JPH0579309B2

JPH0579309B2 -

Info

Publication number: JPH0579309B2
Application number: JP3111959A
Authority: JP
Inventors: Toshio Kajiuchi
Original assignee: TOKYO KOGYO DAIGAKUCHO
Current assignee: TOKYO KOGYO DAIGAKUCHO
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1991-05-16
Publication date: 1993-11-02
Also published as: JPH04341183A

Description

【発明の詳細な説明】

【0001】

【産業上の利用分野】この発明は修飾酵素に係
り、より詳細には、セルロース分解酸素であるセ
ルラーゼをポリマーで化学修飾した化学修飾セル
ラーゼに関する。

【0002】

【従来の技術】酵素は、それが示す反応特異性
により、生体触媒の一つとして種々の反応に利用
されている。しかしながら、酵素を単独で使用す
るこということは、酵素活性の持続安定性、反応
環境への適応性、さらに反応終了後に酵素を回収
して再び使用する再利用性などの実用的見地から
は、必ずしも有効ではない。

【0003】そこで、酵素を固定化して使用する技
術が種々考案されている。そのような例として
は、共有結合、物理的吸着、イオン結合、生化学
的特異結合などを利用して担体に結合させる担体
結合法、格子状物質やマイクロカプセルで酵素を
包み込む包括法、酵素同士を架橋剤で結合させる
架橋法などを挙げることができる。また、これら
の方法を組み合わせた複合法もある。さらに、酵
素を両親媒性合成高分子で修飾することにより有
機溶媒可溶化酵素とする方法も提案されており、
ポリエチレングリコール（PEG）で修飾したカ
タラーゼ、ベルオキシダーゼ、キモトリブシン、
リバーゼ、ヘム酵素などが報告されている。

【0004】しかしながら、植物の主要部分を形成
するセルロースを分解するセルラーゼについて
は、固定化や化学修飾の研究事例がない。セルロ
ースを分解して低分子化することは、未利用有機
資源の有効利用に直接結び付く重要な技術であ
る。例えば、セルロースの低分子はアルコールへ
の変換の中間過程として有用であり、また低分子
化された物質は新たな原料として利用可能であ
る。

【0005】セルロースを分解して低分子化するた
めの処理としては、従来、物理的処理としての粉
砕を経た後、強アルカリ処理、強酸処理等の化学
的処理が行なわれている。セルラーゼを用いた酵
素処理も近年盛んに研究され、多くの報告がある
が、その多くはセルラーゼで総称される酵素を精
製分離して各成分の活性を調べる酵素学的研究
や、動植物、菌体等から新たなセルラーゼを得る
方向で進められている。また、高活性のセルラー
ゼを産出するために、遺伝子操作も試みられては
いる。

【0006】

【発明が解決しようとする課題】セルロースの
分解に酵素を使用することは、分解後の処理を考
えた場合、従来の物理的および化学的処理による
方法に比較して有利である。しかしながら、酵素
による分解は、反応速度が遅いこと、酵素活性安
定性が悪いこと、酵素が高価であり、しかも再利
用が難しいことなどが問題となつている。特に、
分解過程において、セルラーゼが基質であるセル
ロースに吸着してしまい活性を失つてしまうこと
が大きな問題点であつた。

【0007】これに関しては、界面活性剤とセルラ
ーゼとの併用による活性向上を目的とした、
Castanonら（Biotechnol.Bioeng.、23、1365
（1981））、Ooshimaら（ibid.、28、1727（1986））、
Park、Kajiuchiら（ibid.、印刷中）の研究があ
り、界面活性剤との併用は酵素活性に維持に効果
があるとされている。

【0008】しかしながら、再利用という点から
は、セルラーゼが分離しやすい形態になつている
ことが望ましい。また、固定化は、基質が固体も
しくは高分子であるため、適当な方法とはいえな
い。

【0009】この発明は、活性安定性、PH安定性、
耐アルコール性等の実用的見地から要求される諸
性質が付与され、かつ分離・回収を行ない易い状
態であつて再利用が容易である化学修飾セルラー
ゼを提供することを目的とする。

【0010】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上
記事情に鑑み、鋭意研究の結果、ポリオキシアル
キレングリコールアルキル（メタ）アリルエーテ
ル・無水マレイン酸共重合体でセルラーゼを化学
修飾することにより、前記目的が達成されること
を見出した。

