PL94970B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego zwanego dalej 6-APA.Znane jest, ze pewne enzymy zdolne sa do rozszczepiania wiazania amidowego w penicylinach. Takie enzymy sa cenne dla przemyslowego wytwarzania 6-APA z naturalnie wystepujacych penicylin uzyskiwanych w procesach fermentacyjnych.Obecnie stwierdzono, ze w procesie wytwarzania 6-APA mozna stosowac pewne nierozpuszczalne w wodzie kompleksy enzym-polimer, które nie tylko maja bardzo korzystna aktywnosc enzymatyczna ale takze bardzo dobra stabilnosc mechaniczna i chemiczna. Z powodu tak dobrej aktywnosci enzymatycznej, kompleksy takie sa bardzo wydajne przy konwersji naturalnych penicylin do 6-APA, a ze wzgledu na stabilnosc mechaniczna i chemiczna takie kompleksy moga byc wielokrotnie stosowane bez straty enzymatycznej aktywnosci. Dzieki temu sposób wedlug wynalazku jest duzo efektywniejszy od znanych sposobów wytwarzania 6-APA.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie kwas 6-aminopenicylanowy przez reakcje benzylopenicyliny lub fenoksypenicyliny albo ich soli w wodnym roztworze przy pH w granicach 6,0-9,0, z nierozpuszczalnym w wodzie kompleksem enzym-substrat skladajacym sie z enzymu zwanego penicylinaza, zaadsorbowanego na substracie, którym jest nierozpuszczalny w wodzie polimer, zwiazany poprzecznie czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal i aldehyd mrówkowy, przy czym, substratem tym jest nierozpuszczalny w wodzie polimer lub kopolimer kwasu metakrylowego.Wymienione wyzej kompleksy otrzymuje sie przez adsorpcje enzymu - penicylinazy na nierozpuszczalnym w wodzie polimerze lub kopolimerze kwasu metakrylowego, a nastepnie, reakcje z czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal i aldehyd mrówkowy.Stosowany w niniejszym sposobie wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny enzym-acylaze korzystnie jest uzyskiwac z bakterii, takich jak szczepy Escherichia coli lub, w przypadku stosowania jako substancji wyjsciowej fenyloksymetylopenicyliny — z nizszych roslin zarodnikowych lub promieniowców.Aktywnosc enzymatyczna deacylazy okresla sie zwykle na podstawie zdolnosci do wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny. Tak wiec, aktywnosc enzymów decylazy oznacza sie jako ilosc 6-APA (w mikromolach-/im)2 94 970 uzyskana w ciagu minuty z roztworu benzylopenicyliny o pH 7,8 i temperaturze 37 C, przypadajaca na miligram biafka zawartego w enzymie. Zawartosc bialka w enzymie oznacza sie standardowa metoda Lowry'ego.Aktywnosc enzymatyczna kompleksów enzym-substrat wedlug wynalazku oznacza sie w podobny sposób jako Posc 6-APA (w/im) wytworzona w ciagu minuty z roztworu benzylopenicyliny o pH 7,8 i temperaturze 37°C, przypadajaca na gram kompleksu enzym-substrat.Jak stwierdzono, wydajnosc adsorpcji, reakcji wiazania poprzecznego, oraz aktywnosc wytworzonego, nierozpuszczalnego w wodzie kompleksu enzym-substrat wzrasta w przypadku gdy uzywa sie czystszego enzymu wyjsciowego. Jednakze, z uwagi na to iz niektóre korzysci wynikajace z uzycia czystszego enzymu wyjsciowego rosna wolniej niz wynikaloby to ze wzrostu czystosci uzytego enzymu, oraz z uwagi na ograniczenia zwiazane z ekonomia procesu, uzywa sie