Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego, okreslonego w dalszej czesci opisu jako 6—APA z zastosowaniem.Znany jest sposób wytwarzania 6-APA przez dzialanie na penicyline okreslonych enzymów rozszczepiaja¬ cych amidowe wiazanie penicyliny. Enzymy, które sa znane z tego ze rozszczepiaja to wiazanie amidowe, okreslone sa w dalszej czesci opisu jako enzymy deacylazy penicylinowej pomimo tego, ze moga one takze byc nazwane amidazami penicylinowymi.Znane jest takze wiazanie enzymów deacylaz penicylinowych z nierozpuszczalnymi w wodzie substancjami polimerycznymi i otrzymywanie w ten sposób nierozpuszczalnych w wodzie kompleksów enzymatycznych, które zachowuja aktywnosc deacylazy penicylinowej. Wartosc takich nierozpuszczalnych kompleksów enzymatycz¬ nych polega na tym, ze otrzymywanych ich dzialaniem 6—APA nie zawiera enzymu. Poza tym kompleks' enzymatyczny latwo jest przechowywac i transportowac.Znany jest tez sposób otrzymywania rozpuszczalnych w wodzie kompleksów enzymatycznych przez wiazanie enzymów z rozpuszczalnikami w wodzie substancjami polimerycznymi. Jednakze jak dotad nie opisano uzycia do tego enzymu deacylazy penicylinowej. Wynika to z przeswiadczenia, ze kompleks taki nie moze byc latwo wyodrebniony z wodnego srodowiska reakcji wytwarzania 6—APA i uzyty powtórnie, oraz ze zastosowa¬ nie enzymu w tej postaci nie jest korzystne pod wzgledem ekonomicznym.Stwierdzono, ze penicylinowe enzymy deacylazy moga byc zwiazane z rozpuszczalnymi w wodzie substan¬ cjami polimerycznymi tworzac kompleksy enzymatyczne rozpuszczalne w wodzie, oraz, ze kompleksy te zachowuja aktywnosc wolnej deacylazy penicylinowej. Ponadto stwierdzono, ze uzycie takiego kompleksu enzymatycznego do wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego umozliwia zastosowanie bardziej stezonych roztworów niz w przypadku kompleksów nierozpuszczalnych w wodzie,co daje ekonomiczne wynikajace z wie¬ kszego przerobu lub mozliwosci uzycia aparatury w mniejszej skali. Poza tym stwierdzono, ze rozpuszczalny w wodzie kompleks enzymatyczny moze byc wydzielony przez ultrafiltracje z wodnego roztworu po wytworzen¬ iu 6—APA. W wodnym roztworze pozostaje 6—APA i nieprzereagowana penicylina. Z roztworu tego mozna latwo wyizolowac 6—APA poprzez zatezenie roztworu a nastepnie doprowadzenie pH do wartosci punktu izoelektrycznego 4,3 lub zblizonej. Wydzielony kompleks enzymatyczny jest w,roztworze wodnym i w wysokim2 86 995 stopniu zachowuje aktywnosc deacylazy penicylinowej. Tedwie wlasciwosci umozliwiaja powtórne jego uzycie bez uprzedniego przygotowania. Ponadto takie komplekty enzymatyczne pozwalaja wytwarzac 6—APA w roz¬ tworach bardziej stezonych. Odkrycia te umozliwiaja oplacalna produkcje 6—APA, zwlaszcza wprocesi.e ciaglym przeprowadzanym w jednorodnym srodowisku wodnym.Wedlug wynalazku sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego polega na poddaniu kontaktowi w roztworze wodnym przy wartosci pH =6,0—9,0 benzylopenicyliny lub fenometoksypenicyliny lub ich soli z kompleksem enzymatycznym rozpuszczalnym