JPS58183094A - 固定化酵素の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、触媒等として用いられる固定化酵素の製法
に関する。

食品工業や医薬品工業等において省エネルギー。

省資源臘の生産手段の一つとして酵素を触媒とした反応
が用いられている。酵素は常温、常圧の緩やかな条件下
で高特異性、高効本の反応を行なわせることができるか
らである。従来、酵素を触媒とする反応（＃素反応）は
、主として水浴液中において、酵素を溶解させた状態で
行ない、使用した酵素を反応毎に廃液とともに排出する
、ｉわゆるパッチ方式で行なって来た。酵素を反応廃液
から分離回収して再利用することは技術的にほとんど不
可能であったからである。しかし、酵素は高価であるの
で、酵素を何らかの手段で水不爵性にする等して固定化
し、酵素不溶化組成物等の固定化酵素を基質と連続的に
接触させるようにして酵素を連続使用１反復利用するこ
とが考え出された。

ところで、酵素は酵素活性を発現するために補＃１ｇを
必要とする場合が多い。九とえば、脱水素反応系に関与
する酵素はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰ）等のｔｓ素を必要とする。この補酵素を固
定化すること４考え出されている。従来では、＃水を固
定化した場合は補−嵩を固定化せず、逆に補＃素を固定
化した場合は酵素を固定化しないというように、酵素。

補酵素のどちらか一方のみを固定化するようにしてい友
。そのため、反応の操作上および経済面で次のような開
運があった。すなわち、固定化され九酵素あるいは補酵
素は連続使用することができるが、固定化されない方は
反応のたびに基質と共に反応系に加える必要があり、反
応操作が繁雑となるという問題である。固定化酵素や固
定化補酵素に対し、固定化されていない補酵素や酵素を
結合させておいたとしても、酵素と補酵素の間の結合は
比較的弱いため、固定化＃累や固定化補酵素を反応液か
ら分離するときに、固定化されていない方が脱落してし
まうことが多い。そのため、単に不経済であるばかシで
なく、脱落した酵素や補酵素が反応生成物中に混入して
反応生成物の純度を低下させるという問題もある。さら
に、固定化酵素や固定化１ｓ＃嵩に補酵素や酵素が結合
する際、立体障害が生じて互いに結合することが紡げら
れ、ｌ！Ｉ＃素活性が低ドする恐れがあるという問題も
あった。

この発明はこのような問題を解決するため罠なされたも
ので、この発明にかかる固定化酵素の製法によれば、＃
素泊性が高く、反応のたびに酵素あるいは補酵素を添加
する必要がなく、しかも、反応生成物の純度を低下させ
ない固定化酵素を得ることができる。

すなわち、この発明は、酵素と補酵素をあらかじめ結合
させておいて固定化することを特徴とする固定化＃素の
製法をその要旨とする。以下、この発明の詳細な説明す
る。

酵素として、たとえば、アルコール脱水素酵素。

アルデヒド脱水素酵素、乳酸脱水素＃素、リンゴ酸脱水
嵩酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ブドウ糖−６−リン
酸脱水嵩＃素等の脱水素酵素を使用する場合は、補＃素
としてＮＡＤ、ＮＡＤＰ等を使用する。＃素として用い
られるのは、前記脱水素酵素に限られるものではなく、
たとえば脱水素帥嵩以外の酸化還元酵素、あるいは加水
分解酵素等が用いられる場合もある。もちろん、この場
合は、補酵素としては、これらの＃素と結合し、酵素を
活性にさせるものが用いられる。このような＃素および
補酵素の組合せのうちの少なくとも１種が使用される。

酵素と補酵素は、たとえば次のようＫして結合させる。

すなわち、各種脱水素酵素とこれに対応する補酵素の組
合わせの場合は、両者を水に溶解させるのである。必要
に応じて、両者をｐＨ緩衝液に添加し、混合する。たと
えば、アルコール脱水素酵素とＮＡＤを結合させる場合
は、ｐＨ＆５〜９．５、最も好ましくはｐｉｔ　７．　
Ｑ付近に調整したリン酸塩緩衝液その他の緩衝液等に両
者を懸濁させる。このように：＃素と補酵素をあらかじ
め結合させて酵素活性を発現させ、酵素活性を保持させ
たまま次に述べるようにして両者を固定化（不溶化）す
る。

