JPS5920357B2 - 脂質の酵素分解法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は、マクロポーラスな多孔性の疎水性担体１こリ
パーゼを結合させた固定化リパーゼを用いて脂質を分解
するにあたり、リパーゼの基質である脂質濃度を５０〜
９４係の範囲内で分解することを特徴とする脂質の酸素
分解法に関するものである。

従来、リパーゼを水１こ不溶性の担体１こ結合させて固
定化リパーゼとして反応する試みは多くの報告がある。

すなわち、ＨａｎｓＢＲＡＮＤＥＮＢＥＲＧＥＲがポリ
スチレン系のイオン交換樹脂（彼の用いたイオン交換樹
脂は無機イオンが１個か２個人る網目構造を有していた
であろう）１こリパーゼを共有結合で固定化することを
報告して以来（Ｒｅｖ。

Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｉｎｄ、Ａ１ ｉｍｅｎｔ、１１．２
３７（１９５６））、ポリスチレン、シリコーン、エチ
ルセルロースな。

どの高分子でリパーゼを包括固定化したマイクロカプセ
ル（北島昌夫、宮野静夫、近藤朝士、工業化学雑誌７２
巻、２号（１９６９）４９３ページ）あるいは、リパー
ゼをスペーサーを介して親水性の疎の構造を有する（マ
イクロポーラスな）アガロースゲル１こ結合させるもの
（Ａ、ＫＩＬＡＲＡ、−に、Ｍ、５ＨＡＨＡＮＩ ａｎ
ｄ Ｆ 、Ｗ、ＷＡＧＮＥＲ，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏ
］ 、Ｂｉｏｅｎｇ、 １９．１７０３（１９７７）な
ど、リパーゼの固定化法１こ関する研究は数多くある。

また、固定化リパーゼを実際の工業的な脂質の加水分解
１こ応用し、分解産物を得ようとする試みとしては、ポ
リアクリドアミドゲル１こリパーゼを包括固定化して、
脂肪酸製造１こ応用しようとするものがある。

（特開昭５Ｏ−１２９７８９）この技術は、包括固定化
であるため脂質の加水分解のように、水と油の２層系で
反応するもの１こ関しては、最適な反応条件と言えず、
そのため脂質の分解率も上昇せず、反応ｊ延中の脂質濃
度も５係程度であったので、工業的な脂肪酸製造には実
施できるような加水分解法ではなかった。

また、親水性のゲルにＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍ１ｎ
ｕｔａという菌体を包括固定化し、水飽和のへブタン中
でｄｉ−メチル・サクシネイトを加水分解してｌ−メン
トールを得ようとする試みがある。

（Ｔｅｔｓｕｏ Ｏｍａｔａ。Ｎｏｒｉｔａｄａ Ｉｗ
ａｍｏｔｏ、Ｔｏｍｉｏ Ｋｉｍｕｒａ、Ａｔ５ｕ。

Ｔａｎａｋａ ａｎｄ ５ａｂｕｒｏ Ｆｕｋｕｉ（１
９８１） Ｅｕｒ。

Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ １１：１９９−２０４）この技術は、有１双溶
媒中１こ水不溶性の基質と水を溶解して均一層１こして
反応するものであって、２層系での反応の欠点は取り除
かれているが、均一層にするためには、基質濃度を上げ
るにも限界があり、大量の脂質の加水分解１こは利用出
来ないものである。

本発明者らは、大量の脂質の加水分解法ｔこついて鋭意
研究を取ねた結果、マクロポーラスな多孔性の疎水性担
体に結合させた固定化リパーゼを用いると、マクロポー
ラス担体の細孔表面が疎水性であるため、基質である脂
質は細孔付近の疎水環境１こ引きよせられ、基質に対す
る親和性が増すのに対し、生産物阻害を起す親水性の生
差物は細孔表面に結合したリパーゼ分子近傍に近寄り堆
くなったため、リパーゼの基質である脂質濃度を５０〜
９０％の範囲１こしても、以外にも生産物阻害があまり
起らず高い最終分解率を示す現象を見い出しこの知見１
こ基づいて本発明をなす１こ至った。

本発明１こ用いるリパーゼとしては、特１こ起源は選ば
ないが、脂質１こ対する親和性が良くて反応の立ち上が
り方が早く、脂質を高分解率にまで分解する酸素が良い
。

牛脂などの高融点の油脂を分解する場合、４５°Ｃ以上
で反応する耐熱ｆ’ｔｌＪパーゼを利用することが望ま
しい。

本発明に用いるリパーゼ固定化法としては、担体結合法
である。

実施例１で示す如く、従来用いられていた包括法（モノ
マー１こ神経毒のあるアクリルアミドでないものを使用
した）と比較して、リパーゼと基質の間１こ高分子膜が
存在しないのでオイルエマルジョンがリパーゼと接触し
やすく効率のよい反応が行なわれる。