w wodzie, w którym enzym deacylaza penicylinowa jest zwiaza¬ na z obojetna, rozpuszczalna w wodzie substancja polimeryczna, po czym oddziela sie kompleks enzymatyczny z wodnego srodowiska reakcji przez ultrafiltracje, wyodrebnia utworzony kwas 6-aminopenicylanowy i oddzielo¬ ny wodny roztwór kompleksu enzymatycznego zawraca do reakcji przez poddanie go kontaktowi z nastepna porcja penicyliny.Komplekty enzymatyczne uzyte w sposobie wedlug wynalazku sa nowe. Wynalazek obejmuje swym zakresem takze otrzymywanie rozpuszczalnego w wodzie kompleksu enzymatycznego, zawierajacego enzym deacylaze penicylinowa zwiazana z rozpuszczalna w wodzie obojetna substancja polimeryczna.Korzystnie enzym deacylaze penicylinowa do zastosowania w sposobie wedlug wynalazku uzyskuje sie z bakterii takich jak szczepy Escherichia coli z przeznaczeniem do rozszczepiania benzylopenicyliny, lub z grzybów lub promieniowców z przeznaczeniem do rozszczepiania fenoksymetylopenicyliny. Enzymy takie sa na ogól dobrze znane. Uzywane sa przy wytwarzaniu 6—APA przy wartosci pH 6,0—9,0, korzystnie 7,0—8,5.Poniewaz deacylacja penicyliny prowadzi do uwolnienia kwasu z bocznego lancucha penicyliny, konieczne jest podczas procesu wytwarzania 6—APA utrzymywanie tego zakresu wartosci pH przez doprowadzenie potrzebnej ilosci roztworu alkalicznego takiego jak wodorotlenek sodowy lub postasowy lub trójetyloamina.Do wytwarzania rozpuszczalnych w wodzie kompleksów enzymatycznych w sposobie wedlug wynalazku rroga byc uzyte róznorodne rozpuszczalne w wodzie substancje polimeryczne, przy czym przydatnosc poszcze¬ gólnych substancji moze byc ustalona wylacznie na drodze doswiadczalnej.Stwierdzono, ze jednym z rodzajów polimerów szczególnie korzystnych do tego zastosowania sa rozpusz¬ czalne w wodzie kopolimery bezwodnika kwasu maleinowego, miedzy innymi rozpuszczalne w wodzie kopolime¬ ry zlozone z bezwodnika kwasu maleinowego lub bezwodnika kwasu akrylowego i eteru winylowometylowego lub etylenu lub styrenu lub octanu winylu. Szczególnie korzystna grupe rozpuszczalnych w wodzie kopolimerów stanowia kopolimery bezwodnik kwasu maleinowego-eter winylowometylowy znane pod nazwa „Gantrez AN", zwlaszcza „Gantrez AN 149" bedacy kopolimerem o masie czasteczkowej okolo 750 000 oraz „Gantrez AN 169", który jest kopolimerem o masie czasteczkowej okolo 1 125 000. Kopolimery zawierajace bezwodnik, kwasu maleinowego moga przereagowac z enzymem deacylaza penicylinowa jedna ze znanych metod opisanych w opisie patentowym RFN nr 1 945 680 i w opisie patentowym brytyjskim nr 1290 701. Enzym moze na przyklad reagowac z kopolimerem „Gantrez AN w obecnosci silnego buforu lub przy utrzymaniu obojetnego odczynu w inny sposób.Innymi szczególnie korzystnymi rozpuszczalnymi w wodzie substancjami polimerycznymi sa wielocukry, takie jak dekstran, dekstryna lub celuloza, pod warunkiem, ze sa rozpuszczalne w wodzie i ze po zwiazaniu z enzymem deacylaza penicylinowa utworza kompleks rozpuszczalny w wodzie. Zwiazanie takie zachodzi zazwyczaj po uprzedniej aktywacji wielocukru