【0011】この発明の化学修飾セルラーゼにおい
ては、ポリオキシアルキレングリコールアルキル
（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合
体を修飾用高分子として用いている。このような
共重合体としては、例えば、下記化２に示される
一般式（）で表わされる共重合体を挙げること
ができる。

【0012】

【化２】

【化】

【0013】上記一般式（）において、AOはオ
キシアルキレン基、Ｒはアルキル基、ｎは重合
度、およびｋは共重合度をそれぞれ表わす。上記
一般式（）において、AOで表わされるオキシ
アルキレン基としては、エチレンオキシド［−
（CH₂CH₂O）−］、プロピレンオキシド［−（CH₂
（CH₃）CHO）−］等を挙げることができる。ま
た、Ｒで表わされるアルキル基としては、炭素数
１ないし18のアルキル基が好ましい。さらに、重
合度ｎは５〜50程度、および共重合度ｋは５〜50
程度がそれぞれ望ましい。

【0014】上記一般式（）で表わされる共重合
体については、特開昭64−108号公報、特開昭64
−109号公報、特開平１−287411号公報、特開平
２−138317号公報、特開平２−138318号公報、特
開平２−138319号公報、特開平２−138320号公
報、および特開昭63−226358号公報に詳細に記載
されている。

【0015】この発明において、化学修飾される酵
素としては、一般にセルラーゼと総称されるセル
ローズ分解酵素であればどのようなものでもよ
い。代表的なセルラーゼとしては、
Trichoderma属やAcremonium類等の糸状菌が
産生するセルラーゼを挙げることができる。

【0016】セルラーゼの修飾は、セルラーゼに存
在するアミノ酸残基中のアミノ基（−NH₂）と
修飾用高分子中に存在する無水マレイン酸基との
反応を利用することにより行なうことができる。
この修飾反応は、例えば、温度５℃以下の条件
で、適当濃度の酵素（粗酵素でも精製酵素でもよ
い）水溶液と修飾用高分子とを緩やかな攪拌条件
下で徐々に混合して反応させることにより行な
う。この際、反応PHは８以上に保つことが肝要で
ある。修飾用高分子の最終使用量は、所望する修
飾度によつて異なるが、通常、酵素量の０〜100
倍である。修飾酵素は、反応終了後の状態でその
まま使用することも可能であるが、必要に応じ
て、脱塩・凍結乾燥処理後、粉末として保存する
ことができ、さらに有機溶媒を用いて精製して精
製修飾酵素として保存することもできる。

【0017】

【実施例】

実施例１修飾用高分子としてAKM−0531およびAKM
−1511を用いて、市販のセルラーゼ（ヤクルト
社、オノズカＲ−10）を０℃の条件下で修飾し
た。AKM−0531およびAKM−1511は日本油脂
(株)から市販されているポリオキシアルキレングリ
コールアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マ
レイン酸共重合体であり、いずれも上記一般式
（）で表わされる構造を有している。上記一般
式（）における、それぞれのＲ、AO、ｎおよ
びｋは以下の通りである。

【0018】 AKM−0531 AKM−1511 Ｒ CH₃ CH₃ AO CH₂CH₂O CH₂CH₂O ｎ９ 30 ｋ 30 10 MW 18，000 16，000 それぞれの高分子を用いて得られた修飾セルラ
ーゼの特性を調べた。その結果を以下に示す。な
お、酵素活性の測定における標準基質としては、
フイルターペーパー（Toyo Roshi Co.、FP−
5C）、CMC（和光純薬社製）およびAvicel
（Merch Co.）を用いた。

【0019】 (a) 化学修飾率および酵素活性修飾率は、セルラーゼのアミノ酸残基中の未修
飾アミノ基をTNBS試薬で定量することにより
決定した。AKM−0531およびAKM−1511で修
飾した場合、最大修飾率は50％まで達した。

【0020】 AKM−0531およびAKM−1511で修
飾したセルラーゼの酵素活性は、フイルターペー
パーに対する活性で示すと、未修飾セルラーゼの
活性と比較して、修飾率20％で約0.95、同50％で
0.85〜0.9であつた。これは、通常酵素の固定化
で得られ残存活性よりも極めて高い値である。比
較のために無水マレイン酸で修飾した場合には、
修飾率は70％まで達したが、残存活性は0.6程度
まで低下した。

【0021】 (b) 熱安定性 PH5.6、温度50℃の条件下において、未修飾セ
ルラーゼの活性は90時間後には初期活性の80％ま
で低下し、その後も経過時間に比例して活性低下
が見られた。これに対して修飾セルラーゼの場合
には、同条件における90時間後の活性は、30％修
飾の酵素で85％であり、50％修飾の酵素では活性
の低下は見られなかつた。すなわち、高分子で修
飾することにより、熱安定性を付与することがで
きた。