本発明に用いる担体は、マクロポーラスな、多孔性担体
で、細孔表面が疎水性であることが不可欠であり、その
平均細孔半径はＩＯＡ〜１００ＯＡのものが用いられる
。

平均細孔半径が１０Ａ以下のものは、通常のリパーゼ分
子の半径がＩＯＡ以上なので、多孔性担体の細孔内１こ
侵入出来ず、リパーゼの結合する面積が広くとれないた
め活性の高い固定化リパーゼは得られない。

また１０００Å以上の細孔が多く存在しても、リパーゼ
の結合する細孔表面積が減少するので、活性の高いリパ
ーゼは得られない。

マクロポーラスな多孔性の担体とは担体粒子−個あたり
のリパーゼ結合面積が多くなるようなものであれば、孔
の形状は縦長で細孔半径が求められないようなものでも
、いずれのものを用いてもかまわない。

従来、担体の表面積を多くするためには、微細な粒子が
用いられていた。

しかし、微細な粒子はカラムなどにつめると目づまりが
起る。

本発明で用いるマクロポーラス担体は、担体自身は大き
い粒子が使え、しかもリパーゼが結合する細孔表面積が
広いので、目づまりのない活性の高い固定化リパーゼが
得られることになる。

本発明に用いられるマクロポーラスを持つ多孔性の疎水
性担体としては、マクロポーラスなイオン交換樹脂、吸
着樹脂、キレート樹脂などスチレンやアルキルアミン等
の重合体を母体とするものの他、ポーラスガラス、ポー
ラスセラミック、セライト、多孔性金属粒子、親水基を
マスクしたセルロースなどの担体などが用いられる。

実施例２で示した如く、マクロポーラスな担体の細孔表
面の疎水回度（ハイドロフオビシテイ）が増す１こ従っ
て、基質濃度を高くしても、高い分解率が得られること
になる。

疎水回度は、水和囲のない非極囲のアルキル基やフェニ
ル基を多くすると増加する。

また、水酸基などの水和性の親水基をアルキル基等で修
飾してやること１こよっても増加する。

本発明の疎水性担体とは、細孔表面の疎水回度（ハイド
ロフオビシテイ）が高い担体のことを言うのであって、
細孔表面１こ疎水基が比較的多く存在すれば疎水性担体
といえる。

本発明１こ用いる担体にリパーゼを結合させる方法には
、疎水性担体１こリパーゼを直接吸着させる方法、担体
とイオン結合させる方法、あるいは担体と共有結合させ
る方法等、いずれのものを用いても差し支えない。

本発明の脂質の酸素分解１こおける反応条件のｐＨや温
度について固定化されたリパーゼの反応（こ最適なｐＨ
や温度付近が用いられる。

最適のｐＨや温度でなくても目的の分解率が得られるな
らばそれを用いても差し支えない。

また、必要ならば金属イオンや血清アルブミン等を加え
てもなんら差し支えない。

本発明に用いる脂質としては、リパーゼの基質になる各
種のグリセリドやエステルなどがあげられる。

リパーゼ゛が作用するものであれば、いずれのものを用
いても差し支えない。

本発明１こ用いる反応液中のリパーゼの基質濃度は５０
〜９４％が選ばれる。

実施例３に示す如く、５０％以下の水分濃度にしても、
最終分解率は上がらず、反応槽の規模を小さくしたり、
反応後水層に得られるグリセリンの回収のエネルギーを
小さくするためには、この濃度以上で反応させる方が有
利である。

また、加水分解反応の化学量論的な水分含量であるトリ
グリセライド１分子１こ対して水３分子の基質濃度であ
る９４％程度になっても高い分解率を達成することが出
来る。

本発明に用いる反応槽としては、固定化リパーゼと反応
液とを混ぜて混合するバッチ式のものと、固定化リパー
ゼをカラムにつめた連続式のものとが考えられる。

バッチ式、カラム式ともに、固定化リパーゼの回収が容
易で、生産物の精製段階でのリパーゼ蛋白の除去の必要
がなく、回収した酵素を反復使用出来る利点を有する。

カラム式は更１ど反応中空気に接触することが少ないの
で不飽和脂肪酸が空気酸叱されないことや、連続化が可
能であるので現在性なわれている高圧連続分解工程１こ
組み込み易いなどの利点がある。