dzialaniem takimi odczynnikami aktywujacymi jak epichlorohy- dryna czy halogenki cyjanu. Moze byc uzyty wielocukier zmodyfikowany uprzednio przez wprowadzenie don koncowego ugrupowania karboksymetylowego, hydroksyetylowego lub aminoetylowego.Stwierdzono, nastepnie, ze polimerami szczególnie odpowiednimi do zastosowan w sposobie wedlug wynalazku sa zmodyfikowane cukry do oligocukry takie.jak sacharoza, glukoza lub laktoza. Szczególnie korzystnym polimerem tego rodzaju jest kopolimer sacharoza-epichlorohydryna znany pod nazwa Ficoll, zwlaszcza Ficoll o masie czasteczkowej okolo 400 000. Uzycie polimerów tego rodzaju umozliwia utworzenie rozpuszczalnego w wodzie enzymu deacylazy penicylinowej wykazujacej wysoka aktywnosc podczas reakcji wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego. Istotne znaczenie ma niska lepkosc tych kompleksów enzymatycz¬ nych. Umozliwia ona latwe wydzielanie kompleksów przez ultrafiltracje z mieszaniny reakcyjnej, w której zawarte byly podczas wytwarzania 6-APA. Dlatego tez moga one byc latwo oddzielane i ponownie uzyte.Rozpuszczalne w wodzie kompleksy enzymatyczne do zastosowania w sposobie wedlug wynalazku mozna otrzymac jedna ze znanych metod wiazania enzymów z polimerami pod warunkiem, by utworzony kompleks mógl byc uzywany za rozpuszczalny w wodzie. Termin „rozpuszczalny w wodzie" oznacza, ze kompleks enzymatyczny jest rozpuszczalny albo rozprasza sie w wodzie tworzac roztwór lub koloid zawierajacy co najmniej 0,1 grama w jednym litrze przy wartosci pH 7,8.Takimi metodami wiazania sa na przyklad reakcje sprzegania enzymu deacylazy penicylinowej z polimerem przy uzyciu takich odczynników jak halogenki cyjanu, korzystnie bromek cyjanu, symtrójazyny, zwlaszcza86995 3 2-amino«4,6-dwuchloro-symtrójazynar azydki, na przyklad eter 2-hydroksy-3-(p-dwuazofenylo)-propylowy, oraz cyjaniany organiczne jak cyjanian fenylowy i organiczne dwupodstawione karbodwuimidy. Czesto doprowadza sie do reakcji takich sprzegajacych odczynników z polimerem, wprowadzajac w ten sposób do niego grupy czynne, reagujace nastepnie z enzymem! W niektórych przypadkach enzymy moga reagowac bezposrednio z polimerem na przyklad wtedy, kiedy zawiera on sam z siebie lub w rezultacie modyfikacji grupy czynne takie jak wiazania bezwodnikowe, podstawnik aminoetylowy, hydroksyetylowy lub karboksymetylowy. Kompleksy stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna takze otrzymac przez zwiazanie enzymu z nierozpuszczalnym w wodzie polimerem takim jak dekstran poprzecznie usieciowany a nastepnie przez nadanie utworzonym kompleksom wlasciwosci rozpuszczania sie w wodzie poprzez proces odpowiedniej degradacji, na przyklad poprzez czesciowa hydrolize albo w wyniku reakcji poprzecznie usieciowanego dekstranu z dekstranaza. Mozna takze zmodyfiko¬ wac aktywnosc kompleksu enzymatycznego przez zwiazanie enzymu z substancja polimeryczna przy uzyciu grup przestrzennych. Enzym moze zostac zwiazany z polimerem mostkami utworzonymi przez aldehydy takie jak gliksal lub aldehyd glicerynowy albo przez dwuaminy