SU1228788A3 - Способ получени иммобилизованной аминоацилазы - Google Patents

Способ получени иммобилизованной аминоацилазы Download PDF

Info

Publication number
SU1228788A3
SU1228788A3 SU823411449A SU3411449A SU1228788A3 SU 1228788 A3 SU1228788 A3 SU 1228788A3 SU 823411449 A SU823411449 A SU 823411449A SU 3411449 A SU3411449 A SU 3411449A SU 1228788 A3 SU1228788 A3 SU 1228788A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
acrylamide
aminoacylase
buffer solution
copolymer
enzyme
Prior art date
Application number
SU823411449A
Other languages
English (en)
Inventor
Борош Ласло
Дароци Иван
Хубер Ирен
Ивони Йожефне
Кишш Яношне
Саяни Бела
Original Assignee
Реанал Финомведьсердьяр (Инопредприятие)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Реанал Финомведьсердьяр (Инопредприятие) filed Critical Реанал Финомведьсердьяр (Инопредприятие)
Application granted granted Critical
Publication of SU1228788A3 publication Critical patent/SU1228788A3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

I
Изобретение относитс  к способам получени  иммобилизованных ферментов конкретно к способу получени  иммобилизованной аминоацилазыj примен емой дл  расщеплени  В1,-аминокислот.
Установлено, что на основе фермента аминоацилазы может быть получен иммобилизованный ферментный препарат с высокой активностью в результате присоединени  фермента к носителю, полученному частичным гидролизом сополимера акриламида и N,N -метилен- -бис-акриламида типа Akrilex P l
Целью изобретени   вл етс  повьше ние специфической активности фермен- тов.
Сущность способа заключаетс  в том, что если этот сополимер подвернуть гидролизу кислотой (например, сол ной кислотой или другой сильной кислотой) или щелочью (например, гидроокисью натри ), углекислым натрием или другим сильным основанием, то приблизительно 50%-CO-NH -групп преращаетс  в карбоксильные группы, в то врем  как остальна  часть-СО-Ш -групп в жестких услови х проведени реакции не распадаетс . Таким обра-- ;зом, в гидролизованном сополимере между карбоксильными группами вкли- ниваютс  неизменные-СО-МНо-группы, которые подл.ерживают карбоксильные 1 руппы в благопри тном пространственом положении.
Когда фермент аминоацилазы присоедин ют к образовавшимс  карбоксильным группам в результате известного активировани  карбодимидом, фиксированные молекулы фермента вследсвие благопри тного пространственног расположени  карбоксильных групп не преп тствуют друг другу выполн ть свою функцию.Б результате этого препарат фермента отличаетс  очень выской специфичной активностью.
Предлаг аемый способ осуществл етс  следующим образом. Частично гидроли- зованный сополимер, образовавшийс  в результате кислотного или щелочного гидролиза сополимера акриламида и К,ы -метилен-бис-акриламида типа . Akrilex Р, обрабатывают растворимым Е воде или растворимым при температуре ниже О С в органическом растворителе карбодиимидным соединением и на акти- Еированньш указанным способом носитель нанос т аминоцилазу в растворе со значением рН 6, 5-8,0. Полученный продукт
5
0 5 0
5
0
5
0
5
промывают,после чего в нужном случае сушат.
При осуществлении способа в- качестве фермента может быть применена выделенна  любым известным способом аминоацйлаза любого происхождени , однако наиболее предпочтительно примен ть в качестве исходного вещества фермент, выделенный из почек млекопитающих .
Дл  активировани  частично гидро- лизованного сополимера типа Akrilex Р в качестве карбодиимидного соединени  могут быть применены, например, 1-циклогексил-3-(2-морфоли- ноатш -карбодиимид-мето-п-толуол- сульфонат или 1-этил-3-(3 -диметил- аминопропил)-карбодиимид. В качестве карбодиш-шдного-соединени  наиболее предпочтительно примен ть растворимые в воде вещества. Среди карбоди- имидных соединений, растворимых только в органических растворител х, при осуществлении способа могут быть применены лишь такие производные, которые в примен емом растворителе имеют соответствующую растворимость при низкой температуре (т.е. ниже ).
, На активированный носитель амино- ацилазу нанос т из раствора со значением рК 6,5 - .8,0, причем наиболее предпочтительно, когда рН гэтого раствора составл ет около 7,G. Наиболее целесообразно раствор ть аминоацилазу в 0,1 М буферном растворе фосфата кали  (рН 7,0).
Образовавшийс  в результате реакции св зывани  препарат фиксированного фермента промывают известным способом , после чего в нужном случае сушат . Однако содержащий фермент препарат может быть приготовлен в присутствии соответствующих стабилизаторов, например азида натри  в виде суспензии .
Специфична  активность полученного по изобретению препарата, содержащего фиксированный фермент, соста в- л ет 150-200 ед.мг ксерогел , что в сравнении с активностью 0,55 - 2,24 ед.мг ксерогел , достигаемой при осуществлении известного способа, означает повышение активности по крайней мере на два пор дка.
При исследовании препаратов нового типа, содержащих иммобилизованный фермент, пришли к выводу, что в результате иммобилизации возрастает
