KR20150041627A - 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 상에 고정된 효소 및 산업적 제조에서 그의 용도 - Google Patents

스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 상에 고정된 효소 및 산업적 제조에서 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디-알데하이드 화합물 (예를 들어, 글루타르알데하이드)로 활성화된 매트릭스와 효소 사이에 안정한 결합을 생성시킴으로써, 3차 아민 기로 작용화되거나 또는 비작용화된 상업적 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 상의 산업적 규모의 효소 고정화 과정을 개시한다. 본 발명에 따라 고정된 효소는 갈락토오스 및 타가토오스의 산업적 제조에 특히 유용하다.

Description

스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 상에 고정된 효소 및 산업적 제조에서 그의 용도{ENZYMES IMMOBILISED ON STYRENE-DIVINYL BENZENE POLYMER MATRICES AND THE USE THEREOF IN INDUSTRIAL PRODUCTIONS}
본 발명은 중합체 매트릭스 상에 고정된 효소 분야에 관한 것으로서, 특히 글루타르알데하이드로 활성화된 매트릭스와 효소 사이에 안정한 결합을 생성시킴으로써, 3차 아민 기로 작용화되거나 또는 비작용화된 스티렌-디비닐 벤젠 매트릭스 상의 가수분해 효소의 고정화에 관한 것이다.
산업적 제조 과정에서 불용성 고체 지지체 상에 고정된 효소의 사용은 오래전부터 공지된 것이다. 고정된 효소 분자는 순차적 반응 순환에 재사용될 수 있어서, 생산 비용을 절감시키고, 효소 반응 생성물의 분리 작업을 간소화시킨다. 이를 위해, 특히 경제적인 불용성 지지체 및 간편하고 효율적인 고정화 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되었다.
가장 일반적인 고정화 기술은 4 가지 카테고리로 분류될 수 있다:
1) 지지체와 효소 사이에 약한 이온 결합 또는 반데르발스 결합의 형성에 의한 흡착 (adsorption);
2) 중합체 겔에서 효소 분자의 포획 (entrapment);
3) 다른 단백질 분자 간의 공유 결합의 형성에 의한 교차 결합; (상기 교차 결합은 일차 아민 기 무함유 중합체 매트릭스 상의 흡착 또는 중합체 겔 내의 포획 후, 효소 자체에서 수행될 수 있음);
4) 지지체와 효소 사이의 안정한 결합의 형성에 의한 공유 결합
흡착은 간편하고, 경제적인 방법이나, 효소 분자가 담체로부터 쉽게 탈착될 수 있다는 단점이 있고; 상기 탈착은 심지어 반응 조건상의 작은 변화, 예를 들어 지지체의 pH, 염도 또는 농도의 변화에 의해서도 야기될 수 있다. 또한 포획의 경우, 겔의 레티큘로부터 분리되는 효소로 인해, 활성의 손실이 나타날 수 있다. 이러한 단점은 다른 효소 분자 사이의 교차 결합 방식에 의해 부분적으로 제거되거나 또는 감소될 수 있으나, 이러한 기술은 모든 지지체 및 모든 효소에 적용될 수 없고, 유리 효소의 사용이라는 관점에서, 종종 상당한 활성 손실이 야기된다. 고체 불용성 매트릭스와의 공유 결합의 형성은 효소 고정화의 안정화를 위해 효과적인 방법이다. 그러나, 모든 담체가, 일반적으로, 고체 지지체와 링커 사이 및 링커와 효소 사이에 시프 염기 (Schiff base)를 형성시킬 수 있는 이가 (divalent) 링커 방식에 의한, 공유 결합의 형성에 적합한 작용기를 갖는 것은 아니다. 또한, 많은 경우, 담체 비용 또는 고정화의 복잡성으로 인해 이 방법은 유리 효소를 사용하는 경우에 비해 경제적으로 불리하다.
공유 결합 또는 교차 결합 방식에 의한 효소 고정화를 위해, 이중 기능 결합제, 예를 들어 글루타르알데하이드의 사용은 비교적 저렴하고, 매우 일반적인 방법이다 (David R. Walt, Venetka I. Agayn, The chemistry of enzyme and protein immobilization with glutaraldehyde , TrAC Trends in Analytical Chemistry , Volume 13, Issue 10, November - DECember 1994, pages 425-430, P. Monsan, Optimization of glutaraldehyde activation of a support for enzyme immobilization , Journal of MolECular Catalysis , volume 3, Issue 5, February 1978, pages 371-384,HeeJeongChae, Man-Jin In and Eui Yong Kim Optimization of protease immobilization by covalent binding using glutaraldehyde Applied Biochemistry and BiotEChnology Volume 73, Numbers 2-3 (1998), pages 195-204).
이러한 경우, 고정화는 기본적으로 두 가지 방식으로 수행할 수 있다:
1) 불용성 지지체 상에 임의의 일차 아민 기가 존재하는 경우, 일차 아민 기의 글루타르알데하이드 활성화 및 활성화된 매트릭스로의 효소의 추후 결합; 이 경우, 글루타르알데하이드의 알데하이드 기는 고체 지지체의 아민 기와 반응하여, 시프 염기를 형성하고, 그후 글루타르알데하이드의 다른 알데하이드 기가 효소 상의 일차 아민 기 (일반적으로 리신 잔기의 측쇄)와 결합한다.