takie jak szesciometylenodwuamina lub etylenodwuamina lub przez a-oraminoalifatyczny kwas karboksylowy taki jak glicyna albo przez kwas eaminoheksanowy.Enzym deacylaza penicylinowa moze sie wiazac z polimerem w szerokim zakresie wzajemnych stosunków ilosciowych, w tym zakresie stosunków wagowych polimeru do enzymu 0,1—100 :1. Korzystnie jest stosowac polimer i enzym w stosunku ilosciowym polimeru do enzymu w zakresie 2 :1 —20 :1.Po utworzeniu rozpuszczalnego w wodzie kompleksu enzymatycznego mozna go latwo oczyscic przed uzyciem przez ultrafiltracje albo przy pomocy chromatografii na zelu, w tym na Sephadex G—100.Rozpuszczalne w wodzie pochodne enzymu w sposobie wedlug wynalazku zachowuja aktywnosc maci^ rzystego enzymu deacylazy penicylinowej, dzieki czemu moga byc stosowane tak w procesie stacjonarnym jak i ciaglym wytwarzania 6—APA.Istotna czescia instalacji sluzacej do wytwarzania 6—APA z uzyciem kompleksów enzymatycznych sposobem wedlug wynalazku jest ultrafiltr. Zawiera on blone pólprzepuszczalna o ograniczonym zakresie przenikania, co umozliwia przejscie przez blone substancji o niskiej masie czasteczkowej a uniemozliwia przesaczenie substancji o wysokiej masie czasteczkowej. Zakres przenikania dobiera sie stosownie do masy czasteczkowej kompleksu enzymatycznego. Stosuje sie blone, która przepuszcza 6-APA a zatrzymuje kompleks enzymu z polimerem, umozliwiajac przez to odzyskiwanie kompleksu i jego powtórne uzycie.Dzieki zastosowaniu ultrafiltracji rozpuszczalny w wodzie kompleks odzyskuje sie jako roztwór wodny i przez to mozliwe jest zawrócenie go bezposrednio do reakcji. Oczyszczenie kompleksu enzymatycznego przed ponownym uzyciem jest na ogól niepotrzebne.Szczególnie korzystna metoda, która moze byc zastosowana do wytwarzania 6—APA w sposób ciagly sposobem wedlug wynalazku, objasniono na zalaczonym schemacie, który przedstawia instalacje chemiczna przeznaczona do tego procesu.Reaktor 1 zaopatrzony jest w mieszadlo 2 i plaszcz przez który od wlotu 3 do wylotu 4 przeplywa woda o okreslonej temperaturze. W reaktor wmontowany jest czujnik pehametryczny 5, który poprzez regulator 6 uruchamia zawór 7 na przewodzie doprowadzajacym 8, przez który dodawany jest roztwór alkaliczny w celu - utrzymania pH zawartosci reaktora 1 na okreslonym poziomie. Roztwór penicyliny mozna tloczyc do reaktora 1 przy pomocy pompy 9 na przewodzie 10 ze zbiornika 11 zaopatrzonego w mieszadlo 12, oraz w plaszcz wodny, przez który od wlotu 13 do wylotu 14, przeplywa woda regulujaca roztwór penicyliny do wymaganej reakcji.Mieszanine reakcyjna odprowadza sie z reaktora 1 przewodem 15 przetlaczajac ja przy uzyciu pompy 16 do'ultrafiltru 17. Roztwór pozostaly po ultrafiltracji przekazywany jest z ultrafiltru przewodem 18 dó reaktora 1.Przesacz po ultrafiltracji moze byc z ultrafiltru 17 przekazywany bezposrednio do urzadzenia do izolacji, nie pokazanego na schemacie gdzie utworzony 6—APA mozna wydzielic w postaci krystalicznej w wyniku zwyczajnego zatezenia roztworu i nastawienia wartosci pH na punkt izoelektryczny 