SU578834A3 - Способ получени 6-аминопенициллановой кислоты - Google Patents

Description

гивностыо при получении 6-аминопенищллановоа кислоты.

Эти ферментные комплексы обладают низкой в зкостью, что позвол ет легко выдел ть их ультрафилътранией из реакционной смеси.

Водорастворимые комплексы могут быть получены любым из известных методов присоединени  ферментов к полимерам, например, присоединением деэцилазного фермента к полимеру (сочетание с полимером) путем использовани  таких реагентов, как галогенцианы (бромциан), 5-1риазинов (2 - амин - .4,6 -дихлор - S- триазин), азидов (2 - оксн - 3 - (п - диазофенил) - пропиловый эфир), органических цианатов (фенилцианат), а также диорганокарбодиимидов.

В некоторых случа х ферменты реагируют непосредственно с полимером, если в нем содержатс  после модифицировани  некоторые активные группы , такие как ангидридные св зи, аминэтильные, оксизтильные или карбоксиметильные заместители.

Комплексы могут быть получень также св зыванием фермента с водонерасгаоримым по.пимером , таким как декстран с поперечными св з ми в молекуле, а затем приданием образующемус  комплексу водорастворимости процессом разложеНИН , например частичным гидролизом или взаимодействием декстрана с поперечными св з ми с декстраназой.

Фермент способен присоетшн тьс  к полимеру посредством мостиков, образованных, например, из диальдепадов, таких как глиоксоль или глицеральдегид и/шш диаминов, таких как 1,6-гексаметилендиамин или этилендиамин, и/или из a-w - аминоалифатической карбоновой кислоты, такой как глицин . или б-аминогексанова  кислота.

Деавдлаз ый фермент пенициллина можег быть присоединен к полимеру вшироких пределах соотношений полимер: фермент, например, 0,1 - 100:1, предпочтительным  вл етс  соотношение полимер: протеин 2:1-20:1,

После получени  в.одорастворимый комплекс ощщают перед ультрафильтрацией или хроматографией . Ультра фильтрационное оборудование имеет п6лупрош1цаемую оболочку (мембрану) с пределами исключени , обеспечивающими прохождение лишь низкомолекул рных веществ, но не высоко моле кул рных.

Предел исключени  выбираю согласно молекул рному весу комплекса таким образом, чтобы гарантировать прохожде{ше 6-аминопенициллановой кислоты и задержку ферментполимерного комплекса, который регеиерируют дл  повторного использовани .

Пример 1.5г фиколла мо;1екул рного веса 400000 раствор ют в 165мл воды и довод т рН раствора с помощью 2 н. NaOH до 10. Залем к раствору добавл ют 400 мг циаиогеибромида, перемешивают магнитной мешалкой, поддержива  температуру 20° С. рН поддерживают 11,0 добавлением 2 н. NROH. Через 20 мин после добавк(- дааногенбромида раствор довод т до рН 8,5 с помощью 2 н. HCI и смешивают со 170 мл водного раствора .ллиндеацилазы (560 мг протеина), обладающего такой активностью, котора  позвол ет получать 6,9 ммолей б-аминопенициллановой кислоты на 1 мг протеина в 1 мин при рН 7,8 и 37° С. Раствор перемешивают в течение ночи при 4° С, а затем концентрируют ультрафильтрацией через мембрану Эмикон ХМ-300, имеющую номинальный молекул рный вес 300000. Задержанное в ультрабильтрационной SPKKKS вещество, содержащее фиколл-пеницшшиновьш деаи лазный комплекс, промьгоают, уменьшают его объем до 44 мл, и продукт хран т при А С. Задержанное вещество обладает в зкостью, сходной с в зкостью нативиого фермента.

Активность фиколл-пенициллиндеацилазного комплекса сй1{жделлют следующим образом. Фосфатный буфер и бензилпенициллиновый раствор стабилизируют при 37°С до рН7,8 добавкой 0,1 н. NaOH. Дл  начала реакции добавл ют 2 мл энзимного раствора, рН реакции поддерживают на уровне 7,8 добавлением 0,1 н. NaOH. Реакци  протекает 20 мин, и каждую минуту провод т отсчет.

&о олл-пенициллиндеацилазнь1й ферментный комплекс удерживает 86,2% активности нативного фермента. Содержание протеина в комплексе устанавливают методом Лаури, Розенбру, Фэрр и Рэндалл . Общий выход сочетани  87,1%.

П р и м е р 2. Повтор ют опыт по методике примера 1, но рН, при котором проходит сочетание деаиилазы пеиицил шна и активированного фиколла , равно не 8,5, а 10,0. Объем конечного продукта 40 мл. Общий выход сопр женного вещества на основе протеина, задержанного в продукте ультрафильтрации , составл ет 78,5, ферментна  активность 74,8%.