deacylazy o czystosci w granicach od 0,15 do 50 mikromoli/min/mg bialka zawartego w enzymie, a korzystnie w granicach od 1,5 do 30 mikromoli/min/mg bialka.Korzystne jest zwiekszenie czystosci enzymu przed adsorpqa i reakcja wiazania poprzecznego. Mozna to ^uzysftpc TiaiJjtJtize ultrafiltracji lub ogrzewania roztworu enzymu w ciagu krótkiego czasu, np. w ciagu okolo 30 fminut, wlemperaturze okolo 50°C. Inne, typowe sposoby oczyszczania enzymu to stracanie frakcjonowane lub "obróbka przy pomocy jonowymiennych celuloz lub Sephadex'u. f &^^ wedlug wynalazku substratem sa polimery lub kopolimery kwasu metakrylowego. Zawieraja ipna .whllieyupy karboksylowe, co powoduje, ze polimer ten ma charakter kwasowy. Jako substraty preferowane saf raczej makroporowate polimery i kopolimery kwasu metakrylowego niz zele dimerów i kopolimerów tego kwasu.Jest rzecza pozadana, by polimery kwasu metakrylowego byly nierozpuszczalne w wodzie oraz by posiadaly postac kopolimerów usieciowanych. Jako przyklady takich polimerów moga sluzyc kopolimery kwasu metakrylowego z dwuwinylobenzenem lub dwuestry kwasu metakrylowego z glikolem, np. dwumetakry- lan glikolu etylenowego. Do wytwarzania powyzszych kopolimerów mozna równiez uzywac innych komonome- rów, takich jak estry kwasu metakrylowego.Jedna z korzysci wynikajacych z niniejszego wynalazku jest to, iz mozna uzywac jako substratów takich polimerów które sa produktami handlowymi stosowanymi do róznych celów, zwlaszcza jako kationity o charakterze slabo kwasnym. Szczególnie prz/datny jest tu kopolimer kwasu metakrylowego i dwuwinylobenze- nu sprzedawany przez f-me Rohm and Haas Co. ze Stanów Zjednoczonych AP pod nazwa Amberlite IRC-50, oraz kopolimer kwasu metakrylowego sprzedawany dawniej przez f-me Permutit Co. Ltd. pod nazwa Zeokarb 227. Ten ostatni jest kopolimerem dwuwinylobenzenu i kwasu metakrylowego zawierajacym równiez pewna ilosc grup benzenosulfonylowych.Polimery bedace substratami w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie korzystnie w postaci drobnoziarnis¬ tej tj. zawierajacej czastki o takich rozmiarach, by przechodzily przez sito 10 ASTM, a wiec, czastki o srednicach ponizej 2,0 mm. Jednakze, uzyskiwany sposobem wedlug wynalazku kompleks enzym-substrat powinien posiadac czastki o wiekszych rozmiarach, w przeciwnym razie nie móglby byc wydzielany z mieszaniny poreakcyjnej na drodze odsiewania, lub stosowany w reaktorze kolumnowym. Tak wiec, polimer powinien skladac sie z czastek o wymiarach wiekszych od 0,01 mm tj. powinien byc w calosci zatrzymywany na sicie 800*ASTM. Wybór odpowiedniego rozmiaru czastek z podanego wyzej zakresu zalezec bedzie od rodzaju stosowanego reaktora.Acylaza przygotowana do reakcji z polimerem powinna stanowic roztwór wodny, który zostal wczesniej poddany dializie w celu obnizenia przewodnictwa jonowego od wartosci 5—10 m Siemensów do okolo 0,1—5 m Siemensów, korzystnie okolo 1 m Siemensa. Roztwór enzymu powinien korzystnie posiadac pH 4,5—7,0; dla okreslenia optymalnej wartosci pH roztworu tj. wartosci przy której uzyskuje sie maksymalna adsorpcje i aktywnosc enzymu, moze zajsc koniecznosc przeprowadzenia kilku doswiadczen. Zwykle jednak, optymalna wartosc