2) 불용성 지지체 상에 일차 아민 기가 존재하지 않아, 글루타르알데하이드의 알데하이드 기와 지지체 사이에 시프 염기가 형성될 수 없는 경우, 지지체 상으로의 효소 분자의 흡착 또는 포획 및 글루타르알데하이드 교차 결합에 의한 추후 안정화; 이 경우, 효소 분자는 링커에 의한 결합 방식에 의해 내부적으로 연결되고, 이러한 교차 결합은 효소 활성 또는 수회의 순환 과정 동안의 재사용 가능성에 부정적인 영향을 줄 수 있다 (Lorena Betancor, et al, Glutaraldehyde in Protein Immobilization - A Versatile reagent - Methods in BiotEChnology TM , 1, Volume 22, Immobilization of Enzymes and Cells , pages 57-64, Bayraktar H,et al. Immobilization and stabilization of α- galactosidase on Sepabeads EC . EA and EC . HA ., Int J BiolMacromol 2011 Nov 1;49(4):855-60. Epub 2011 Aug 19).
따라서, 예를 들어 JP3015387에서, 담체 (에탄올아민에 의해 작용화된 폴리글리시딜 메타크릴레이트)의 일차 아민 기는 pH 8로 완충된 글루타르알데하이드 용액으로 활성화된 다음, 이러한 방식으로 제조된 지지체는 동일한 완충액에서 효소 함유 용액과 접촉된다.
CN101560511에서, 효소 프룩토실트랜스퍼라아제는 처음에, 이온 결합 방식에 의해 50 나노미터 이상의 기공 지지체 (macroporous support) 상에 흡착된 다음, 글루타르알데하이드 용액과의 교차 결합에 의해 안정화된다. 효소의 활성화는 81 %에 이를 수 있고, 대략 10 회 재활용될 수 있다.
글루타르알데하이드로의 고정화에 사용되는 일차 아민 기로 유도체화된 다양한 불용성 지지체에는 아크릴 매트릭스 중합체 수지 (예를 들어, 세파비드 ®EC.EA 레신디온 (Sepabeads®EC.EA Resindion), 세파비드®EC.HA 레신디온 (Sepabeads®EC.HA Resindion), 퓨로라이트®ECR8310F (PUROLITE®ECR8310F) 및 퓨로라이트®ECR8310F (PUROLITE®ECR8310F)), 스티렌-디비닐 벤젠 매트릭스 중합체 수지 (예를 들어, 퓨로라이트®A109 (PUROLITE®A109)) 및 다당류 매트릭스 수지 (예를 들어, EAH 세파로스TM 4B (EAH SepharoseTM 4B))가 포함된다. 이러한 지지체는 거의 배타적으로, 고정된 효소와 같은 특정 적용 (또한 일반적으로 실험실 규모)을 위해 상업적으로 구할 수 있는 것으로, 일반적으로 고비용 제조 과정의 결과물이다. 결과적으로, 이들 지지체는 매우 고비용으로서, 산업적 규모의 사용이 제한된다.
이러한 결과, 구입가능한 더욱 저렴한 수지 상에 고정된 효소에 대한 요구 및 안정한 결합 방식에 의해 더욱 저렴한 수지 상에의 효소 고정 방법에 대한 요구로 귀결된다. 저렴한 수지 중, 3차 아민으로 작용화된 것, 예를 들어, 퓨로라이트®A100 (PUROLITE®A100), 퓨로라이트®A100S (PUROLITE®A100S), 퓨로라이트®A120 S (PUROLITE®A120 S), 롬앤하스 앰버라이트TM IRA.94S (Rohm and Haas AmberliteTM IRA.94S), 및 롬앤하스 앰버라이트TM FPA 51 (Rohm and Haas AmberliteTM FPA 51) 및 비작용화된 것, 예를 들어 롬앤하스 앰버라이트TMFPX66 (Rohm and Haas AmberliteTMFPX66) 및 롬앤하스 앰버라이트TMFPX68 (Rohm and Haas AmberliteTMFPX68) - 대규모 적용, 예를 들어 탈염수 제조 또는 이온제거 저부가가치 용액 (low-added-value solution) 이온제거를 위한 것 -이 상업적으로 유용한 것이다.
비유도체화되거나 또는 3차 아민 기를 포함하는 상기 수지는 이론적으로 시프 염기를 형성할 수 없기 때문에, 이들은 글루타르알데하이드와 공유 결합을 형성하고, 일부 경우 흡착 및 그후 글루타르알데하이드와의 교차 결합에 의해, 효소 고정화에 사용될 수 없을 것으로 생각된다.
따라서, 일차 아민 기를 포함하지 않는 저렴한 중합체 매트릭스 상에 안정한 결합 방식으로의 효소 고정화 방법의 제공에 분명한 요구가 존재한다.
