzionale
La temperatura del reattore à ̈ stata portata a 32°C ed il pH à ̈ stato corretto a 7,2 mediante l’aggiunta di ammoniaca tecnica. Sono stati introdotti nel reattore 1,1 g di lievito Saccharomyces Cerevisiae per panificazione fresco e la reazione di degalattosazione à ̈ stata mantenuta in agitazione con insufflazione di aria per 24 ore. L’analisi HPLC del campione iniziale e di quello prelevato a fine reazione a mostrato che il rapporto Galattosio % / Galattosio% Tagatosio % à ̈ passato da 0,11 a 0,03. Dopo allontanamento delle cellule per filtrazione sono stati ottenuti 1283 g di soluzione contenenti 38,2 g di tagatosio (HPLC). La soluzione , dopo deionizzazione su resine a scambio ionico, à ̈ stata concentrata e il tagatosio à ̈ stato cristallizzato direttamente da acqua.
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Un supporto polimerico a struttura di copolimero stirene-divinilbenzene attivato per trattamento con un composto di-aldeidico di formula OHC-(CH2)n-CHO in cui n à ̈ un numero intero compreso fra 1 e 10, dove detto supporto polimerico, in partenza, à ̈ non funzionalizzato oppure à ̈ funzionalizzato con gruppi amminici o ammonici esclusi i gruppi amminici primari, in cui fra detto copolimero e il composto di-aldeidico si à ̈ formato un legame covalente.
- 2. Supporto attivato secondo la rivendicazione 1 in cui n à ̈ compreso fra 2 e 4.
- 3. Supporto secondo la rivendicazione 2 in cui il composto di-aldeidico à ̈ glutaraldeide.
- 4. Supporto secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui il supporto polimerico di partenza à ̈ scelto nel gruppo consistente in PUROLITE<®>A100, PUROLITE<®>A100S, PUROLITE<®>A120 S, Rohm and Haas Amberlite<TM>IRA-94S, e la Rohm and Haas Amberlite<TM>FPA 51, Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX66 e Rohm and Haas Amberlite<TM>FPX68.
- 5. Un metodo per la preparazione di un supporto attivato secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4 in cui un supporto polimerico a struttura di copolimero stirene-divinilbenzene in partenza non funzionalizzato oppure funzionalizzato con gruppi amminici o ammonici, esclusi i gruppi amminici primari, viene trattato con un composto di-aldeidico di formula OHC-(CH2)n-CHO in cui n à ̈ un numero intero compreso fra 1 e 10.
- 6. Metodo secondo la rivendicazione precedente in cui il supporto polimerico di partenza à ̈ trattato con una soluzione di composto di-aldeidico al 1-50% in peso, tamponata ad un pH adeguato.
- 7. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 5-6 in cui il trattamento con la soluzione di composto di-aldeidico à ̈ condotto a 4-60°C per 2-120 ore mantenendo la miscela in lenta agitazione.
- 8. Uso di un supporto attivato secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4 per l’immobilizzazione di enzimi.
- 9. Un enzima immobilizzato su di un supporto attivato secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4.
- 10. Enzima immobilizzato secondo la rivendicazione 8 in cui l’enzima à ̈ scelto fra idrolasi o isomerasi.
- 11. Metodo per la preparazione di un enzima immobilizzato secondo una qualunque delle rivendicazioni 9-10 in cui una soluzione di enzima à ̈ aggiunta ad un supporto attivato secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 11 in cui una soluzione dell' enzima tamponata a pH 2-9 Ã ̈ aggiunta al supporto attivato e la miscela mantenuta in lenta agitazione ad una temperatura compresa tra 4 e 60°C per 6-240 ore.
- 13. Processo per la preparazione di tagatosio da lattosio detto metodo comprendente l’impiego di un enzima beta-galattosidasi immobilizzato secondo la rivendicazione 8.
- 14. Processo secondo la rivendicazione 13 comprendente i seguenti passaggi: a- idrolisi del lattosio con enzima immobilizzato beta-galattosidasi secondo la rivendicazione 8, per ottenere glucosio e galattosio; In cui detto lattosio à ̈ di preferenza quello contenuto in: - acque madri di cristallizzazione da processo di produzione industriale aventi una conducibilità di circa 24 mS/cm; - permeato di siero di latte con il 21-23 % di sostanza secca con il 18 % circa di lattosio e una conducibilità di circa 10 mS/cm. b- deglucosazione con lievito per panificazione; c- epimerizzazione del galattosio a tagatosio mediante calce ventilata.
- 15. Processo secondo la rivendicazione 14 comprendente anche il seguente passaggio d- degalattosazione finale con lievito per ottenere un prodotto privo di galattosio.
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