6-APA. Korzystniej jest jednak podawac przesacz po ultrafiltracji z ultrafiltru 17 przewodem 19 do drugiego reaktora 20, wyposazonego tak jak reaktor 1 w plaszcz wodny z wlotem 21 i wylotem 22, mieszadlo 23, czujnik pehametryczny 24 i regulator 25 uruchamiajacy zawór 26 na przewodzie doprowadzajacym roztwór alkaliczny 27. Z reaktora 20 mieszanina reakcyjna przetlaczana jest przewodem 28 przy uzyciu pompy 29 do drugiego ultrafiltru 30, z którego roztwór pozostaly po ultrafiltracji zawracany zawracany jest przewodem 31 do reaktora 20,natomiast przesacz do ultrafiltracji przewodem 32 do nie pokazanego na schemacie urzadzenia do izolacji, w którym utworzony 6—APA jest wydzielony w sposób wyzej opisany.W sposobie wedlug wynalazku korzystnie jest stosowac roztwór benzylopenicyliny w stezeniu okolo 7% wagowo objetosciowych i kompleks enzymatyczny w takiej ilosci która wystarcza do rozlozenia okolo 90% penicyliny wciagu 3 godzin. Mieszanine poreakcyjna usuwa sie z reaktora 1 po czym ze zbiornika 11 dotlecza4 86 995 sie do niego nowa porcje roztworu penicyliny z predkoscia wyregulowana tak, aby przecietny czas pozostawania roztworu w reaktorze wynosil okolo 3 godziny. W ten sposób w kazdej szarzy zawartosc reaktora 1 reaguje 3 godziny, po czym jest odprowadzana przewodem 15, natomiast przewodem 10 dodaje sie do reaktora nowy roztwór. Przecietny czas pozostawania w reaktorze 20 regulowany jest przy pomocy pomp 16 i 29 i wynosi okolo 1 godziny, co wystarcza do degradacji reszty penicyliny, która nie przereagowala w reaktorze 1 i która przeszla wraz z utworzonym 6—APA poprzez pierwszy ultrafiltr 17.W opisanej powyzej instalacji chemicznej reaktory 1 i 20 które sa stacjonarne, moga byc zastapione przez reaktory rurowe, polaczone szeregowo i zaopatrzone w plaszcz z zabezpieczeniem mozliwosci dodawania . w sposób ciagly roztworu alkalicznego podczas przeplywu mieszaniny reakcyjnej.Taki proces ciagly szczególnie latwo jest przeprowadzic wtedy, kiedy kompleks enzymatyczny zawiera zmodyfikowany wielocukier zwlaszcza kopolimer sacharoza-epichlorohydryna. Dzieki niskiej lepkosci roztwo¬ rów mozliwe jest wykonanie ultrafiltracji bez dodatkowych problemów technologicznych.Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady, w których aktywnosc wyrazona jest w mikromolach kwasu 6-aminopenicylanowego otrzymanego z benzylopenicyliny przy wartosci pH = 7,8 i temperaturze 37°C na minute na gram lub mililitr preparatu.Przyklad I. 1g kopolimeru bezwodnika kwasu maleinowego i estru winylowometylowego o masie czasteczkowej okolo 750 000 (Gantrez AN 149) dodano przy mieszaniu do 100 ml 0,2 molarnego buforu fosforanowego przy wartosci pH = 7,4 i w temperaturze 4°C. Po 3 minutach dodano 5 ml roztworu czesciowo oczyszczonego enzymu deacylazy penicylinowej o aktywnosci 63,4 mikromola/min/ml i calosc mieszano 16 godzin w temperaturze 4°C. Otrzymany lepki roztwór poddano ultrafiltracji przez blone XM—300 (Aminon Corp.), której graniczna wartosc rozdzielacza wynosi 300 000. Roztwór pozostaly po ultrafiltracji przemyto w komorze