Пример 3. Методика аналогична примеру 1, но рН, при котором происходит сочетание между деацилазой пеницил.1шна и активироваршым фиколлом , равно 6,0. Объем конечного продукта 85 мл. Общий выход сопр женного вещества на основе протеина, задержанного в продукте ультрафильтрашш , 68%, Ферментна  активность в задержанном продукте 56,7%.

Пример 4. Методика а }алогична примеру 1, по вместо фиколла используют декстран с молекул рным весом 250000. Объем конечного продукта 44 мл. Раствор (екстран-пенищ{лли1ювого деацилазного комплекса значительно более в зок, чем у деацилазного комплекса фиколл-пенициллина. Общий выход продукта сочетани  на основе удержанного протеина 73,2%. Ферментна  активность, задержаго )а  в деацилазном комплексе декстранпенициллина , 75,5%,

Пример 5. Исследование повторной применимости .

Раствор деацилазного комплекса фиколл-пенициллина , приготовле}шый по методике примера 1, добавл ют к раствору 6,3 г калиевого бензилпени .циллина в воде и перемеилшают при 37° С.Величину рН реакционной смеси поддерживают на уровне 7,8 непрерывным введением 0,1 и. ISIaOH с использованием тритриметра. Реакци  завершаетс  через 4 ч, хот  продолжаетс  6 ч. Выход 6-аминопенициллановой кислоты 96,2% теоретического. Фермент отдел ют от реагирующих веществ небольшого молекул рного веса ультрафильтрацией через мембрану с молекул рнь1М весом -5СЮОО. После промывки фермента в ультрафильтрационной  чейке дистиллированной водой ферментный полимер снова подвергают ультрафильтрации до тех пор, пока объем не понижаетс  до 150мл. Задержанное вещество используют повторно дл  конверсии дальнейшей загрузки 6,3 г калиевого бензилпенициллина, который перевод т в 6-амннопенициллановую кислоту эффективностью 96,5%. Весь цикл повтор ют еще три раза, причем выход б-аминопенициллановой кислоты составл ет соответственно 92,0, 96,0 и 91,0% от теоретических величин.

Пример 6. 18,5 мл деацилазного комплекса фиколл-пенициллина, приготовленного по методике примера 1, довод т йо 400 мл дистиллированной водой и перемешивают при 37°С и рН7,8. Добавл ют 25 г калиевого бензилпенициллина, и рН поддерживают посто нным7,8 непрерывным введением Юн. NH4OH. Реакцию провод т 4ч. Фермент отдел ют от реагирующих веществ малого молекул рного веса диализом против дистиллированной воды, использу  диализер из полого волокна с диализирующим патроном с молекул рным весом 50000, фермент1П1Ш раствор концентрируют до 100 мл. Установку диализа промывают аликвотными количествами дистиллированной воды 2 «100 мл, а затем все смешивают с ферментным раствором и хран т при 4° С между каждым из экспериментов.

Семь последовательных экспериментов показали , что эффективность, с которой гидролизуетс  калиевый бензитшенициллин дл  образовани  6-аминопенициплановой кислоты, составл ет 93,2%, эффективность регенерации ферментов - 99,6%, из которых 2,5% тер етс  в пробах, вз тых в течение каждого эксперимента. Перед каждым ог1ытом добавл ют свежий фермент дл  компенсации любых потерь.

Пример 7. Провод т ферментный гидролиз калиевого бензилпенициллина с использованием

деацклазного комплекса фиколл-пенициллина по методу, описанному в примере 6. Реакцию провод т 4ч при рН7,8 и 37° С. Фермент отдел ют от реагиРУЮ1ЦИХ веществ небольшого молекул рного веса следующим образом. Объем реакционной смеси снижают до 40 мл ультрафильтрацией через мембрану из полых волокон с молекул рным весом 50000. К концентрату добавл ют 20 мл дистиллированной воды, и процесс концентрации повтор ют. Наливают два аликвотных объема жидкости и уменьшают объем до 120 мл во вращающемс  испарителе при 35° С. К концентрату добавл ют равный объем метилизобутилкетона, и смесь сильно перемешивают в охлажденном металлическом сосуде. Когда температура падает до 4° С, медле(шо добавл ют азотную кислоту до рН 43. В течение дальнейших 30 мин продолжают перемешиBaiffle . Вьшавшую в осадок 6-аминопенициллановую кислоту регенерируют фильтрацией, промывают метилизобутилкетоном , водой и ацетоном и высушивают в течение ночи при температуре 37° С.

Пример 8. Провод т ферментный гидролиз калиевого бензилпенициллина, как описано в примере 6, но при повышенной концентрации калиевого бензилпенидаллина (9% вес./об.), использу  27 г субстрата в реакцио нном объеме 300 мл, причем ферментна  концентраци  превышает вдвое ту, котора  используетс  в примере 5. Реакцию провод т 4 ч при рН 7,8 и 37°С. Получают 6-аминопенициллановую кислоту с выходом 93,2%.

Claims (1)

1. Выложенна  за вка Франции № 2019083, кл.С 12 D 13/00, 1970.