pH zawiera sie w granicach 52—6,5. Czas zetkniecia polimeru z roztworem enzymu powinien byc wystarczajaco dlugi, by uzyskac maksymalna adsorpcje enzymu; zwykle wynosi on od 2 do 16 godzin.Po zaadsorbowaniu na substracie, enzym sieciuje sie in situ, poddajac go reakcji z czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal lub aldehyd mrówkowy, przy czym preferowane jest stosowanie aldehydu glutarowego lub glioksalu. Aldehyd glutarowy nadaje kompleksowi enzym-substrat wlasnosci szczególnie korzystne w przypadku stosowania go do produkqi 6-APA. Czynnika sieciujacego uzywa sie zwykle w roztworze wodnym w stezeniu 0,1 —15% wagowych, a korzystnie 0,5-5,0% wag.Po zakonczeniu reakq"i sieciowania nalezy usunac cala reszte nieprzereagowanego czynnika sieciujacego.Mozna to uzyskac przemywajac produkt woda lub roztworem pochodnej aminowej; jak stwierdzono, doskona¬ lym srodkiem do tego celu jest mocznik.Przed uzyciem kompleksu enzym-substrat w procesie wytwarzania 6-APA nalezy doprowadzic ostroznie jego pH do wartosci w granicach 6,0-9,0 zwykle 7,0-8,5 (preferowana wartosc pH kompleksu wynosi 7,8);94 970 3 uzyskuje sie to zwykle przez dodanie do mieszaniny po zakonczeniu reakqi sieciowania, zasady. Uzyskany kompleks enzym substrat poddaje sie reakcji z wodnym roztworem (o odpowiedniem pH) benzylopenicyliny lub fenoksymetylopenicyliny lub ich soli, w temperaturze 30-50°, korzystnie w temperaturze 37°C. W trakcie reakqi z benzylopenicyliny wydziela sie kwas fenylooctowy, a z fenoksymetylopenicyliny — kwas fenoksyocto- wy. W celu utrzymania pH mieszaniny w odpowiednich granicach, wydzielajace sie kwasy zobojetnia sie w sposób ciagly lub periodyczny. Jak juz stwierdzono, dobór odpowiedniej zasady do tego celu nie jest sprawa istotna. Zwykle uzywa sie wodorotlenku sodu, chociaz mozna równiez uzywac lotnych zasad aminowych, takich jak amoniak lub trójetyloamina.Nierozpuszczalne w wodzie kompleksy enzymowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku sa wystarczaja¬ co trwale — i to zarówno pod wzgledem mechanicznym, jak i biologicznym. \N zwiazku z tym umozliwiaja przeprowadzenie co najmniej 40 kolejnych reakcji rozerwania wiazania amidowego penicyliny w dzialajacym periodycznie reaktorze.Sposób wedlug wynalazku ilustruja podane nizej przyklady, które takze ilustruja wysoka aktywnosc enzymatyczna oraz uzytecznosc kompleksów w polaczeniu z innymi kompleksami enzym-polimer. W przykla¬ dach tych stosuje sie czesciowo oczyszczony enzym acylaze — uzyskany na drodze mechanicznej w homogeniza- torze, z komórek wytwarzajacych acylaze szczepów bakterii Escherichia coli NC 1B 8734.Po doprowadzeniu mieszaniny do pH 5 szkielety komórek odsacza sie, a uzyskany roztwór enzymu oczyszcza sie dalej w stopniu niezbednym do uzyskania odpowiedniej aktywnosci (tj. od 1,5 do 30 mikromo- li/min/mg bialka). Nastepnie, roztwór enzymu poddaje sie dializie az do uzyskania przewodnosci okolo 1 m siemensa.Przyklad I. 20,25 lub 50 g podwielokrotnosci dostepnych w handlu kationitów i anionitów dyspergu¬ je sie w 100—500 ml destylowanej wody i dodaje, energicznie mieszajac, taka ilosc wodorotlenku sodu lub kwasu chlorowodorowego, by doprowadzic pH mieszaniny— w przypadku