또한, 산업적 규모의 제조에 사용하기 위한 다수의 반응 순환 과정 동안, 스트레스가 큰 반응 조건, 예를 들어 고염도 또는 고온에서 효소 효율을 보호하기 위해, 안정한 결합 방식에 의해, 가능한 한 매우 저렴한 고체 지지체 상에 고정된 구입가능한 효소, 특히 가수분해 효소에 대한 요구가 존재한다.
놀랍게도, 이론적으로 시프 염기를 형성할 수 없는, 스티렌-디비닐 벤젠 공중합체에 기초한 비유도체화 중합체 수지가 이중 기능성 결합제, 특히 글루타르알데하이드와 반응하여, 공유 결합을 형성하고, 공유 결합 방식에 의한 효소 고정화에 특히 적합한 활성화 중간체로 귀결된다는 것이 발견되었다. 이러한 방식으로 고정된 효소는 심지어 장기간 동안 극한 온도 및 염도 조건에 유지되는 경우에도, 특히 안정하고, 매우 다수의 반응 순환 동안 촉매 효능을 유지한다.
본 발명은 활성화 전에, 일차 아민 기를 제외한 아민 또는 암모늄 기로 작용화되거나 또는 비작용화된, 글루타르알데하이드인 화학식 OHC.(CH2)n-CHO (n은 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 n은 2 내지 4이고, 더욱 바람직하게는 n은 3임)의 디알데하이드 화합물로의 처리에 의해 활성화된 스티렌-디비닐 벤젠 공중합체 구조를 갖는 중합체 지지체로서, 상기 공중합체와 디알데하이드 화합물 (예를 들어, 글루타르알데하이드) 사이에 공유 결합이 형성되는 것인 중합체 지지체에 관한 것이다.
본 발명에 따라 활성화된 지지체는 안정하고, 수개월 동안 저장될 수 있으며, 연속적 사용에도 반응성이 유지된다.
또한, 본 발명은 전술된 활성화 지지체의 제조 방법 및 지지체에 결합된 화학식 OHC.(CH2)n-CHO의 디알데하이드 화합물 (예를 들어, 글루타르알데하이드)의 알데하이드 기와 효소 사이에 공유 결합을 형성시킴에 의한, 효소 고정화에의 용도에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 또한 전술된 바와 같이, 활성화 지지체 상에의 효소 고정화 및 고정된 효소의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 저가의 상업용 수지, 예를 들어, 퓨로라이트®A100, 퓨로라이트®A100S, 퓨로라이트®A120 S, 롬앤하스 앰버라이트TM IRA.94S, 및 롬앤하스 앰버라이트TM FPA 51을 사용한 간편하고 효과적인 고정화 방법의 이점을 결합시킨다.
이러한 경우, 당업계에 공지된 것과는 반대로, 아민 기를 포함하지 않고, 이에 따라 (이론적으로) 글루타르알데하이드와 시프 염기를 화학적으로 형성하지 않는 3차 수지 상의 일차 아민 기로, 유도체화 수지를 활성화시키기 위해, 동일한 과정이 사용될 수 있으며, 놀랍게도, 두 경우 모두에서 비교할만한 결과가 초래된다. 따라서, 본 발명에서, 불용성 매트릭스의 특성이 특히 중요하고, 스티렌-디비닐 벤젠 중합체가 반드시 형성되어야 한다. 사실상, 동일한 과정을 3차 아민 수지에 적용한 경우에는 본 발명과 동일한 결과를 초래하지 않으나, 다른 매트릭스 (예를 들어, 폴리메타크릴)의 경우에는 그렇지 않다.
본 발명에 따라 고정된 효소는 2 개월 이상의 연속적 순환 작동 과정 동안 작동 온도 조건 및 극한 염도 조건 모두에서 활성화의 안정성 증가를 나타낸다.
본 발명에 따라 고정된 효소는 갈락토오스 및 타가토오스의 산업적 제조 과정에 특히 유용하다.
바람직하게, 본 발명에 다르면, 활성화 지지체 제조를 위한 개시 지지체는 퓨로라이트®A100, 퓨로라이트®A100S, 퓨로라이트®A120 S, 롬앤하스 앰버라이트TM IRA.94S, 롬앤하스 앰버라이트TM FPA 51, 롬앤하스 앰버라이트TMFPX66 및 롬앤하스 앰버라이트TMFPX68의 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, 본 발명에 따르면, 일반적으로 2 내지 9, 바람직하게는 5의 적절한 pH로 완충된 1-50 중량%, 더욱 바람직하게는 3-7 중량%의 디알데하이드 화합물 (바람직하게는 글루타르알데하이드)의 용액이 지지체 활성화에 사용된다.
디알데하이드 화합물 용액을 사용한 활성화 처리는 혼합물을 천천히 교반 유지하면서, 4 내지 60 ℃의 온도, 바람직하게는 실온 (20-30 ℃)에서, 2-120 시간 동안, 바람직하게는 18-36 시간 동안 수행된다.
이에 따라 수득된 활성화 수지는 그후 여과에 의해 분리하고, 물로 세척한 다음, 활성화에 사용된 것과 동일한 pH로 완충된 용액으로 세척한다.
활성화 수지는 공유 결합 (효소의 아민 기와 알데하이드 작용기 사이) 방식에 의해 효소 고정화에 사용될 수 있다.