酵素を固定化する方法は、一般に、架橋法、包括法およ
び担体結合法の三つの方法に大別することができる。も
つとも普通の場合について述べれば、架橋法は酵素を２
個もしくはそれ以上の官能基を有する試薬と反応させる
方法、包括法は＃翼をゲルの徴−な格子の中に包み込ん
だり、半透性のポリマーの皮−によって被覆する方法、
担体結合法は水不浴性の担体に酵素を結合させる方法で
ある。このような方法を使用して互いに結合された酵素
と補＃素を同時に固定化するのである。

架橋法を採用する場合は、架橋剤として、たとえば、グ
ルグルアルデヒド、ビスジアゾベンジジン、ヘキすメチ
レンジイソシアナート、トルエンジイソシアナート、へ
中ナメチレンジイソチオシアナート、Ｎ−Ｎ’−エチレ
ンビスマレインイミド。

Ｎ−Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド等ヲ用
いる。これらのうちの２１１以上を併せて用いる場合も
ある。互いに結合された酵素と補酵素および架橋剤を水
浴液中で反応させる等すれば固定化酵素が得られる。

包括法を採用する場合は、包括剤として、アクリルアミ
ドモノマー、ポリアタリルアンド、ビニルピロリドンモ
ノマー、ポリビニルピロリドン。

ポリビニルアルコール、ホリエテレン／　ＩＪ　：ｆｆ
　−ルアクリレート、にニトロ中ジアルキルメタアクリ
レート、アクリル酸、コラーゲン、カラギーナン。

セルロース、アルギン酸、寒天等の合成有機物。

多糖類あるいはこれらの誘導体等を用いる。これらのう
ちの２種以上を併せて用いる場合もある。

互いに結合させた静翼と補酵素および包括剤を水に加え
て水浴液とし、包括剤をゲル化させたりあるいは包括剤
に皮膜をつくらせる等すれば固定化酵素が得られる。

担体法を採用する場合は、担体として、ビーズ状ガラス
、パーナイト、ゼオライト、シラスバルーン、デキスト
ラン、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン
、ポリウレア、ポリウレタン等を用いる。これらのうち
の２種以上を併せて用いる場合もある。互いに結合させ
た＃累と補酵素に担体の官能基を反応させる等すれば、
固定化酵素が得られる。

このようにして得られる固定化酵素は、＃素と補酵素が
互いに結合し、酵素活性が発した状部で固定されている
と推定される。したがって、静翼あるいＦｉ−＃素が脱
落する恐れが少なく、立体衝害が生じて＃素泊性が高く
ならないといったようなことがほとんどない。

この発明にかかる固定化＃累の製法はこのように構成さ
れるものであって、酵素と補＃素をあらかじめ結合させ
ておいて固定化するようにしたので、この製法により得
られた固定化酵素を触媒として使用すると、生成物の純
度が向上し、反応性がよい。また、この製法により得ら
れた固定化酵素は、＃嵩および補＃素がどちらも固定化
されて＾ない系、あるいは酵素および補酵素の一万のみ
が固定化さ４ている系に比べ酵素活性の安定性が増加す
る。

つぎに、実施例および比較例にっ匹て説明する。

互いに結合した＃ｍシよび補酵素を固定化する緻、実施
例１〜３は架４１法、実施例４〜６は包括法を採用した
。

〔実施例１〕 これは、酵素としてアルコール脱水素酵素を、補酵素と
してＮＡＤｔ七れぞれ使用し、架橋剤としてグルグルア
ルデヒドを使用して、これらを固定化した例である。

＃母から得られたアルコール脱水素酵素１０ｍｇとＭＡ
Ｄ　Ｑ、　２　呵をＳ℃の蒸留水１０ｍ１に浴解させた
。

この−素の水ｔｉ液に２５憾のグルタルアルデヒド水澄
液Ｑ、１ｇを加えて、２時間撹拌した後、この水浴液を
濾過してアルコール脱水素＃素−ＮＡＤ結合朦固定化酵
素を得た〇 この固定化酵素に含まれると同型、同量の＃素および補
酵素を比較例１とした。

実施例１で得られた固定化ｒＩＩ素、および比較例１の
―嵩と補酵素を用いて、３５℃のリン酸緩衝液中でアル
コール脱水素反広奢行なった。たにし、基質濃度はＱ、
１Ｍとした。両者の比活性の経時変化を第１表に示す。

菖１表 第１表かられかるように、実施例１により得られた固定
化＃素は、比較例１の＃素および補酵素に比べ静翼活性
が安定している。

〔実施例２〕 これは、酵素としてアルデヒド脱水素酵素を、補酵素と
してＮＡＤをそれぞれ使用し、架橋剤としてグルタルア
ルデヒドを使用して、これらを固定化した例である。