kationitów — do wartosci w granicach 4,4—6,3, a w przypadku anionitów —do wartosci w granicach 6,5-9,0. Nastepnie zywice odsacza sie, przemywa dokladnie destylowana woda i ponownie dysperguje w roztworze 60—100,250 lub 500 ml czesciowo oczyszczo¬ nej penicylinazy o aktywnosci 3,85-6,75 mikromoli/min/mg bialka i o przewodnosci < 1 mS dostosowanej do odpowiedniej wartosci pH.Ilosc enzymu adsorbowanego na zywicy waha sie od 71 do 308 mikromoli/min/g zywicy. Mieszanine pozostawia sie, lekko wstrzasajac i dodajac roztworu mianowanego w celu utrzymania odpowiedniego pH, wciagu 16 godzin, w celu zaadsorbowania enzymu na zywicy, a nastepnie przesacza. Odsaczone zywice dysperguje sie w 100 ml 0,825-3,3% (wag./obj.) roztworu aldehydu glutarowego w wodzie.j pozostawia, dodajac roztworu mianowanego w celu utrzymania odpowiedniego pH, w ciagu 16 godzin do przereagowania. Uzyskane kompleksy enzym-zywica odsacza sie, przemywa trzykrotnie woda destylowana, dysperguje w wodzie lub 0,2 m roztworze buforu fosforanowego o pH 7,8, doprowadza Ph mieszaniny do wartosci 7,8 i poddaje wciagu 1 godziny reakgi ze 100 ml 0,1 m wodnego roztworu mocznika o pH = 7,8, po czym przemywa trzykrotnie woda destylowana.Kazdego z tak wytworzonych kompleksów uzywa sie w procesie wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny, prowadzonego w typowych warunkach: przy pH = 7,8 i w temperaturze 37°C. Aktywnosci stosowanych komple¬ ksów podane sa w tabeli I i odnosza sie do kompleksów wytworzonych przy pH optymalnym dla adsorpqi enzymu i utrzymania jego aktywnosci.Zywice Bio-Rex i Chelex sa produktami handlowymi f-my Bio-Rad Laboratories of California, ze Stanów Zjednoczonych AP; zywice Lewatit sa produktami handlowymi f-my Bayer AG z RFN; zywice Zeokarb i Zerolit sa produktami handlowymi f-my The Permutit Co. Ltd., a zywice Amberlite sa produktami handlowymi f-my Rohm and Haas, Philadelphia, ze Stanów Zjednoczonych AP. Nalezy zauwazyc, ze korzysci wynikajace z wysokiej aktywnosci i stabilnosci ograniczone sa do przypadków, w których substratem jest polimer lub kopolimer kwasu metakrylowego.94 970 Tabela I Doswiad- Rodzaj monomeru oraz czenie grup funkcyjnych zywicy Zywica Aktywnosc kompleksu Fizyczna enzym-zywica przy postac optymalnej wartosci pH zywicy m/min/g m/min/g subst. subst mokrej suchej a Styren-czwartorzedowe amonowe b Styren-czwartorzedowe amonowe c Arylan-czwartorzedowe amonowe d Styren-poliaminowe e Styren-poliaminowe f Akrylan-poliaminowe g Styren-S03 H h Styren-S03 H i Styren-S03H j Styren-S03 H k Fenol-formaldehyd-S03 H I Styren-S03H m Styren-P03 H2 n Styren-CH2 -N/CH2 -COOH/2 ó Metakrylan-COOH p Akrylan-COOH q Akrylan-COOH r Akrylan-COOH s - + 2 -COOH t + 2 -COOH OH u F«wol-formaldehyd[QQQH Polimetakrylan COOH -SO3H Amberlite IRA-938 Amberlite IRA-401 Amberlite IRA-458 Lewatit MP62 Amberlite IR45 Amberlite IRA-68 Lewatit SP120 Lewatit 8100 ZerolJt 325 Amberlite IR-120 Bio-Rex 40 Bio-Rad AG/MP/50 Bio-Rex 63 Chelex 100 Amberlite IRC-50 Amberlite IRC-72 Amberlite IRC-84 Zerolit 236 Lewatit CHP-80 Lewatit CHP Zerolit 216 Zeokarb 227 Makroporowata Zel Zel Makroporowata Zel Zel Makroporowata Zel Zel M Zel Makroporowata Zel Zel Makroporowata Makroporowata Zel Zel Makroporowata Makroporowata Zel Zel ,4 2,3 • 4,71 ,1 2,3 2,3 19,3 2,3 2,3 2,3 4,01 9,9 2,3 7,16 37,0 ca. 8,0 7,0 ca. 8,0 152 2,3 2,3 32,4 ,8 ,1 ,7 ,8 ,8 392 ,8 .8 53 8,3 19,8 ,1 \ 883 ca. 24,0 ' 13,9 ca. 17,1 * 36.5 ,8 53 ,9 57,0 Uwagi: ' Wyniki bardzo rózniace sie miedzy soba, obliczone wartosci sa srednia z kilku oznaczen. a Nieznana budowa polimeru. < 3 Zywica niedostepna w handlu. 