ultrafiltra i zliofilizowano. Otrzymany kompleks enzymatyczny byl rozpuszczalny w wodzie i wyka¬ zywal aktywnosc 220 mikromoli/min/g w reakcji otrzymywania kwasu 6-aminopenicylanowego z benzylopenicy¬ liny.Pr,z y k l a d II. 10 g polimeru Gantez AN-149 dodano w czasie mieszania do 1 litra 0,2 molarnego buforu fosforanowego przy wartosci pH = 7,4 iw temperaturze 4°C. Po 3 minutach dodano 50 ml preparatu deacylazy penicylinowej uzytej jak w,przykladzie I i calosc mieszano dalej przez 3 godziny. Nastepnie dodano 100 ml 1% roztworu szesciometylenodwuaminy i mieszano przez dalsze 16 godzin. Czesc otrzymanego rozpusz¬ czalnego w wodzie kompleksu enzymatycznego uzyto bezposrednio do enzymatycznej degradacji 6% benzylo¬ penicyliny w ilosci 200 ml przy wartosci pH = 7,8 i w temperaturze 47°C. Wydajnosc deacylacji po 5 godzinach reakcji wynosila 89%.Druga czesc (50 ml) roztworu zawierajacego produkt poddano ultrafiltracji jak w przykladzie I. Liofilizo¬ wany produkt wykazywal aktywnosc 168 mikromoli/min/g.Przyklady III—V. Do otrzymania preparatów uzyto, jako nosnika enzymu, kopolimeru bezwodnika kwasu maleinowego i eteru wynilowometylowego Gantrez AN—169 o masie czasteczkowej okolo 1 125 000.Zwiazania enzymu z nosnikiem dokonano jak w,przykladzie I.Wyniki reakcji z przykladów I—V podane sa w tablicy.Wolny enzym deacylaza Przyklad I Przyklad II ' Przykladni Przyklad IV Przyklad V Stosunek molowy polimeru do enzymu w reaktorze - 2:1 2:1 1 :1 2:1 1 :2 Zawartosc bialka dukcie oznaczona Folina—Ciocaltei wpro- metoda iprzy uzyciu albuminy z surowicy bydlecej jako wzorca mg/ml 55,0/mg/g 52,5/mg/g 43,3/mg/g 18,6mg/g 71#4/mg/g Aktywnosc enzymatyczna mikromo- le/min/ml lub/g 63,4/ml 220/g 168/g 95,5/g 44,5/g 172/g mikromo- le/min/mg bialka 31,7 40,2 32,2 220,0 24,0 24,086 995 5 Przyklad VI. 5g kopolimeru, sacharozy i epichlarohydryny o masie czasteczkowej 400000 (Ficoll) rozpuszczono w 165 wody i przy pomocy 2NaOH doprowadzono odczyn roztworu do wartosci pH.» 10. Do roztworu Ficollu dodano 400 mg bromku cyjanu i calosc mieszano mieszadlem magnetycznym w temperaturze °C, utrzymujac wartosc pH, 11,0 dodajac 2 n NaOH. Po 20 minutach wartosc PH roztworu skorygowano na 8,5 przy pomocy 2 normalnego HCI, po czym mieszano ze 170 ml wodnego roztworu deacylazy penicylinowej (560 mg bialka) o aktywnosci zapewniajacej uzyskanie 6,9 mikromola 6—APA/mg Bialka/Min przy wartosci pH = 78 i w temperaturze 37°C. Mieszanie kontynuowano przez noc w temperaturze 4°C a nastepnie roztwór zatezono przez ultrafiltracje z zastosowaniem blony XM—300 (Amicon Corp) o granicznej wartosci rozdzielczej 300 000. Roztwór pozostaly po ultrafiltracji zawierajacy kompleks Ficoll-deacylaza penicylinowa przemyto w komorze ultrafiltra. Objetosc tej pozostalosci zmniejszono do 44 ml i uzyskany tak produkt przechowywano w temperaturze 4°C. Ma on lepkosc zblizona do wykazywanej przez enzym natywny. Aktywnosc kompleksu Ficolldeacylaza penicylinowa oznaczano jak nastepuje: ml 0,2 m buforu fosforanowego i 5 ml 20% Wag/obj roztworu benzylopenicyliny zmieszano