JP3083710B2 - イソクエン酸脱水素酵素の安定化 - Google Patents
イソクエン酸脱水素酵素の安定化Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イソクエン酸脱水素酵
素（以下、ｉＣＤということもある）の安定化方法及び
安定化されたｉＣＤに関するものである。
素（以下、ｉＣＤということもある）の安定化方法及び
安定化されたｉＣＤに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】イソクエン酸脱水素酵素は、補酵素ＮＡ
Ｄ（Ｐ）−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ系の存在下、イソクエン酸を
２−オキソグルタル酸に変換する酵素であって（日本生
化学会編「生化学データブックＩＩ」東京化学同人（１
９８０、６、２３）ｐ．４６〜４７）、マグネシウムア
ッセイに利用できるだけでなく、グルタミン酸脱水素酵
素を用いるアンモニア生成物質測定におけるバックグラ
ウンドとして存在するアンモニアを消去する系において
も有利に利用することができる（特開昭６１−２４７４
００）。
Ｄ（Ｐ）−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ系の存在下、イソクエン酸を
２−オキソグルタル酸に変換する酵素であって（日本生
化学会編「生化学データブックＩＩ」東京化学同人（１
９８０、６、２３）ｐ．４６〜４７）、マグネシウムア
ッセイに利用できるだけでなく、グルタミン酸脱水素酵
素を用いるアンモニア生成物質測定におけるバックグラ
ウンドとして存在するアンモニアを消去する系において
も有利に利用することができる（特開昭６１−２４７４
００）。
【０００３】その他ｉＣＤを利用した臨床検査用体外診
断薬も種々提案されており（米国特許第４，７４２，０
０１号明細書、同第５，１０８，９０５）、現実に多数
のものが上市されて、疾病のモニタリングに活用されて
いる。しかしながら、ｉＣＤは微生物やブタの心筋等生
体由来の酵素であって、その保存安定性には常に不安を
残してきた。
断薬も種々提案されており（米国特許第４，７４２，０
０１号明細書、同第５，１０８，９０５）、現実に多数
のものが上市されて、疾病のモニタリングに活用されて
いる。しかしながら、ｉＣＤは微生物やブタの心筋等生
体由来の酵素であって、その保存安定性には常に不安を
残してきた。
【０００４】体外診断薬や測定試薬の安定性は、その構
成々分の安定性にかなりの部分依存しており、特に生体
成分である酵素の安定性に依存する場合が多い。ｉＣＤ
についても、同様の理由から、長期に亘る保存安定性の
向上が要望されていた。
成々分の安定性にかなりの部分依存しており、特に生体
成分である酵素の安定性に依存する場合が多い。ｉＣＤ
についても、同様の理由から、長期に亘る保存安定性の
向上が要望されていた。
【０００５】ｉＣＤの安定性の向上は、それを用いた体
外診断薬や測定試薬の保存安定性の向上にきわめて重要
であり、更には、得られた診断結果や測定結果の信頼性
の向上にとっても非常に重要である。
外診断薬や測定試薬の保存安定性の向上にきわめて重要
であり、更には、得られた診断結果や測定結果の信頼性
の向上にとっても非常に重要である。
【０００６】本発明は、特定の共重合体を用いてｉＣＤ
を化学的に修飾することにより該酵素を安定化させるこ
とを基本的技術思想とするものであるが、このようなこ
とは、従来全く知られておらず、本発明が最先のもので
ある。
を化学的に修飾することにより該酵素を安定化させるこ
とを基本的技術思想とするものであるが、このようなこ
とは、従来全く知られておらず、本発明が最先のもので
ある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、ｉＣＤの安定化技術の確立という当業
界における要望に応える目的でなされたものである。
術の現状に鑑み、ｉＣＤの安定化技術の確立という当業
界における要望に応える目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであり、各方面から検討した
結果、酵素を化学修飾することによって安定化を図るこ
ととした。しかしながら、酵素、特に生体由来の酵素
は、酵素毎にその性質が異なり、すべての酵素に対して
適用しうる一般的な安定化を達成することはできなかっ
た。
成するためになされたものであり、各方面から検討した
結果、酵素を化学修飾することによって安定化を図るこ
ととした。しかしながら、酵素、特に生体由来の酵素
は、酵素毎にその性質が異なり、すべての酵素に対して
適用しうる一般的な安定化を達成することはできなかっ
た。
【０００９】そこで、このような試行錯誤をくり返さな
ければ所期の目的が達成されないという技術の現状に鑑
み、特にｉＣＤの安定に適した修飾剤を鋭意スクリーニ
ングしたところ、全く予期せざることに、酵素の安定化
とは全く関係のない免疫の分野において、免疫反応の防
止剤として知られているポリオキシアルキレングリコー
ルアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共