4 Wielkosc czastek — 200 mesh; dla innych zywic 14,50 mesh Zywice a—c maja charakter silnie zasadowy Zywice d—f maja charakter slabo zasadowy Zywice g—I maja charakter silnie kwasowy Zywice o—u maja charakter slabo kwasny94 970 Tabela II Przyklad II III IV V Aktywnosc enzymu wyjsciowego m/min/mg bialka 4,64 7,87 ,5 18,2 Szybkosc adsorpqi enzymu na zywicy m/min/g zywicy 216 463 1160 586 Aktywnosc kompleksu enzym—zywica m/min/g subst suchej 38,1 72,0 124,0 109,0 Przyklady II—V. Ponizsze przyklady ilustruja efekt wywolany rózna czystoscia uzywanej w procesie adsorpcji acyl£zy. Stosuje sie tu sposób opisany w przykladzie I. Enzym adsorbuje sie przy pH = 5,7. Uzyskany kompleks enzym - zywica poddaje sie reakcji z 3,3% (wag/obj.) roztworem aldehydu glutarowego. W doswiadcz- eniach uzywa sie zywicy „Amberlite IRC-50" przemytej najpierw zasada, a nastepnie kwasem. W tabeli 11 podane sa aktywnosci uzyskanych tym sposobem kompleksów enzym-substrat. Uzyskane wyniki wskazuja, ze w bada¬ nym zakresie zwiekszenie czystosci enzymu wyjsciowego powoduje wzrost aktywnosci uzyskiwanego kompleksu.Przyklad VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV Tab e PH 4,9 ,1 ,3 ,5 ,7 ,7 ,9 6,1 63 6,5 la III Aktywnosc kompleksu enzym-substrat miki ornoIi/m in/g subst. wilgotnej ,2 21,2 40,8 49,0 572 44,4 13,0 8,4 ,6 ,6 Przyklady VI—XV. Ponizsze przyklady sluza jako ilustraqa wplywu pH srodowiska w którym zachodzi proces adsorbowania enzymu na zywicy, na produkt bkoncowy. Przeprowadza sie nastepujace doswiadczenia: /a/ Piec podwielokrotnosci 50 g zywicy „Amberlite IRC-50" doprowadza sie odpowiednio do pH = 4,9; ,1; 5,3; 5,5 i 5,7, suszy i miesza (kazda) z 200 ml roztworu zawierajacego 95 ml czesciowo oczyszczonej penicylinazy o aktywnosci 60,9 mikromola/min/ml i przewodnosci 0,55 mS, która zawiera w 1 ml 16,8 mg bialka. Adsorpcje prowadzi sie w ciagu 16 godzin, po czym - uzyskany kompleks poddaje obróbce w sposób opisany w przykladzie I. lub /b/ Piec dalszych podwielokrotnosci zywicy „Amberlite IRC-50" poddaje sie obróbce w opisany wyzej sposób, z ta tylko róznica, ze adsorpcje prowadzi sie w srodowisku opH w granicach 5,7-6,5. Do adsorpcji uzywa sie 105 ml enzymu o aktywnosci 54,7 mikromola/min/ml i przewodnosci 0,75 mS, który zawiera w 1 ml 16,8 mg bialka.Uzyskane wyniki podane sa w tabeli III. Wskazuja one, ze optymalna wartosc pH dla procesu adsorpcji94 970 zawiera sie w granicach 5,2-5,8.Przyklady XVI—XVII. Ponizsze przyklady sluza, jako ilustraqa skutków wynikajacych zuzycia zywicy o innych rozmiarach czastek. W pierwszym przypadku uzywa sie zywicy Amberlite IRC-50 skladajacej sie z czastek o rozmiarach stosowanych w chromatografii np. z czastek przechodzacych przez sito 100 A.S.T.M. a zatrzymanych na sicie 200 A.S.T.M. (tj. z czastek o rozmiarach 0,74-0,149 