razem i do calosci dodano w temperaturze 37°C 0,1 normalny NaOH do wartosci pH 7,8. Reakcje zapoczatkowano przez dodanie 2 ml roztworu enzymu. Wartosc pH = 7,8 mieszaniny reakcyjnej utrzymywano dodawaniem 0,1 n NaOH. Reakcje prowadzono przez 20 minut, wyniki odczytywno co minute.Stwierdzono w ten sposób, ze kompleks Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa zachowywal 86,2% aktyw¬ nosci enzymu natywnego. Zawartosc bialka w kompleksie Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa oznaczono metoda Lowry, Rosebrough, Farr i Randall z 1951 r. Metoda ta wykazano, ze wydajnos£ wiazania wynosi 87,1%.Przyklad VII. Powtórzono przyklad VI z tym, ze wiazanie enzymu deacylazy penicylinowej z akty¬ wowanym Ficollem zachodzilo przy wartosci pH 10,0. Objetosc koncowa produktu wynosila 40 ml. Wydajnosc wiazania ustalona na podstawie zawartosci bialka w roztworze pozostalym przy ultrafiltracji wynosila 78,5%.Zachowana aktywnosc enzymatyczna wynosila 74,8%.Przyklad VIII. Powtórzono przyklad VI z tym, ze wiazanie enzymu deacylazy penicylinowej z aktywowanym Ficollem zachodzilo przy wartosci pH = 6,0. Objetosc produktu wynosila 35 ml. Wydajnosc ustalona na podstawie zawartosci bialka w roztworze pozostalym po ultrafiltracji wynosila 68%. Zachowana aktywnosc enzymatyczna wynosila 56,7%.Przyklad IX. Powtórzono przyklad VI z tym, ze uzyto dekstranu o masie czasteczkowej 250 000 zamiast Ficollu. Objetosc koncowa produktu wynosila 44 ml. Roztwór kompleksu dekstran-enzym deacylaza penicylinowa wykazywal o wiele wyzsza lepkosc niz kompleks Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa. Wydajnosc wiazania ustalona na podstawie zawartosci bialka w roztworze pozostalym po ultrafiltracji wynosila 73,2%.Kompleks dekstran-enzym deacylaza penicylinowa zachowal aktywnosc enzymatyczna w 75,5%.Przyklad X. Badanie mozliwosci powtórnego uzycia kompleksu enzymatycznego. Roztwór kompleksu enzymatycznego Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa w ilosci 4 ml zawierajacych 44,4 mg bialka, otrzymany jak w przykladzie I, dodano do wodnego roztworu 6,3 g soli potasowej benzylopenicyliny i mieszano w tempera¬ turze 37°C. Utrzymywano stala wartosc pH = 7,8 mieszaniny reakcyjnej przez dodawanie w sposób ciagly 0,1 n NaOH przy uzyciu pH-statu. Proces prowadzono przez 6 godzin, reakcja konczyla sie po okolo 4 godzinach.. Pomiar zuzycia 0,1 n NaOH wskazywal na to, zje wydajnosc otrzymywania 6-APA stanowi 96,2% wydajnosci teoretycznej. Enzym oddzielono od skladników mieszaniny reakcyjnej majacych niska mase czasteczkowa przez ultrafiltracje przez blone o granicznej wartosci rozdzielczej 50 000. Po przemyciu pozostalosci w komorze ultrafiltra woda destylowana, kompleks enzympolimer poddano ponownej ultrafiltracji az do momentu zmniejszenia jego objetosci do 150 ml. Roztwór pozostaly po ultrafiltracji uzyto powtórnie do reakcji z nastepna porcja 6,3 g soli potasowej benzylopenicyliny, która przeksztalcono w 6/APA z wydajnoscia 96,5%. Caly cykl powtórzono jeszcze trzykrotnie uzyskujac 6—APA z wydajnoscia