アルデヒド脱水素＃累１５ｍｇとＮＡＤ　０．４ｍｇを
４５℃の蒸留水１０ｍ１Ｋ＃ｌ解させた。この酵素の水
浴液に２５慢のグルタルアルデヒド水溶液Ｑ、ｌ　Ｓｇ
を加えて２５時間回転撹拌をした後、この水浴液を濾過
して、アルデヒド脱水素酵素−ＮＡＤ結合１１固定化酵
素を得た。

この固定化＃素に含まれると同臘、同量のアルデヒド脱
水素酵素およびＮＡＤを比較例２とした。

実施例２で得られた固定化＃素、および比較例２の酵素
と補酵素を用いて、３５℃、　ｐＨ７，５のリン酸緩衝
液中でアルデヒド脱水素反応を行なった。

ただし、基質濃度は０．１　Ｍとした。両者の比活性の
経時変化をａＥ２表に示す。

槙２表 ！Ｉ２表かられかるように、実施例２により得られえ固
定化酵素は、比較例２の酵素および補酵素に比べ酵素活
性が安定している。

〔実施例３〕 酵素としてグルタミン酸脱水素酵素を、補酵素としてＭ
山をそれぞれ使用し、架橋剤としてグルタルアルデヒド
を使用してこれらを固定化した。

固定化の方法は実施例１と同様の方法である。比較＠３
は、実施例３で得られた固定化酵素に含まれると同量、
同量の酵素および補酵素とした。さらに、比較例４とし
て、実施例１におけると同様の方法により、グルタミン
ｍ脱水嵩ａｌ素のみを同量−走化した・ 実施例３で得られた固定化＃素、比較例３０酵素および
補酵素、および比較例４で得られ九固定化酵素を使用し
、グルタミン酸の脱水素反応を行なった。ただし、比較
例４の固定化酵素を使用する際、実施例３で擾られた固
定化酵素に含まれると同量、同型のＮＡＤを、基質と同
時に反応系Ｋｆｇ加した。王者の比活性の経時変化を第
３表に示す。

第３表 第３表かられかるように、実施例３により得られた固定
化＃素は、比較例３の＃素および補酵素や比較例４０＃
素のみを固定化した固定化酵素に比べ酵素活性が安定し
ている。また、実施ｆ４３の固定化＃素は比較例４の固
定化酵素に比べ、静翼活性が高い。

〔実施例４Ｊ これは、酵素としてアルコール脱水素酵素を、補酵素と
してＮＡＤをそれぞれ使用し、包括剤としてコラーゲン
を使用して、これらを固定化した例である。

＃母から得られたアルコール脱水素酵素１０ｍｇとＮＡ
Ｄ　０．２　ｍｇを蒸留水１０ｍ１に浴解させた。この
水浴液にあらかじめ４５℃に保幌しておいた４、０嚢ゲ
ニ二−ゲルＷＧ水爵液（コラーゲンを含む水浴ｔ）を加
えてよく混合した。この水浴液を２９６塩化カリウム水
浴液中に滴下し、ゲル化を行なった。

得られたゲルをＪＩ＊水で洗浄し、アルコール脱水素酵
素−んす結合１１固定化＃累２４．２ｇを得た。このよ
うにして得られた固定化ａｔ素に使用したと開蓋、同量
のアルコール脱水素とＮＡＤを比較例５とした。

実施例４で得られた固定化酵素および比較例５の＃素と
１ａ＃嵩を用ｗ、ｐＨ＆Ｏｉｃ＆１４ｆｉした３５℃の
りン鹸緩衝液中でアルコール脱水嵩反応を行なつ九。両
者の比活性の経時変化を第４表に示す。

第４表 第４表かられかるように、実施例４により得られた固定
化酵素は比較例Ｓの酵素およびＩＩ＃嵩に比べ酵素活性
が安定して＾る。

〔実施例５〕 これは、酵素としてアルデヒド脱水素酵素、補酵素とし
てＮＡＤを使用し、包括剤としてカラギーナンを使用し
て、これらを固定化した例である。

アルデヒド脱水素酵素７ｍｇとＮＡＤ　Ｏ，Ｉ　Ｊｌ　
ｒｘ４を５℃の蒸留水３０ｍ１Ｋ溶解させた後、この酵
素を含む溶液を４０℃に徐々に加温し友。５．２憾のカ
ラギーナン生理食塩水浴液１１０ｍ１を３５’Ｃに加温
した後、これと前記酵素溶液とを混合し、よく撹拌し走
。撹拌後、この混合液がゲル化するまで徐々に冷却して
アルデヒド脱水素酵素−ＮＡＤ結合ｌ１ｉｉｉｌ定化酵
嵩を得た。