3
стабильность фермента при значени х рН, лежащих в основной области, что особенно благопри тно в случа х, когда препарат иммобилизованного фермента примен ют дл  расщеплени  DL- аминокислот.
Пример 1.30г ксерогел  Akrilex суспендируют в 1 л 1 и. водного рас-твора гидроокиси натри . Суспензию выдерживают 3ч при 50 С. Набухший гель промывают до нейтральной реакции 12 л дистиллированной воды, после чего промывку продолжают 10,5л 0,05 н. сол ной кислотой. Наконец, гель промывают 30 л дистиллированной воды. Промытый гель подвергают лиофилизации.
Получают 26 г .носител  фермента, св зывающа с  емкость которого составл ет 6,14 М-ЭКВ. г.
Пример2. Юг ксерогел , полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 500 мл буферного раствора фосфата кали  (рН7,0) Затем к приготовленной суспензии на вод ной бане, охлаждаемой льдом, прибавл ют гфи энергичном перемешивании полученный с 250 мл холодного ) буферного раствора раствор 20 г 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)- . -карбодиимид-мето-п-толуолсульфона- та. После 10 мин перемешивани  к реакционной смеси прибавл ют полученный с 250 мл холодного () буферного раствора раствор 5 г аминоаци- лазы. Суспензию перемешивают 48 ч при + 4°С, затем гель отдел ют и промывают 3 раза 1 л О,1М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,0), 3 раза 1 л 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,0), содержащего 0,5 моль хлористого натри , и, наконец , 3 раза 1 л 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,0). Затем гель 4 раза промывают 2,5 л дистиллированной воды с целью удалени  соли и провод т лиофилизацию.
Выход: 18 г фиксированной амино- ацилазы. Активность:гидролиз
158 мкмоль N-aцeтил-L-мeтиoнинa (ч/мг) 50 сухого вещества.
Пример 3. Юг ксерогел , полученного в соответствии с примером 1 , суспендируют в 500 мл О,1 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,0). Затем на охлаждаемой льдом вод ной бане и при энергич
5
0 15
20
5 о
5
0
5
0
5
7884
ном перемешивании к суспе 1зии прибавл ют полученный с 250 мл холодного (+4 С) буферного раствора раствор 10 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)- -карбодиимида. После И) мин перемешивани  к реакционной смеси прибавл ют полученньп с 250 мл холодного ( + 4 С) буферного раствора раствор 5 г амино- ацилазы. Суспензию перемешивают 48 ч при +4 с, гель отдел ют и промывают 3 раза 1 л О,1 М буферного раствора фосфата кали , 3 раза 3 л 0,1 М буферного раствора фосфата кали , содержащего 0,3 моль хлористого натри , 3 раза 1 л О,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,0) и, наконец, 4 раза 2,5 л дистиллированной воды. Отмытый от солей гель подвергают лиофилизации .
Выход: 16 г фиксированной амино- ацилазы. Активность: гидро.гшз 202 мкмоль Ы-ацетил-Ь-метионина(ч/мг) сухого вещества.
Пример 4. 0,5 г ксерогел , полученного в соответствии с примером 1 ,.суспендируют в 25 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 6,0) и затем добавл ют к полученной суспензии при охлаждении на лед ной вод ной бане и посто нном перемеишва- нии холодный (+4 С) раствор 1 г 1- -циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-кар- бодиимид-мето-п-толуолсульфоната в 12-,5 мл буферного раствора. После 10 мин перемешивани  к реакционной смеси добавл ют раствор 0,25 г амино- ацилазы в 12,5 мл холодного (+4 с) буферного раствора. Суспензию перемешивают 48 ч при +4 С, гель отдел ют и промывают его последовательно трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 6,0), трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 6,0), содержащего 0,5 М хлористого натри , трижды 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 6,0) и четырежды 125 мл дист1 л- лированной воды. Отмытый от соли гель лоифилизируют,
Выход: 0,68 г иммобилизированной аминоацилазы. Активность: гидролизу 21,4 мкмоль Ы-ацетил-Ь-метионина (ч/мг) сухого вещества.
Пример 5. 0,5 г ксерогел , полученного в соответствии с примером 1, суспендируют в 25 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 8,0) и добавл ют к суспензии при охлаждении на лед ной вод ной бане.
5 1/1287886
при посто нном перемешивании растворфата кали  (рИ 8,0), 3 раза 50 MJT
1 г 1-циклогексил-3-(2-морфолино-0,1 М буферного раствора фосфата
этил)-карбодиимид-мето -п-толуол-суль-кали  (рН 8,0), содержащег-о 0,5 М
фоната в .12,5 мл холодного (+4 С)хлористого натри , 3 раза 50 мл О, 1 М
буферного раствора. После 10 мин буферного раствора фосфата кали 
;ремешивани  к реакционной смеси до-(рН 8,0) и 4 раза 125 мл дистиллиробавл ют раствор 0,25 г аминоацилазыванной воды. Отмытый от соли гель
в 12,5 мл холодного () буферноголиофилизируют. .
раствора. Суспензию перемешиваютВыход: 0,78 г иммобилизированной
48 ч при , гель отдел ют и про- О аминоацилазы. Активность: гидролиз
мывагот его последовательно 3 раза52,9 мкмоль N-aцeтил-L-мeтиoнинa
50 мл 0,1 М буферного раствора фос-(ч/мг) сухого вещества.

