CN102286453A - 一种用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的方法 - Google Patents

一种用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的方法 Download PDF

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梁单琼
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张佳宁
时敏
陈晓慧
李志平
奚会松
宋云花
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Abstract

本发明提供一种以醋酸纤维素和聚丙烯膜为材料制备了醋酸纤维素/聚丙烯复合膜，采用吸附-交联相结合的固定化方法，用该复合膜来固定化磷脂酶。研究了吸附时间、酶液浓度、交联剂浓度、交联时间和交联温度等不同固定化条件对磷脂酶固定化效率和催化效果的影响，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。根据本发明中复合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产，最终得到的固定化酶活为4.6U/cm2。

Description

一种用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化磷脂酶的方法。
背景技术：
磷脂酶在磷脂改性、油脂精炼等方面有广泛应用，但游离磷脂酶A1价格昂贵，且不易回收，催化水解时条件苛刻；与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。当酶以游离的状态存在时，一些缺陷如稳定性差、使用寿命短等并未得到改善，将酶固定在分离膜上可以有效的避免上述不足。另外当酶以游离态存在时，由于酶膜表面的不利吸附造成酶的空间构型改变或活性位点遮蔽，而降低了酶的活性。现已建立的固定化方法一般可分为：包埋法、吸附法、交联法及共价偶联法等。
膜分离技术经过几十年的发展，它已广泛渗透到化工、冶金、环保、生物工程等领域。分离膜不仅能对气体、有机物、各类生物制剂等进行有效的分离、浓缩、纯化，而且还能作为固定化酶的载体，实现酶的膜固定化。固定化酶膜可将酶的催化特性和膜的分离、载体和分隔功能等结合起来，从而构成酶膜生物反应器，具有其他载体不可比拟的优点。现阶段酶膜的固定化主要集中在脂肪酶以及淀粉酶等的固定化上，关于磷脂酶膜的固定化研究较少。醋酸纤维素/聚丙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产。
发明内容
本发明是针对单膜法固定化磷脂酶效果不理想的问题，而提出的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜来进行固定化磷脂酶的方法。用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备。二、磷脂酶的固定化。三、酶活力的测定。四、固定化条件的优化。五、固定化酶酶学性质的讨论。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。
利用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶中，酸纤维素/聚丙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为4.6U/cm2。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是例证性的，并不对本发明的保护范围构成任何影响，本领域技术人员应该理解的是，根据本发明的精神所做的任何修改和替换均落入本发明的保护范围内。
具体实施方式一：用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶A1的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备：将5g醋酸纤维素溶于100mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取实验前制备好的聚丙烯膜浸于溶有醋酸纤维素的丙酮溶液中，自然成膜，以去离子水冲洗醋酸纤维素/聚丙烯复合膜数次干燥备用；二、磷脂酶的固定化：取若干份1cm2的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH＝5.0的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液，恒温搅拌吸附一定时间(25℃，160r/min)。再加入一定量戊二醛进行交联反应，反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定：一定量的底物无油磷脂溶于预定pH值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均匀。取4个100mL三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入1cm2的固定化酶膜，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应15min，然后于样品瓶中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。四、固定化条件的优化：吸附时间0.5～5.5h，酶液浓度0.02～0.07g/mL，戊二醛浓度0.1～0.6％，交联时间2～7h，交联温度1～11℃的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、固定化酶酶学性质的讨论：在温度40～70℃，pH4.5～7范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适pH值。并通过重复测定酶活来讨论固定化酶的使用稳定性。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间1.5～5.5h的条件下进行磷脂酶的吸附固定。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间，2.5～4.5h的条件下，酶液浓度0.03～0.07g/mL。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间，2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL的条件下，戊二醛浓度0.2～0.5％。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间，2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL，戊二醛浓度0.3～0.5％的条件下，与戊二醛交联3～6h。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间，2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL，戊二醛浓度0.3～0.5％，与戊二醛交联4～6h的条件下，交联温度3～11℃。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶与游离酶在温度45～60℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶与游离酶在PH5～6.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适pH值。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶重复使用7次酶活测定方法，得到固定化酶的相对酶活力为原酶活的61％。其它步骤与具体实施方式一相同。

Claims (9)

1.一种用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的方法，其特征在于用复合膜来固定化磷脂酶的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备：将5g醋酸纤维素溶于100mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取实验前制备好的聚丙烯膜浸于溶有醋酸纤维素的丙酮溶液中，自然成膜，以去离子水冲洗醋酸纤维素/聚丙烯复合膜数次干燥备用；二、磷脂酶的固定化：取若干份1cm2的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH＝5.0的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液，恒温搅拌吸附一定时间(25℃，160r/min)。再加入一定量戊二醛进行交联反应，反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定：一定量的底物无油磷脂溶于预定pH值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均匀。取4个100mL三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入1cm2的固定化酶膜，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应15min，然后于样品瓶中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。四、固定化条件的优化：吸附时间0.5～5.5h，酶液浓度0.02～0.07g/mL，戊二醛浓度0.1～0.6％，交联时间2～7h，交联温度1～11℃的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、固定化酶酶学性质的讨论：在温度40～70℃，pH4.5～7范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适pH值。并通过重复测定酶活来讨论固定化酶的使用稳定性。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶的优势。
2.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间1.5～5.5h的条件下进行磷脂酶的吸附固定。
3.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间，2.5～4.5h的条件下，酶液浓度0.03～0.07g/mL。
4.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL的条件下，戊二醛浓度0.2～0.5％。
5.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL，戊二醛浓度0.3～0.5％的条件下，与戊二醛交联3～6h。
6.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在吸附时间2.5～4.5h，酶液浓度0.04～0.07g/mL，戊二醛浓度0.3～0.5％，与戊二醛交联4～6h的条件下，交联温度3～11℃。
7.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤五中将固定化酶与游离酶在温度45～60℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。
8.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤五中固定化酶与游离酶在pH5～6.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适pH值。
9.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化磷脂酶，其特征在于步骤五中将固定化酶重复使用7次酶活测定方法，得到固定化酶的相对酶活力为原酶活的61％。
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