こＯ一定化酵素に含まれると同型、同量のアルデヒド脱
水素酵素およびＮＡＤ　’に比較例６とした。

実施例５で優られた一定化酵素および比較例６の酵素と
補−嵩を用い、それぞれＰＨ７，５に調整し友りン駿緩
衝液中において、反応温度３０℃でアルデヒド脱水嵩反
応を行なった。ただし、基質濃度はＱ、１Ｍとした。両
者の比活性の経時変化を第５表に示す。

諺５表 １１５表かられかるように１実施！Ａ５により得られた
固定化＃素は、比Ｉ２例６の＃嵩および補酵素に比べ酵
素活性が安定している。

〔実施例６〕 酵素としてグルタきン鹸脱水嵩酵素を、補酵素としてＭ
Φをそれぞれ使用し、実施例４と同じく包括剤としてコ
ラーゲンを使用する方法でこれらを固定化して、グルタ
ミン酸脱水素酵素−ＮＡＤ結合−の固定化＃累を得た。

比較例７を実施例６で固定化したとｌＷｌｍ、同量のグ
ルタミン酸脱水素酵素および補酵素とし、比較例８を実
施例６で固定化したと同量のグルタミン酸脱水素＃素の
みを、実施例４と同じ方法で固定化したものとした。

実施例６の固定化酵素、比較例７の酵素および袖ｌｉ＃
累、比較例８の固定化＃素を使用して、それぞれ同一の
条件でグルタミン酸の脱水素反応を行なった。ただし、
基質濃度０．１　Ｍ　、反応温度３２℃であった。三ネ
°の比活性の＠時変化を第６表に示す。

第６表 第６表かられかるように、実施例６の一定化酵素は、比
較例７の酵素および補酵素および比較例８の一定化酵素
に比べ、＃素活性が安定している。

また、実施＠６ｔ）＠窒化１１素は比較例８の固定化―
嵩に比べ＃翼機性が高い。

特許出願人　松下先王株式会社 代理人　弁理士　松　本　武　　彦

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）＃嵩と補＃素をあらかじめ結合させておいて固定
   化することを特徴とする固定化酵素の製法。
2. （２）＃嵩が、アルコール脱水素＃素、アルデヒド脱水
   嵩酵素、乳酸脱水素靜嵩、リンゴ酸脱水嵩酵素、グルタ
   きン酸脱水素靜嵩およびブドウ纏−６−リン酸脱水素―
   嵩からなる群の中から選ばれた少なくとも１種である＊
   奸−求のＩｉ囲菖１項記載の固定化酵素の製法。
3. （３）補酵素がニコチンアミドアデニンジヌタレオチド
   およびニコチンアミドアデニンジヌタレオチドリン酸の
   うちの少なくとも一方である４ＩＩｆ請求の範８菖１項
   または１１２項記載の固定化酵素の製法。
4. （４）固定化が架橋法によって行なわれ、ａｍ剤として
   グルタルアルデヒド、ビスジアゾベンジジン、ヘキすメ
   チレンジイノシアナート、トルエンジイソシアナート、
   ヘキサメチレンジイソチオシフす−）、ＮＵＮ’−エチ
   レンビスマレインイミドおよびＮ・Ｎ′−ポリメチレン
   ビスヨードアセトアミト。 からなる鮮から遁ばれた少なくとも１種が用いられ６４
   １許請求Ｏ＠Ｓ嬉１項から第３項までのいずれかに記載
   の固定化酵素の製法０ （論　固定化が包括法によって行なわれ、包括剤として
   アクリルアミドモノマー、ポリアクリルアミド、ビニル
   ピロリドンモノマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
   ルアルコール、ポリエチレンクリコールアクリレート、
   ヒドロキシアルキルメタアタリレート、アクリル酸、コ
   ラーゲン、カラキーナン、セルロース、アルギン酸、寒
   天、多ｍ類およびこれらの誘導体からなる群から選ばれ
   た少なくとも１種が用いられる％１１！Ｆ１１１求の範
   １ｉ！！！第１項から３１１３項までのいずれかに記載
   の固定化酵素の製法。