Claims (1)

  1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИНОАЦИЛАЗЫ путем связывания ее с активированным носителем, представляющим собой синтетический полимер на основе акриламида, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности ферментов, в качестве носителя используют гидролизованный на 50^ сополимер акриламида и Ν,Ν -метилен-бис-акриламида, активированный водорастворимым карбодиимидом,· процесс ведут при pH 6,5-8,0.
SU823411449A 1980-07-17 1982-03-16 Способ получени иммобилизованной аминоацилазы SU1228788A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU801782A HU182171B (en) 1980-07-17 1980-07-17 Process for isolating aminoacylase enzyme from kidney of mammalians

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1228788A3 true SU1228788A3 (ru) 1986-04-30

Family

ID=10956173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU823411449A SU1228788A3 (ru) 1980-07-17 1982-03-16 Способ получени иммобилизованной аминоацилазы

Country Status (6)

Country Link
EP (2) EP0059182B1 (ru)
JP (1) JPS6033475B2 (ru)
DE (1) DE107212T1 (ru)
HU (1) HU182171B (ru)
SU (1) SU1228788A3 (ru)
WO (1) WO1982000253A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU184468B (en) * 1981-07-17 1984-08-28 Reanal Finomvegyszergyar Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation
US6235516B1 (en) 1996-04-25 2001-05-22 Novartis Ag Biocatalysts with amine acylase activity

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2769749A (en) * 1953-02-24 1956-11-06 Armour & Co Method of extracting and purifying acylase
CH453269A4 (ru) * 1968-03-29 1973-01-31
US3616231A (en) * 1968-11-14 1971-10-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the production of uricase
GB1289549A (ru) * 1969-12-18 1972-09-20
GB1352739A (en) * 1971-09-01 1974-05-08 Aspro Nicholas Ltd Polymer-enzyme complexes
GB1444539A (en) * 1972-09-11 1976-08-04 Novo Industri As Immobilised enzymes
US3933589A (en) * 1975-03-20 1976-01-20 Owens-Illinois, Inc. Chemical immobilization of enzymes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. Amer. Chem. Soc. 1959, 81, 4024. Macromolecules 1971, 4, 350. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1982000253A1 (en) 1982-02-04
EP0107212A1 (en) 1984-05-02
EP0059182B1 (en) 1984-11-21
EP0059182A1 (en) 1982-09-08
DE107212T1 (de) 1984-10-25
JPS6033475B2 (ja) 1985-08-02
JPS57501260A (ru) 1982-07-22
EP0107212B1 (en) 1986-07-09
EP0059182A4 (en) 1982-10-14
HU182171B (en) 1983-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tosa et al. Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenan as matrix
Ståhl et al. The synthesis of a D-amino acid ester in an organic media with α-chymotrypsin modified by a bio-imprinting procedure
US3619371A (en) Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
US4247642A (en) Enzyme immobilization with pullulan gel
US4434228A (en) Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US3971700A (en) Process for the enzymatic resolution of DL-phenyl glycine amide into its optically active antipodes
US4260684A (en) Stereoselective resolution of phenylglycine derivatives and 4-hydroxyphenylglycine derivatives with enzyme resins
US4335209A (en) Process for preparation of L-tryptophan by enzyme
US3883394A (en) Water-insoluble penicillin acylase
US4389489A (en) Optically pure heterocyclic aminoacid compounds, a process for their use for the synthesis of medicaments
US4439524A (en) Stereoselective resolution of phenylglycine derivatives with enzyme resins
US3880713A (en) Cephalosporin compounds
US4170696A (en) Enzyme-immobilization carrier and preparation thereof
SU1228788A3 (ru) Способ получени иммобилизованной аминоацилазы
Erarslan et al. Kinetic investigation of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105 immobilized on oxirane–acrylic beads
US4239854A (en) Enzyme-immobilization carriers and preparation thereof
EP1088887A1 (en) Crosslinked enzyme aggregates
DE2366180B1 (de) Enzymanlagerungsprodukt
US3919048A (en) Insoluble carrier-bound enzymes
Coughlin et al. Preparation and properties of soluble–insoluble nicotinamide coenzymes
McDougall et al. Enzymic acylation of 6-aminopenicillanic acid
US4608340A (en) Immobilized aminoacylase enzyme
Szewczuk et al. Properties of penicillin amidase immobilized by copolymerization with acrylamide
DD263663A7 (de) Verfahren zur herstellung eines immobilisierten cholinestetase-praeparates
US3536587A (en) Enzyme resin and a process for the preparation thereof