mm). g podwielokrotnosci zywicy poddaje sie w ciagu 3 godzin, przy pH = 6,7, procesowi adsorpcji 200 ml enzymu (23,7 mikromola/mih/ml; 3,86 mikromola/min/mg bialka). Uzyskany kompleks odsacza sie i poddaje, wciagu 16 godzin, dzialaniu 200 ml 0,825% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego, a nastepnie wydziela z mieszaniny i przemywa w sposób opisany w przykladzie I. Uzyskuje sie 21 g produktu o aktywnosci 114,5 mikormola/min/g substancji wilgotnej. Porównujac uzyskany produkt z produktem z przykladu II, w którym uiyto zywicy „Amberlite IRC-50" skladajacej sie z czastek przechodzacych przez sito 14 A.S.T.M. a zatrzyma¬ nych na sicie 50 A.S.T.M. (tj. czastek o srednicach 0,297—1,41 mm) mozna zauwyzyc, ze lepsze wyniki uzyskuje sie w przypadku uzycia zywicy o mniejszych rozmiarach czastek.Doswiadczenie powtarza sie z zywica skladajaca sie z czastek o rozmiarach stosowanych w farmacji tj. z zywica „Amberlite IRP-64" skladajaca sia z czastek przechodzacych przez sito 100 A.S.T.M. a zatrzymanych na sicie 500 A.S.T.M. (a wiec, z czastek o srednicach 0,037-0,149). Zywice te poddaje sie przy pH =6,3 adsorpcji enzymem (3920 mikromoli/min/g zywicy, aktywnosc = 17,4 mikromoli/min/mg bialka). Uzyskany kompleks enzym-zywica poddaje sie reakqi z 3,3% (wag/obj) roztworem aldehydu glutarowego, po czym obrabia wsposób opisany w przykladzie I. W wyniku uzyskuje sie kompleks enzym-zywica o aktywnosci 478,4 mikromola/min/g subst wilgotnej.Przyklad XVIII. Przemywajac zywice „Amberlite IRC-50" 0,2 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 5,5, lub mieszajac ja z woda destylowana i dodajac roztworu wodorotlenku sodu, doprowadza sie jej pH do wartosci 5,5. Nastepnie, zywice przemywa sie tak dlugo woda destylowana, az przestanie sie zauwazac zmiany jej przewodnosci. 100 g wilgotnej zywicy dodaje sie do roztworu penicylinazy o aktywnosci 5,25 mikromola/min/mg bialka w 500 ml 0,02 m roztworu buforu fosforanowego opH=5,5 i miesza wciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej. Wytracony osad odsacza sie, dysperguje w 500 ml 0,25% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego rozpuszczonego w roztworze buforu fosforanowego i miesza w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej.Uzyskany kompleks enzym-zywica odsacza i przemywa tak dlugo 0,2 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 7,8, az zywica osiagnie taka sama wartosc pH. g wytworzonego w ten sposób kompleksu uzywa sie w reakcji rozszczepienia 200 ml 6,25% (wag/obj) wodnego roztworu benzylopenicyliny w 0,02 m roztworze buforu fosforanowego, reakcji prowadzonej w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C i przy pH = 7,8. Jak stwierdzono, powyzszy kompleks mozna latwo odzyskiwac z mieszaniny poreakcyjnej i stosowac ponownie. Przy tym, jego wlasnosci mechaniczne i biologiczne pozostaja niezmienione, co pozwala na co najmniej 25 krotne uzywanie tego kompieksu w reakcjach rozszczepiania penicylin. < Przyklad XIX. Przyklad ten sluzy jako ilustracja sposobu stosowania wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku kompleksu enzym-substrat w prowadzonej na wielka skale produkcji 6-APA, oraz sposobu ponownego uzycia niniejszego