工業的に脂質を加水分解して、脂肪酸やグリセリンを得
るためｌこは、少なくても９０係以上の高分解率を達成
するとともに、反応液中の水分含量は出来るだけ少ない
量が望ましい。

従来、固定化酵素を用いる反応では分解率は８０係程度
しかなく、しかも反応液中の水分含量も多かった（特開
昭５Ｏ−１２９７８９）のに、本発明によって初めて、
反応液中の水分含量を著しく少なくしても、油脂を高分
解率）こまで分解することが出来るよう１こなった。

そのため反応後、水層１こ得られるグリセリンを蒸留し
て回収するエネルギーを少なくする他、反応槽の規模を
少さくし、しかも分解率が高いので、脂肪酸やグリセリ
ンの収量を上げる効果もあり、またマクロポーラスな多
孔性担体を用いるのでカラムで連続分解するときの目づ
まりが少ない等の効果もあり工業的な油脂の酵素分解法
として優れた方法である。

次に実施例１こよって本発明をさら１こ詳細に説明する
。

実施例 ｌ ポーラスグラス（ＧＰＧＯＯ５００，平均用孔半径２５
７．５Ａ１粒子サイズ１２０−２００メッシュエレクト
ロヌクレオニクス社製）を５００°Ｃで２時間活性化後
、アセトン中Ｉこ２係のシランカップリング剤（ガンマ
−アミノプロピルトリエトキシシラン）の溶液中に入れ
、逆流冷却管をつけて５０°Ｃで２０時間おくと、疎水
性のシランカップリング剤の結合したシラン化グラスが
出来る。

シラン化グラスを１％のゲルタールアルデヒド中で４℃
、一晩反応させ、シランカップリング剤の疎水基の一部
に存在するアミノ基とゲルタールアルデヒドが結合した
アルデヒド化グラスを作った。

アルデヒド化グラスは、りん酸緩衝液でよく洗浄した後
、りん酸緩衝液中で、１５００単位のリパーゼと４℃で
一晩反応させた。

反応後、水と緩衝液とでよく洗浄して、ポーラスグラス
の表面に疎水性のシランカップリング剤を介してリパー
ゼを結合させたポーラスグラス固定化リパーゼを得た。

セライト粉末（Ｅ過速度を早くするように調製された多
孔性担俸、平均粒径２５ミクロン）のものを上述と同様
な措置を施し、セライト１こ固定化したリパーゼを得た
。

ｏ、９％の食塩水中に懸濁させた５％カラギーナン０．
７ｍｌ、 Ｏ，１ｇのバイフロスーパセル及び０．２
１ｒＬｌ燐酸緩衝液中Ｉ（溶かした１５００単位のリパ
ーゼを４５℃中で維持し、ガラス棒で撹拌しながらカラ
ギーナンのゲル中１こりパーゼを包括させる。

５℃に一夜放置し、ゲルを固定化させ、遠心分離してゲ
ルを集め、２係の塩化カリウム溶液中で、更に一夜放置
し、ゲル 強化する。

２係の塩化カリウム溶液で洗浄後、２ｍｌの塩化カリウ
ム溶液、８０ ｌｔ ｌの２５係ゲルタールアルデヒド
溶液を加え、１Ｏ０Ｃで１０分間振盪し、更にゲルを強
固にする。

２０係の亜硫酸水素ナトリウム溶液を０．２ＴＩＬｌ加
え、余分のゲルタールアルデルヒトを除いた後、水及び
緩衝液で洗浄して、カラギーナンで包括したリパーゼを
得た。

なお、リパーゼｇｈは山田らの報告しているＮｏｒｄら
の変法（山田浩−１太田安英、町田情夫、日豊化３６巻
８６０（１９６２））によって行い、６０℃でｐＨ７，
０１分間に１マイクロ当量の酸を遊離する酵素量を１単
位とした。

リパーゼ標品はｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃ−ｅｎｓ ｂｉｏｔｙｐｅ １−．４６１０
２１ （徴工研菌寄５４９５号）の生産するリパーゼを
硫安塩析、透析、クロロホルム１こよる脱脂等を行った
後、凍結乾燥したものを用いた。

１００ｍ１の三角フラスコ１こ、牛脂と０．１ Ｍリン
酸緩衝液ｐ Ｈ７，０とで、各種の基質濃度の反応液を
つくり、良く水分を除いた固定化リパーゼを加え、６０
°Ｃで毎分１７８回振盪しながら１８０時間反応させた
後の分解率を酸化価とケン化価との比から求めた。