효소 고정화에서, 평균 50-5000 ppm의 용액 중 총 단백질 농도로, pH 2-9 (효소에 의존적임)로 완충된 효소 용액을 제조하여, 전술된 바와 같이 활성화된 수지에 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 혼합물은 4 내지 60 ℃의 온도, 바람직하게는 20-30 ℃의 온도에서, 6-240 시간 동안 천천히 교반 유지한다. pH와 마찬가지로, 고정화 시간은 효소에 따라 다르다.
고정화가 이루어지면, 그후 여과에 의해 수지를 분리하고, 물로 세척한 다음, 완충액으로 세척한다.
이에 따라 수득된 고정된 효소는 최적의 작동 조건에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 임의의 효소가 고정될 수 있고, 효소는 바람직하게는 가수분해 효소 및 이성질화 효소, 이에 따라, 예를 들어 베타-갈락토시다아제, L-아라비노오스 이성질화 효소, α-푸코시다아제로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 고정된 효소 베타-갈락토시다아제는 결정화 모액 (mother liquors of crystallisation) 또는 유청막투과액 (whey permeate)에 포함된 락토오스로부터 타가토오스를 제조하기 위해 특히 유리하게 사용되었다.
특히, 본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 락토오스로부터 타가토오스를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다:
a. 전술된 바와 같이 고정된 베타-갈락토시다아제 효소로 락토오스를 가수분해시켜, 글루코오스 및 갈락토오스를 제공하는 단계로서,
여기서, 바람직하게는, 특히 적절하므로, 상기 락토오스가:
- 대략 24 mS/cm의 전도율을 갖는, 산업적 제조 과정으로부터의 결정화 모액;
대략 10 mS/cm의 전도율 및 대략 18 % 락토오스를 갖는 21-23 % 건조물을 포함하는 유청막투과액에 함유되어 있는 것인 단계;
b. 빵 효모로 탈글루코오스화 (deglucosation)하는 단계;
c. 공기 함유 석회 (aerated lime)에 의해 갈락토오스를 타가토오스로 에피머화 (epimerising)시키는 단계.
임의로, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
d. 효모로 최종 탈갈락토오스화 (degalactosation)하여, 갈락토오스-무함유 생성물을 수득하는 단계.
본 발명은 하기 실제 실시예의 견지에서 더욱 잘 이해될 것이다.
실험 부분
실시예 1
Aspergillus orizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 본 발명에 따른 3차 아민 스티렌- DVB 수지 상의 고정화 - 실험실 규모
3차 아민 기로 작용화된 AmberliteTMRhom and Haas FPA 51 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 62.5 ml를 실온에서 진공 하의 구치 필터 퍼넬에서 400 ml의 탈염수로 세척한 다음, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM의 수용액 250 ml로 세척하였다. 세척 후, 수지를 교반 바가 제공된 250 ml 유리 플라스크로 옮기고, 5 % 글루타르알데하이드를 포함하는 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 43 ml과 결합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지시켰다. 반응 상청액 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 5.95 %
[최종 글루타르알데하이드] = 3.22 %
이어서, 수지를 구치 필터 퍼넬로 옮기고, 실온에서 400 ml의 탈염수로 세척하고, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다.
교반바가 제공된 250 ml 유리 플라스크에 활성화된 여과 수지를 옮기고, 2 g의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) Kerry Biolactase F CONC를 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 175 ml 중에 용해시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지시켰다.
수지를 회수하여, 40 ml의 탈염수로 세척하였다.
Bio-Rad 방법에 의한 고정화 상청액 중 총 단백질 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 1650 μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 11 μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하는 것으로 나타났다.
10 ml의 유도체화 수지를 2.5 리터 유리 반응기로 옮기고, 50 ℃의 온도에서 천천히 교반하면서, pH 4.9의 20 % (W/W) 락토오스 수용액 2 kg과 결합시킴으로써 고정된 효소의 활성을 확인하였다. 가수분해 과정 동안, HPLC를 위해 샘플을 취하여, 하기 결과를 수득하였다:
Figure pct00001
실시예 2
Aspergillusorizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 비- 유도체화 스티렌- DVB 수지 상의 고정화
62 ml의 Rhom and Haas AmberliteTM FX 68 비-유도체화 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지를 진공 하의 실온의 구치 필터 퍼넬에서 400 ml의 탈염수로 세척한 다음, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다. 세척 후, 수지를 교반바가 제공된 250 ml 유리 플라스크로 옮기고, 5 % 글루타르알데하이드가 포함된 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 43 ml과 결합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다. 반응 상청액 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 4.35%
[최종 글루타르알데하이드] = 1.99 %
이어서, 수지를 구치 필터 퍼넬로 옮기고, 실온에서 400 ml의 탈염수로 세척하고, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다. 교반 바가 제공된 250 ml 유리 플라스크에 활성화된 여과 수지를 옮기고, 2 g의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) Kerry Biolactase F CONC를 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 175 ml 중에 용해시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다.
수지를 회수하여, 400 ml의 탈염수로 세척하였다.
고정화 상청액의 총 단백질의 Bio-Rad 방법에 의한 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 1298μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 69μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하는 것으로 나타났다.