kompleksu w warunkach produkcyjnych.Kompleks enzym-substrat o aktywnosci 26,3 mikromola/min/g wytwarza sie z zywicy „Amberlite IRC-50" i stosuje w reakcji rozszczepiania 40 litrów 6,5% (wag/obj) roztworu benzylopenicyliny w 0,02 m buforu fosforanowego. Po reakcji kompleks pozostaje w reaktorze (zaopatrzonym w tym celu w druciana siatke), a odsaczony produkt, którym jest roztwór 6-APA, poddaje sie dalszej przeróbce. Kompleks, po przemyciu woda, mozna stosowac w dalszych reakcjach. Przecietna wydajnosc 50 kolejnych (z tym samym kompleksem) reakcji konwersji do 6-APA, prowadzonych w ciagu 6 godzin kazda, wynosi 95%.Przyklad XX. Przyklad ten sluzy jako ilustracja stabilnosci mechanicznej kompleksu enzym-substrat pokazanej na przykladzie kompleksu wytworzonego w przykladzie I z zywicy „Amberlite IRC-50" i porównanej ze stabilnoscia kompleksu wytworzonego w podobny sposób, lecz z innego, nieaktywnego substratu, a mianowi¬ cie — z zywicy XAD-7, która jest usieciowanym estrem akrylowym, dostepnym w handlu i wytwarzanym przez f-me Rohm and Haas Corp., Stany Zjednoczone AP. 1,6 g próbki kazdego z kompleksów dysperguje sie w temperaturze 37°C w 8 litrach 0,2 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,8 i miesza w ciagu 72 godzin z predkoscia 200 obr./min w zaopatrzonej w przegrody kadzi fermentacyjnej New Brunswick Magnaferm. Co 4 godziny pobiera sie z kazdej kadzi próbke i oszacowuje wzrokowo ilosc uszkodzonych kulek zywicy. Ilosc uszkodzonych kulek zywicy XAD-7 jest znacznie wieksza niz zywicy IRC-50 (ilosc uszkodzonych kulek zywicy IRC-50 po 64 godzinach prowadzenia eksperymentu jest94 970 7 równa ilosci uszkodzonych kulek zywicy XAD-7 po 8 godzinach eksperymentu). Uzyskane wyniki wskazuja wyraznie na znacznie wieksza wytrzymalosc mechaniczna zywicy IRC-50.Przyklad XXI. 235 g Amberlite IRC-50 o aktywnosci 39,4 mikromola/min/g wytworzonego w sposób .opisany w przykladzie I, uzywa sie w serii doswiadczen do rozszczepienia 6,25% (wag/obj.) roztworu soli potasowej benzylopenicyliny G. Kazde doswiadczenie prowadzi sie w ciagu 2 1/2 godziny, w temperaturze 37°C i przy pH = 7,8, uzywajac 1 litra roztworu soli potasowej benzylopenicyliny G. Po kazdym doswiadczeniu Amberlite IRC-50 odsacza sie i przemywa woda destylowana. Przesacz i popluczyny zateza sie w obrotowej wyparce prózniowej, miesza z równa objetoscia ketonu metyloizobutylowego, schladza do temperatury 4—10°C i zakwasza, stracajac osad kwasu 6-aminopenicylanowego. Wytracony osad przemywa sie niewielka iloscia wody destylowanej, przeplukuje acetonem i suszy w piecu. W przeprowadzonych doswiadczeniach srednia wydajnosc wagowa kwasu 6-aminopenicylanowego wynosila 91,3%.Przyklad XXI I. Adsorpqa enzymu acylazy na polietylenie pokrytym uretanem.Czastki polietylenu o malej gestosci (<400j/m) pokrywa sie polimerem uretanowym (Urithsne 641 W, Cray Valley Products Limited) i pozostawia w ciagu 10 dni do wyschniecia. Nastepnie, przemywa sie je w ciagu 1 godziny 20% roztworem wodnym acetonu (w% obj), przeplukuje dokladnie woda destylowana i poddaje, wciagu 5 godzin, przy pH w granicach 4,8-9,0, adsorpqi 5g podwielokrotnosciami 125 ml enzymu (54,0 mikromola/min/ml; 3,80 mikromola/min/mg