odpowiednio 92,0, 96,0 i 91,0 wydajnosci teoretycznej.Przyklad XI. 18,5 ml kompleksu Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa otrzymanego jak w przykla¬ dzie VI rozcienczono woda destylowana do objetosci 400 ml .i mieszano w temperaturze 37°C i przy wartosci pH = 7,8. Dodano 25 g soli potasowej benzylopenicyliny. Stala wartosc pH = 7,8 mieszaniny reakcyjnej utrzymywano przez dodawanie w sposób ciagly 10 m NH4NH. Proces prowadzono przez 4 godziny. Kompleks enzymatyczny oddzielono od niskoczasteczkowych skladników mieszaniny reakcyjnej przez oddizolowanie ich wobec wody destylowanej przy uzyciu dializatora swiecowego z faldowanym wkladem wlóknistym, model DC 2, Amicon Corporation, Lexington, Mass. USA, którego graniczna wartosc rozdzielcza wynosila 50 000.Nastepnie roztwór enzymu zostal zatezony do okolo 100 ml. Dializator przemyto woda destylowana dwukrot¬ nie po 100 ml, przemywki dolaczono do roztworu kompleksu enzymatycznego i calosc przechowywano pomiedzy poszczególnymi eksperymentami w temperaturze 4°C.W ten sposób wykonano siedem eksperymentów, przy czym wydajnosc reakcji hydrolizy soli potasowej benzylopenicyliny do 6-APA wynosila 93,2%. Wydajnosc odzysku wynosila 99,6% z czego 2,5% stracono6 86 995 w próbkach analitycznych pobieranych w czasie trwania poszczególnych eksperymentów. W celu skompensowa¬ nia strat w kazdym doswiadczeniu wprowadzono do reakcji odpowiednia ilosc swiezego preparatu enzymatyczne¬ go.Przyklad XII. Enzymatyczna hydrolize soli potasowej benzylopenicyliny zuzyciem kompleksu Ficoll-enzym deacylaza penicylinowa wykonano jak w przykladzie XI. Proces prowadzono przez 4 godziny przy wartosci pH = 7,8 i w temperaturze 37°C. Enzym oddzielono od skladników niskoczasteczkowych mieszaniny reakcyjnej w sposób nastepujacy. Objetosc mieszaniny reakcyjnej zmniejszono do okolo 40 ml przez ultrafiltra- cje przez pofaldowana blone wlóknista, której graniczna wartosc rozdzielcza wynosila 50 000. Do koncentratu dodano 20 ml wody destylowanej i zatezanie powtórzono. Obie porcje wymywek polaczono i objetosc calosci zmniejszono do 120 ml przy uzyciu wyparki obrotowej w temperaturze 35°C. Do koncentratu dodano w stosunku objetosciowym 1 :1 keton metylowoizobutylowy (Ml BK) i calosc energicznie mieszano w chlodzo¬ nym naczyniu metalowym. Po obnizeniu temperatury do 4°C do mieszaniny dodawano powoli kwas azotowy az do wartosci pH = 4,3. Mieszanie kontynuowano jeszcze przez 30 minut. Wytracony 6—APA odsaczono, przemyto Ml BK, woda, acetonem, po czym suszono przez noc w temperaturze 37°C.Przyklad XIII. Enzymatyczna hydrolize soli potasowej benzylopenicyliny wykonano jak w przykla¬ dzie XI z tym, ze zastosowano sól potasowa benzylopenicyliny w stezeniu wyzszym, to jest 9% wag/obj, uzywajac 27 g substratu w objetosci reakcyjnej 300 ml oraz z tym, ze podwojono stezenie kompleksu Ficoll-er zym deacylaza penicylinowa w stosunku do uzytego w przykladzie XI. Proces prowadzono przez 4 godziny w temperaturze 37°C i przy wartosci pH = 7,8. W tych warunkach uzyskano 6-APA z wydajnoscia 93,2%. PL