25 ml를 pH 4.9의 20 % (W/W) 락토오스 용액 500 g을 포함하고, 50 ℃로 온도 조절된, 교반 바 장착 1 리터 유리 반응기로 옮겨서 상기 고정된 효소의 활성을 검증하였다.
가수분해 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 다양한 시간에 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00002
상기와 같이 제조된 것과 동일한 수지를 제2 가수분해 반응에 사용하였고, 하기 결과가 수득되었다:
Figure pct00003
실시예 3 - 비교예
Aspergillusorizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 일차 아민 스티렌 수지 상의 고정화
일차 아미노 기로 작용화된 퓨로라이트®A 109 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 13.4 Kg을 진공 하에 강철 필터로 도입시키고, 실온에서 각각 이소프로필 알코올 25 리터씩 2 분취량, 각각 탈염수 25 리터씩 3 분취량 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 25 리터로 세척하였다. 수지를 250 리터 강철 반응기로 옮기고, 5% 글루타르알데하이드가 함유된 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 70 리터와 결합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다. 반응 상청액의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 5.57%
[최종 글루타르알데하이드] = 3.35 %
이어서, 수지를 진공 하에 강철 필터로 옮기고, 탈염수 100 리터 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 25 리터로 세척하였다.
400 g의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) Kerry Biolactase F CONC를 250 리터 강철 반응기에서 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 60 리터에 용해시키고, 72 시간 동안 실온에서 천천히 교반하면서, 수지와 결합시켰다.
고정화 상청액의 총 단백질의 Bio-Rad 방법에 의한 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 1200 μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 10 μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하는 것으로 나타났다.
10 ml의 유도체화 수지를 2.5 리터 유리 반응기로 옮기고, 50 ℃의 온도에서 천천히 교반하면서, pH 4.8의 20 % (W/W) 락토오스 수용액 2 kg과 결합시킴으로써, 상기 고정된 효소의 활성을 검증하였다. 가수분해 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 다양한 시간에 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00004
실시예 4 - 비교예
Aspergillus orizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 비-스티렌 아민 수지 상의 고정화
33.5 g의 Rhom and Haas AmberliteTM FPA 55 아크릴 매트릭스 수지를 진공 하의 구치 필터 퍼넬에서 125 ml의 이소프로필 알코올, 400 ml의 탈염수로 세척하고, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml과 평형상태가 되게 하였다. 수지를 교반 바가 장착된 250 ml 유리 플라스크에서, 5 % 글루타르알데하이드가 함유된 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 175 ml과 결합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다.
이어서, 수지를 구치 필터 퍼넬로 옮기고, 실온에서 400 ml의 탈염수 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다. 2 g의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) Kerry Biolactase F CONC를 교반 바가 장착된 250 ml 유리 플라스크에서 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 175 ml 중에 용해시켰다. 수지를 효소 용액과 결합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다.
수지를 회수하여, 400 ml의 탈염수로 세척하였다.
고정화 상청액의 총 단백질의 Bio-Rad 방법에 의한 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 2108 μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 1632 μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 22.6 %를 초과하는 것으로 나타났다.
7.5 ml의 유도체화 수지를 2.5 리터 유리 반응기로 옮기고, pH 4.8의 락토오스 20 % (W/W) 수용액 1.5 kg과 결합시키고, 대략 50 ℃의 온도에서 교반함으로써, 상기 고정된 효소의 활성을 검증하였다. 가수분해 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00005
실시예 5
본 발명의 방법에 의한 3차 아민 스티렌 수지 상의 Aspergillus orizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 고정화, 1500 리터 산업 규모
1500 리터의 AmberliteTM Rhom and Haas FPA51 수지를 바닥 밸브 상에 메쉬 필터가 제공된 10 m3 강철 반응기에서, 각각 탈염수 1500kg씩 3 분취량으로 3 회 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 1500kg으로 1 회 세척하였다. 세척 후, 상기 용액을 배수시키고, 물기가 있는 수지를 반응기 바닥에 축적시켰다.
이어서, 수지에, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 950 kg 및 글루타르알데하이드 50 % (W/W) 수용액 105 kg을 첨가하고, 30 시간 동안 25 ℃에서 천천히 교반 유지하였다. 상기 반응물의 상청액의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 1.83%
[최종 글루타르알데하이드] = 0.51 %
반응물 상청액을 버린 후, 수지를 각각 탈염수 1500 kg씩 3 분취량으로 3 회 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 1500kg으로 1 회 세척하였다. 수지에 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액 4000 kg 및 60 kg의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) Kerry Biolactase F CONC를 첨가하고, 25 ℃에서 65 시간 동안 천천히 교반하였다. 반응 과정 동안, Bio Rad 방법에 의해 총 단백질을 측정하기 위해, 다양한 시간에 상청액 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
[반응 개시 시점의 총 단백질] = 1053μg/ml
[48 시간 후 총 단백질] = 11.1μg/ml
[61 시간 후 총 단백질] = 10.3 μg/ml
[65 시간 후 총 단백질] = 11.1 μg/ml
따라서, 48 시간 후, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하였다.