第１表に示した数字は、反応時間１８０時間後、の分解
率であるが、反応時間１２０時間以後はなんら変化なか
ったので、最終分解率と考えられる。

包括固定化したものは、基質濃度５０％以上になると著
しく最終分解率が減少する。

実施例 ２ １ｇのダウエックスＭＷＡ−１（平均細孔半径１５０人
粒子サイズ２０−５０メツシユのポリスチレン鎖をジビ
ニルベンゼンで架橋した母体を持つ第三級アミンを交換
基とする弱塩基性陰イオン交換樹脂、ダウ・ケミカル社
製）を蒸留水及びＭ／１５のマツクルベイン緩衝液ｐ
Ｈ５，０で焼津後、０．２ ｍｌのリパーゼ液（１５０
０単位）、０３８ｍ１の同様のマツクルベイン緩衝液を
加え、８℃で一夜振盪した。

次にＬｍｌのマツクルベイン緩衝液、８０ Ｉｔ ７３
の２５％ゲルタールアルデルヒト溶液を加え、８°Ｃで
１０分間振盪し、マクロポーラスなイオン交換樹脂１こ
結合させる。

最後に２０％の亜硫酸水素すＩ−ＩＪウムを０．２ ｍ
ｌ加え８℃で１０分間振盪し、余分のゲルタールアルデ
ハイドを除いた後、水や緩衝液で良く洗浄してダウエッ
クス固定化リパーゼを得た。

６９．７ｇのセルロファインＧＣ−７００（分子量ｌＯ
万から４０万までの蛋白のゲル濾過に使用されるような
マクロポーラスなセルロース担体、粒径４５−１０５μ
ｍ、チッソ昧式会社製）を２０ｒｒＬｌの１規定水酸化
ナトリウム溶液、１１ｍ１のエピクロルヒドリンを加え
て、３０℃で４時間振盪しながら反応し、細孔表面に存
在する親水性の水酸基をエポキシ化した。

５００ｍ１の蒸留水で洗浄したエポキシ化セルロファイ
ンを６．３ｍｌのエチレンジアミン、ｌ規定水酸化ナト
リウム液１１ｒＬｌとともに、６０℃で２．５時間反応
し、水で洗浄した。

吸引濾過して集めたエチレンジアミンセルロファイン１
ｇ、０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，ｏ ＬＯｍｌ。

２５％ゲルタールアルデヒド溶液１７ｒＬｌを加え室温
で一夜振盪し、アルデヒド化セルロファインを得た。

アルデヒド化セルロファインとリパーゼ（１５００単位
）を燐酸緩衝液中で一夜反応し、セルロファイン固定化
リパーゼを得た。

ダウエックス固定化リパーゼ及びスルロファイン固定化
リパーゼを実施例１と同様１こ、牛脂と反応させて最終
分解率を比較した。

アガ爾−ス固定化リパーゼは、エポキシアクティベイテ
ッドセファロース６Ｂ（ファルマシア社製）を用いて固
定化したものを比較として示した。

これは、親水性の疎の構造を有する（マクロポーラスな
）アガロースに、親水性のスペーサーを介してリパーゼ
を結合したもの。

可溶性リパーゼは、通常の固定化操作１こよっての活性
収率は良くても３０〜４０係であるので、調製に使用し
た可溶ＩＥ ＩＪパーゼの１／３を対照として用いた。

第２表ｔこ示す如く、担体１こ結合したリパーゼによる
最終分解率は、担体１こ存在する疎水性残基が、多い方
が、最終分解率が上昇することが解る。

また、疎水性担体に固定化したリパーゼは、以外１こも
、担体１こよる立体障害等が考えられない可溶性酵素を
使用した場合よりも、最終分解率が高くなった。

実施例 ３ 実施例２と同様にして、調製したダウエックス固定化リ
パーゼを良く乾燥し、牛脂との０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液とで各種の基質濃度の反応液をつくり６０℃で毎分
１７８回振盪しながら１６６．５時間反応後の分解率を
調べた。

基質濃度９４係１こしても、高い最終分解率を示した。

基質濃度５０％以下にしても、最終分解率は変化しなか
った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ マクロポーラスな多孔性の疎水性担体にリパーゼを
   結合させた固定化リパーゼを用いて脂質を分解するにあ
   たり、リパーゼの基質濃度を５０〜９４％の範囲内で分
   解することを特徴とする脂質の酸素分解法。