【0022】 (c) 耐PH性温度50℃、PH8.6で48時間保存した後には、未
修飾セルラーゼはCMC、フイルターペーパーの
いずれに対しても酵素活性が50〜60％に低下し
た。これに対して、修飾セルラーゼは、修飾率の
増加と共に活性の低下が少なくなる。上と同条件
で保存した場合、48時間後の残存活性は、修飾率
20％で未修飾セルラーゼの1.2〜1.3倍、40％で1.6
倍、および50％で約1.7倍と高い活性を示した。
特に、修飾率50％の場合には、修飾直後の活性が
48時間後にもほとんど維持されていた。このよう
に、高分子で修飾することにより、耐PH安定性を
付与することができる。

【0023】 (d) 耐エタノール性セルラーゼはエタノール共存下では活性低下を
生じる。例えば、５％エタノール共存下では初期
活性の42％、10％エタノール共存下では15％程度
まで低下してしまう。修飾セルラーゼはこの活性
低下の割合を減ずることが可能であり、５％エタ
ノール共存下で未修飾セルラーゼの約1.5倍、10
％エタノール共存下で２倍以上の酵素活性を示し
た。 (e) 有機溶媒に対する溶解性と活性有機溶媒としてアセトンを用いた場合を例にと
ると、未修飾セルラーゼは、アセトン濃度50％以
上の水溶液では完全に沈殿してしまい、溶液中の
酵素活性は０となつてしまう。これに対して、修
飾率40％の修飾セルラーゼは、アセトン濃度が80
％の水溶液でも完全に溶解し、溶液中で酵素活性
を維持する。すなわち、修飾セルラーゼは有機溶
媒に対する優れた溶解性を有しており、高濃度の
有機溶媒存在下においても酵素活性を示す。

【0025】このようなアセトン水溶液に対する溶
解性を用いて、未溶成分と修飾セルラーゼとを容
易に分解することができる。また、回収した修飾
セルラーゼの溶液部分を凍結乾燥して得た精製修
飾セルラーゼは、場合によつては、初期活性以上
の活性を示すこともある。

【0026】以上のように、この発明による修飾セ
ルラーゼは、元の未修飾セルラーゼと比較して、
耐熱性、耐PH性、耐アルコール性、耐有機溶媒性
等の実用的見地から要求される諸性質が向上して
いることが明らかである。

【0027】実施例２実施例１において調製した修飾セルラーゼを用
いて、フイルターペーパーの糖化試験を行なつ
た。

【0028】 PH5.6、温度50℃でフイルターペーパ
ーを糖化させた場合には、反応初期には未修飾セ
ルラーゼの方が糖転化率が高いものの、約30時間
後に転化率が約30％に達した時点で両者の差はな
くなつた。その後、未修飾セルラーゼは転化速度
が鈍り、90時間後の糖転化率が40数％に止まつ
た。一方、修飾セルラーゼの転化速度はあまり低
下せず、90時間後には糖転化率が50数％と、未修
飾セルラーゼの約1.3倍となり、その後も両者の
差は開く一方であつた。

【0029】このように、この発明による修飾セル
ラーゼは、セルラーゼの実用性を高め、植物性バ
イオマスのエネルギー資源化など未利用有機資源
の有効利用に好適に用いることができる。

【0030】

【発明の効果】以上のように、この発明の修飾
セルラーゼは、活性安定性、PH安定性、耐アルコ
ール性等の実用的見地から要求される諸性質が向
上している。したがつて、未修飾のセルラーゼで
は使用不可能であつた環境で使用することが可能
となり、その用途が拡大する。このため、現在未
利用の有機資源の有効利用等に有用である。ま
た、分離・回収を行ない易い形態であるため、容
易に再利用することができ、高価なセルラーゼを
効率よく使用することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリオキシアルキレングリコール
アルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン
酸共重合体で化学修飾されたセルラーゼ。
【請求項２】前記ポリオキシアルキレングリコ
ールアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレ
イン酸共重合体が、下記化１に示される一般式
（）で表わされる共重合体である請求項１記載
の化学修飾セルラーゼ。【化１】【化】（ここで、AOはオキシアルキレン基、Ｒはアル
キル基をそれぞれ表わし、ｎは５〜50、ｋは５〜
50である）