이어서, 수지를 4000 kg의 탈염수로 세척하고, 반응기로부터 수분을 제거하였다.
20 ml의 유도체화 수지를 1 리터 유리 반응기로 옮기고, pH 4.9, 20 % (W/W) 농도의 락토오스에 인리치드 우유청 (enriched bovine milk serum) 500 ml를 첨가하고, 45.5 시간 동안 천천히 교반하여, 상기 고정된 효소의 활성을 검증하였다. 가수분해 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00006

실시예 6
고 전도율의 결정화 모액으로부터의 락토오스의 가수분해 ( 실시예 5의 수지 사용)
고 염도에서, 락토오스의 산업적 제조 과정의 결정화 모액에 함유된 락토오스의 가수분해 과정을 위해, 실시예 5와 같이 제조한 고정된 효소를 사용하였다.
23.6 mS/cm의 전도율로 결정화 모액 250 g을 교반 바가 장착된 250 ml 유리 플라스크로 도입시켰다 (17.5 ℃). 상기 용액을 pH 5로 조정 하고, 50 ℃의 온도로 가열한 후, 실시예 4와 같이 유도체화된 수지 12.5 ml를 첨가하였다. 50 ℃에서 24 시간 동안 상기 반응물을 천천히 교반 유지하였다. 가수분해 반응 과정의 개시 시점 및 종결 시점에 취한 샘플의 HPLC 분석은 하기 결과를 제공하였다:
Figure pct00007

이어서, 수지를 회수하여, 차후 가수분해 반응에 재사용하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00008

실시예 7
Bacillus circulans 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 본 발명의 방법에 의한 3차 아민 스티렌 수지 상의 고정화
3차 아민 기로 작용화된 퓨로라이트®A 120 S 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 134 g을 진공 하의 실온의 구치 필터 퍼넬에서 400 ml의 탈염수로 세척한 다음, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다. 세척 후, 수지를 교반 바가 제공된 500 ml 유리 플라스크로 옮기고, 5 % 글루타르알데하이드가 함유된 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 175 ml와 혼합시키고, 24 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다. 반응 상청액 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 5.64 %
[최종 글루타르알데하이드] = 2.18 %
이어서, 수지를 구치 필터 퍼넬로 옮기고, 진공 하의, 실온에서 400 ml의 탈염수 및 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 250 ml로 세척하였다. Bacillus Circulans의 Biolactasa NTL CONC Biocon으로부터의 락타아제 효소 (β-갈락토시다아제) 40 g을 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 용액으로 700 ml로 희석하고, 교반 바가 제공된 1000 ml 유리 플라스크에서 수지와 혼합시키고, 실온에서 72 시간 동안 천천히 교반 유지하였다.
고정화 상청액의 총 단백질의 Bio-Rad 방법에 의한 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 849μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 15.1μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하는 것으로 나타났다.
GOS (갈락토올리고당) 생성 반응에서, pH 5, 40 % (W/W) 농도로 락토오스 중에 인리치드 우유청으로부터 상기 수지의 작용화를 평가하였다.
400 ml의 인리치드 세럼 (enriched serum) 및 16 ml의 작용화 수지를 1 리터 유리 반응기로 도입시켰다. 상기 반응물을 48 시간 동안 천천히 교반하면서, 50 ℃의 온도에서 유지시켰다. 반응 과정 동안 취한 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
Figure pct00009

실시예 8
본 발명의 방법에 의한 3차 아민 스티렌 수지 상의 효소 L- 아라비노즈 이성 질화 효소의 고정화
2 리터의 AmberliteTM Rhom and Haas FPA 51을 진공 하의 실온의 구치 필터 퍼넬에서 6 리터의 탈염수로 세척한 다음, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 2 리터로 세척하였다. 수지를 교반 바가 제공된 4-구 유리 플라스크로 옮기고, 5 % 글루타르알데하이드가 함유된 pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 4 리터와 혼합시키고, 실온에서 72 시간 동안 교반 유지하였다. 반응 상청액 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
[초기 글루타르알데하이드] = 4.7 %
[최종 글루타르알데하이드] = 3.9 %
이어서, 수지를 진공 하, 실온의 구치 필터 퍼넬에서 6 리터의 탈염수로 세척한 다음, pH 5의 아세트산 나트륨 100 mM 수용액 2 리터로 세척하였다.
열에 안정한 L-아라비노즈 이성질화 효소 Nutrilab NV 12700 ppm 함유 용액 250 ml를 pH 7의 인산 나트륨 완충액 100 mM 750 ml를 첨가함으로써 희석하고, 교반 바가 장착된 3 리터 유리 플라스크에서 활성화된 수지 1 리터와 혼합시켰다. 상기 반응물을 96 시간 동안 실온에서 천천히 교반 유지하였다.
고정화 상청액의 총 단백질의 Bio-Rad 방법에 의한 분석으로부터, 하기 결과가 수득되었다:
[고정화 전 총 단백질] = 1349μg/ml
[고정화 후 총 단백질] = 96μg/ml
따라서, 수지 상에 고정된 단백질의 백분율은 90 %를 초과하는 것으로 나타났다.