bialka). Czasteczki pokryte uretanem odsacza sie, poddaje w ciagu 3 godzin dzialaniu 75 ml 3,3% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego i doprowadza do pH = 7,8 sposobem opisanym w przykladzie I.Pomimo, iz pokryte uretanem, uzyskane czastki posiadaja mniejsze rozmiary niz czastki IRC-50.Aktywnosc uzyskanego kompleksu jest 2—3-krotnie mniejsza niz kompleksu z IRC-50.Aktywnosc pH 4,8 .2 ,6 6,0 6.4 7.0 7,5 8,0 8.5 9.0 mikromole/min/g subst. wilgotnej 11,3 14,0 16.4 13,2 13,6 12,3 7,8 ,0 9,0 122 Przyklad XXII I. Adsorpcja enzymu acylazy na nylonie.Orgolac'4 (sproszkowany nylon 6 o srednicy czastek <30 im\, zf-my Ato Chimie Limited, UK) przemywa sie wciagu 1 godziny 65% (wag/obj) roztworem kwasu mrówkowego, a nastepnie dokladnie przeplukuje woda destylowana. 10 g podwielokrotnosci powyzszej substancji poddaje sie w ciagu 16 godzin, przy pH w granicach 4,8-9,0, adsorpqi 100 ml enzymu (50,9 mik»-omola/min/ml; 4,7 mikromola/min/mg bialka). Uzyskany kom¬ pleks odsacza sie, poddaje wciagu 3 godzin reakqi z 100 ml 3,3% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego, ponownie odsacza i przemywa w sposób opisany w przykladzie I.Kompleks o najwyzszej aktywnosci 41,7 mikromola/min/g substancji wilgotnej uzyskany przy pH 4,8 jest porównywalny z typowym kompleksem uzyskiwanym z IRC-50. Jednakze, w tym przypadku wystepuje duza róznica w rozmiarach czastek nylonu i IRC50. Przy uzyciu IRP-64 (tj. IRC-50 o rozmiarach czastek stosowanych wfarmaqi, czyli 0,037—0,149 mm) uzyskuje sie z acylaza kompleks o aktywnosci 478 mikromoli/min/g subst. wilgotnej, tj. o aktywnosci przeszlo jedenastokrotnie wiekszej niz w przypadku uzycia jako substratu-nylonu.Aktywnosc pH 4,8 52 ,6 6,0 6,4 7,0 mikromole/min/g subst. wilgotnej 41.7 36,1 26,9 22,2 ,7 17,68 94 970 1 2 7,5 17,6 8,0 21,3 8,5 15,7 9,0 9,3 PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego przez reakcje znajdujacej siew roztworze wodnym o pH 6,0-9,0 benzylopenicyliny lub fenoksymetylopenicyliny lub ich soli z nierozpuszczalnym w wodzie kompleksem enzym-substrat skladajacym sie z penicylinazy zaadsorbowanej na substracie, który stanowi nierozpuszczalny w wodzie polimer zwiazany poprzecznie czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal lub aldehyd mrówkowy, znamienny tym, ze substratem jest nierozpuszczalny w wodzie polimer lub kopolimer kwasu metakrylowego.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie penicylinaze o czystosci w granicach od 1,5 do 30 mikromoli/min/mg/bialka.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie substrat o bi-dowie makropórowatej.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie kopolimer kwasu metakrylowego i dwuwinylobenzenu.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje sie kopolimer zawierajacy dodatkowo grupy benzenosulfonylowe.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie kompleks enzym-substrat w postaci drobnych czastek o rozmiarach w granicach od 0,1 do 0,01 mm.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w temperaturze 30-50°C, utrzymujac pH mieszaniny w granicach 7,0—8,5 przez ciagle lub okresowe dodawanie wodorotlenku sodu. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL PL