갈락토오스로부터 타가토오스로의 전환 반응에서 상기 고정된 효소의 활성을 평가하였다. 이를 위해, 유도체화 수지 60 ml를 pH-일정 시스템으로, 교반 바가 장착된 4-구 유리 플라스크에서, MnCl2 1mM이 함유된 pH 7.3의 35 % (W/W) 갈락토오스 용액 150 g과 결합시키고, 60 ℃로 온도 조절된 글리세린 욕조에 넣었다. 상기 반응물을 161 시간 동안 천천히 교반 유지하였다. 반응 과정 동안 취한 샘플의 HPLC 분석으로부터, 하기 결과가 관찰되었다:
Figure pct00010

실시예 9
3차 아민 기로 유도체화된 스티렌- 디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 상에 고정된 Aspergillus orizae 의 효소 락타아제 (β- 갈락토시다아제 )의 연속 사용
실시예 1과 같이 제조된, 3차 아미노 기로 유도체화된 퓨로라이트 A 120 S 스티렌-디비닐 벤젠 중합체 매트릭스 수지 상에 고정된 효소 75 ml를 유리 칼럼 (
Figure pct00011
25 mm)에 넣고, 10 % 및 20 % (W/W) 모두에서, 수용액 중 락토오스의 차후 가수분해 반응을 위해 사용하였다. 교반 바가 장착된 재킷 유리 반응기에서 기질 용액을 제조하고, 50 ℃의 온도, pH 4.7로 조정하였다. 상기 용액을 상기 칼럼 상에 부하하고, 칼럼과 반응기 사이에 위치한 연동 펌프에 의해 바닥으로부터 위쪽으로 연속적으로 흐르도록 하였다. 상기 고정된 효소를, 측정 가능한 활성 손실이 관찰되지 않는 종결 시점에서, 대략 6 개월의 기간 동안 수행된 다양한 가수분해 반응에 사용하였다. 사실, 반응 순환의 개시 시점으로부터 6 개월 후 칼럼 유출시 취한 즉석 샘플의 HPLC 분석은 락토오스 가수분해의 백분율 > 90%를 나타내었다.
실시예 10
락토오스의 산업적 제조 과정의 결정화 모액으로부터의 타가토오스의 제조
락토오스의 산업적 제조 과정으로부터의 결정화 모액의 효소 가수분해에 의해 실시예 6과 같이 수득된 용액 450 g을 재킷 1 리터 유리 반응기로 도입시키고, 교반하고, 공기를 통기시키면서, 온도를 36 ℃로 조정 하였다. 상기 용액을 동결 건조된 빵 효모 Saccharomyces cerevisiae 0.6 g 첨가에 의한 탈글루코오스 과정에 적용시켰다. 상기 반응물을 24 시간 동안 천천히 교반 유지하고, 종결 시점에 HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00012
35.9 g의 갈락토오스가 함유된, 이러한 방식으로 탈글루코오스화된 용액 415 g에, 공기 함유 석회 Ca(OH)2 20 g을 현탁시키고, 에피머화 반응을 대략 27 시간 동안 10 내지 25 ℃의 온도에서 유지하고, 그 종결 시점에 50 % 황산을 첨가하여, pH를 3.1로 조정하였다. 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00013

타가토오스 (HPLC) 4.4 % (W/W)가 함유되고, 대략 32 mS/cm의 전도율을 갖는 용액 470.8 g이 수득되었다.
실시예 11
유청막 투과액으로부터의 타가토오스의 제조
교반 바가 장착된 4-구 10 리터 유리 플라스크에, 락토오스 14.92% (W/W)가 포함된 유청막투과액 8498 g을 도입시켰다. 30 % NaOH를 첨가하여, pH를 대략 5로 맞춘 다음, 온도를 50 ℃로 조정 하고, Aspergillusoryzae의 Kerry Biolactase F CONC Conchad로부터의 효소 락타아제 (β-갈락토시다아제)가 실시예 1과 같이 고정된 수지 100 ml를 반응기에 도입시켰다. 락토오스의 가수분해 과정을 대략 72 시간 동안 천천히 교반 유지하였고, 그 종결 시점에 HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00014

가수분해된 용액을 단순 여과에 의해 회수하였다.
가수분해된 유청막투과액 1001.7 g을 기계적 교반이 제공된 2 리터 재킷 유리 반응기로 옮겼다. 30% NaOH 용액을 첨가하여, pH를 7.05로 조정하고, 온도를 32 ℃로 조정하였다. 5.01 g의 신선한 빵 효모 Saccharomyces cerevisiae를 반응기에 도입시키고, 상기 반응물을 대략 24 시간 동안 공기를 통기시키면서, 천천히 교반 유지하였고, 그후 비색 시험 스트립 Diabur-Test®Roche (colorimetric test strips Diabur-Test®Roche)를 이용하여 글루코오스 함량이 0.1 % (g/dl) 미만인 것을 확인하였다. 온도를 10 ℃로 낮춘 후, 50 % 공기 함유 석회 Ca(OH)2의 수성 현탁액의 대략 90 g을 반응기에 도입시켰다. 에피머화 반응 과정 동안, HPLC 분석을 위해 다양한 시간에 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다:
Figure pct00015

대략 17 시간 이후, 20 % 황산 247.4 g을 첨가함으로써, 상기 반응물을 중화시켜, pH 6.3으로 조정하고, HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였고, 하기 결과가 제공되었다: 타가토오스 3.1% (W/W), 갈락토오스 0.4 % (W/W).
임의의 최종 탈갈락토오스화
반응 온도를 32 ℃로 조정하고, 공업 암모니아 (tEChnical ammonia)를 첨가하여, pH를 7.2로 조정하였다. 1.1 g의 신선한 빵 효모 Saccharomyces cerevisiae를 반응기에 도입시키고, 탈갈락토오스 반응을 24 시간 동안 공기를 통기시키면서 교반 유지하였다. 초기 샘플 및 반응 종결 시점에 취한 샘플의 HPLC 분석은 갈락토오스 % / 갈락토오스% + 타가토오스 % 비율이 0.11에서 0.03으로 변경되었음을 나타내었다. 여과에 의한 세포 제거 후, 38.2 g의 타가토오스 (HPLC)가 함유된 용액 1283 g이 수득되었다. 이온 교환 수지 상의 비이온화 후, 상기 용액을 농축시키고, 타가토오스를 물로부터 직접 결정화하였다.

Claims (15)

  1. 화학식 OHC.(CH2)n-CHO (n은 1 내지 10의 정수임)의 디-알데하이드 화합물 처리에 의해 활성화된 스티렌-디비닐 벤젠 공중합체 구조를 갖는 중합체 지지체로서, 상기 중합체 지지체는 개시 시점에 일차 아민 기를 제외한 아민 또는 암모늄 기로 작용화되거나 또는 비작용화되고, 상기 공중합체와 디-알데하이드 화합물 사이에 공유 결합이 형성되는 것인 중합체 지지체.
  2. 제1항에 있어서, n이 2 내지 4인, 활성화된 지지체.
  3. 제2항에 있어서, 디-알데하이드 화합물이 글루타르알데하이드인, 지지체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 중합체 지지체가 퓨로라이트®A100 (PUROLITE®A100), 퓨로라이트®A100S (PUROLITE®A100S), 퓨로라이트®A120 S (PUROLITE®A120 S), 롬앤하스 앰버라이트TM IRA.94S (Rohm and Haas AmberliteTM IRA.94S), 롬앤하스 앰버라이트TM FPA 51 (Rohm and Haas AmberliteTM FPA 51), 롬앤하스 앰버라이트TMFPX66 (Rohm and Haas AmberliteTMFPX66) 및 롬앤하스 앰버라이트TMFPX68 (Rohm and Haas AmberliteTMFPX68)의 그룹으로부터 선택되는 것인, 지지체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성화된 지지체의 제조 방법으로서, 스티렌-디비닐 벤젠 공중합체 구조를 갖는 중합체 지지체가 개시 시점에 일차 아민 기를 제외한 아민 또는 암모늄 기로 작용화되거나 또는 비작용화되고, 화학식 OHC.(CH2)n-CHO (n은 1 내지 10의 정수임)의 디-알데하이드 화합물로 처리되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 중합체 지지체가 적절한 pH로 완충된 1-50 중량%의 디-알데하이드 화합물 용액으로 처리되는 것인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 디-알데하이드 화합물 용액으로의 처리가 상기 혼합물을 천천히 교반 유지하면서, 4-60 ℃에서 2-120 시간 동안 수행되는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성화된 지지체의 효소 고정화를 위한 용도.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성화된 지지체 상에 고정된 효소.
  10. 제8항에 있어서, 상기 효소가 가수분해 효소 또는 이성질화 효소로부터 선택되는 것인, 고정된 효소.
  11. 제9항 또는 제10항에 따라 고정된 효소의 제조 방법으로서, 효소 용액이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성화된 지지체에 첨가되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, pH 2-9로 완충된 효소 용액이 상기 활성화된 지지체에 첨가되고, 상기 혼합물이 4 내지 60 ℃의 온도에서 6-240 시간 동안 천천히 교반 유지되는 것인, 방법.
  13. 제8항에 따라 고정된 베타-갈락토시다아제 효소의 사용을 포함하는 락토오스로부터의 타가토오스의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    a. 제8항에 따라 고정된 베타-갈락토시다아제 효소로 락토오스를 가수분해시켜, 글루코오스 및 갈락토오스를 제공하는 단계로서,
    여기서, 상기 락토오스가 바람직하게는:
    - 대략 24 mS/cm의 전도율을 갖는, 산업적 제조 과정으로부터의 결정화 모액 (mother liquor);
    대략 10 mS/cm의 전도율 및 대략 18 % 락토오스를 갖는 21-23 % 건조물을 포함하는 유청막투과액 (whey permeate)에 함유되어 있는 단계;
    b. 빵 효모로 탈글루코오스화 (deglucosation)하는 단계;
    c. 공기 함유 석회 (aerated lime)에 의해 갈락토오스를 타가토오스로 에피머화 (epimerising)시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    d. 효모로 최종 탈갈락토오스화 (degalactosation)하여, 갈락토오스-무함유 생성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.









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