重合体を修飾剤として使用したところ、ｉＣＤの保存安
定性が大幅に向上することを発見した。
ければ所期の目的が達成されないという技術の現状に鑑
み、特にｉＣＤの安定に適した修飾剤を鋭意スクリーニ
ングしたところ、全く予期せざることに、酵素の安定化
とは全く関係のない免疫の分野において、免疫反応の防
止剤として知られているポリオキシアルキレングリコー
ルアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共
重合体を修飾剤として使用したところ、ｉＣＤの保存安
定性が大幅に向上することを発見した。
【００１０】本発明は、この新知見に基き、更に研究の
結果、遂に完成されたものである。以下、本発明につい
て詳しく説明する。
結果、遂に完成されたものである。以下、本発明につい
て詳しく説明する。
【００１１】本発明にしたがってｉＣＤを化学的に修飾
するには、修飾剤とｉＣＤとを反応させればよい。反応
は、両者を接触せしめればよいのであるが、水系溶媒、
緩衝液の存在下で反応を行えば更に好都合である。
するには、修飾剤とｉＣＤとを反応させればよい。反応
は、両者を接触せしめればよいのであるが、水系溶媒、
緩衝液の存在下で反応を行えば更に好都合である。
【００１２】本発明に用いられるイソクエン酸脱水素酵
素は、特にその由来及び製造方法を問わず有効である
が、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、及びブタ
心筋由来の酵素が最も適している。修飾剤としては、ポ
リオキシアルキレングリコールアルキル（メタ）アリル
エーテル・無水マレイン酸共重合体が使用される。本共
重合体であればすべてのタイプのものが使用できるが、
例えば、下記化２で示される一般式（Ｉ）を有する共重
合体も有利に使用できる。
素は、特にその由来及び製造方法を問わず有効である
が、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、及びブタ
心筋由来の酵素が最も適している。修飾剤としては、ポ
リオキシアルキレングリコールアルキル（メタ）アリル
エーテル・無水マレイン酸共重合体が使用される。本共
重合体であればすべてのタイプのものが使用できるが、
例えば、下記化２で示される一般式（Ｉ）を有する共重
合体も有利に使用できる。
【００１３】
【化２】
【００１４】一般式（Ｉ）で示される共重合体であれ
ば、市販品、各共重合体の混合物を問わず、すべてのタ
イプのものが使用でき、非限定例としては、Ｒが低級ア
ルキル基、ｎが８〜２０、平均分子量７０００〜１００
０００の共重合体が例示される。
ば、市販品、各共重合体の混合物を問わず、すべてのタ
イプのものが使用でき、非限定例としては、Ｒが低級ア
ルキル基、ｎが８〜２０、平均分子量７０００〜１００
０００の共重合体が例示される。
【００１５】ｉＣＤと共重合体との反応に当り、イソク
エン酸（塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カ
ルシウム等）あるいはマグネシウムあるいはその両方を
反応系に添加すれば、更に収率が増大し、化学修飾が有
効且つ効率的に行われる。マグネシウムとしては、マグ
ネシウムの塩類（例えば、硫酸塩、塩酸塩など）が広く
使用される。なお、ｉＣＤと共重合体との反応比率は、
ｉＣＤ １部に対して共重合体０．５〜２０部が好適で
あるが、コストの面を無視すればこの範囲に限定される
ものではない。
エン酸（塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カ
ルシウム等）あるいはマグネシウムあるいはその両方を
反応系に添加すれば、更に収率が増大し、化学修飾が有
効且つ効率的に行われる。マグネシウムとしては、マグ
ネシウムの塩類（例えば、硫酸塩、塩酸塩など）が広く
使用される。なお、ｉＣＤと共重合体との反応比率は、
ｉＣＤ １部に対して共重合体０．５〜２０部が好適で
あるが、コストの面を無視すればこの範囲に限定される
ものではない。
【００１６】このようにして化学修飾したｉＣＤは、き
わめて高い保存安定性を示し、緩衝液中において、３７
℃で１か月間保存しても活性の低下はほとんど認められ
なかった。以下、本発明の実施例について述べる。
わめて高い保存安定性を示し、緩衝液中において、３７
℃で１か月間保存しても活性の低下はほとんど認められ
なかった。以下、本発明の実施例について述べる。
【００１７】
【実施例１：化学修飾ｉＣＤの作製（１）】Ｃａｎｄｉ
ｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来のイソクエン酸脱水素酵素（ｉ
ＣＤ）を、１ｍＭイソクエン酸カリウムと、１ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ4を含む０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に、４℃で透析平衡化した。その後、一般式（Ｉ）で示
されるポリオキシアルキレングリコール（メタ）アリル
エーテル・無水マレイン酸共重合体（ｎ＝１１、Ｒ＝メ
チル、平均分子量＝１２０００）を６００ｍｇ添加し、
充分混合し、４℃で一夜攪拌した。
ｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来のイソクエン酸脱水素酵素（ｉ
ＣＤ）を、１ｍＭイソクエン酸カリウムと、１ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ4を含む０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に、４℃で透析平衡化した。その後、一般式（Ｉ）で示
されるポリオキシアルキレングリコール（メタ）アリル
エーテル・無水マレイン酸共重合体（ｎ＝１１、Ｒ＝メ
チル、平均分子量＝１２０００）を６００ｍｇ添加し、
充分混合し、４℃で一夜攪拌した。
【００１８】反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２Ｓ
カラムにて０．１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１
ｍＭ ＭｇＳＯ4、１ｍＭイソクエン酸カリウムに平衡
化した。
カラムにて０．１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１
ｍＭ ＭｇＳＯ4、１ｍＭイソクエン酸カリウムに平衡
化した。
【００１９】
【実施例２：化学修飾ｉＣＤの作製（２）】Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｉＣＤ
について、実施例１と同じ処理を行って、該共重合体で
修飾したｉＣＤを作製した。
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｉＣＤ
について、実施例１と同じ処理を行って、該共重合体で
修飾したｉＣＤを作製した。
【００２０】
【実施例３：化学修飾ｉＣＤの作製（３）】ブタの心筋
由来のｉＣＤについて、実施例１と同様に処理し、但し
共重合体としては一般式（Ｉ）においてｎ＝４５、Ｒ＝
メチル、平均分子量＝５００００の共重合体を用いて、
化学修飾したｉＣＤを作製した。
由来のｉＣＤについて、実施例１と同様に処理し、但し
共重合体としては一般式（Ｉ）においてｎ＝４５、Ｒ＝
メチル、平均分子量＝５００００の共重合体を用いて、
化学修飾したｉＣＤを作製した。
【００２１】
【実施例４：化学修飾ｉＣＤの安定性（１）】０．２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、０．１％ＢＳ
Ａ、０．１％ＮａＮ3、０．１％Ｂｒｉｊ ３５、６．
７ｍＭイソクエン酸カリウムを含む緩衝液に、実施例１
で作製した化学修飾ｉＣＤのサンプル（Ｎ＝３）を１ｕ
／ｍｌになるように添加し、１か月間の保存安定性を３
７℃で確認した。
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、０．１％ＢＳ
Ａ、０．１％ＮａＮ3、０．１％Ｂｒｉｊ ３５、６．
７ｍＭイソクエン酸カリウムを含む緩衝液に、実施例１
で作製した化学修飾ｉＣＤのサンプル（Ｎ＝３）を１ｕ
／ｍｌになるように添加し、１か月間の保存安定性を３
７℃で確認した。
【００２２】得られた結果を図１に示した（なお図中、
３つのサンプルは、それぞれ、丸、四角、三角で示し
た）。そして比較として、化学修飾されていないＣａｎ
ｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来のｉＣＤの３７℃で１か月
間の保存安定性を調査し、同じく図１に示した。その結
果、本発明に係る３つの修飾酵素サンプルは、いずれも
９５〜１０３％の残存活性率を示した。
３つのサンプルは、それぞれ、丸、四角、三角で示し
た）。そして比較として、化学修飾されていないＣａｎ
ｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来のｉＣＤの３７℃で１か月
間の保存安定性を調査し、同じく図１に示した。その結
果、本発明に係る３つの修飾酵素サンプルは、いずれも
９５〜１０３％の残存活性率を示した。
【００２３】
【実施例５：化学修飾ｉＣＤの安定性（２）】実施例２
で作製した化学修飾ｉＣＤについて、実施例４と同様に
して保存安定性を調査した。なお比較として、化学修飾
されていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ由来のｉＣＤについても３７℃で１か月間の
保存安定性を調査した。
で作製した化学修飾ｉＣＤについて、実施例４と同様に
して保存安定性を調査した。なお比較として、化学修飾
されていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ由来のｉＣＤについても３７℃で１か月間の
保存安定性を調査した。
【００２４】その結果、３つの修飾酵素サンプルは、い
ずれも６５〜７４％というすぐれた残存活性率を示し
た。
ずれも６５〜７４％というすぐれた残存活性率を示し
た。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、共重合体で処理して化学
修飾することによって、ｉＣＤの保存安定性を大幅に高
めることがはじめて可能となった。
修飾することによって、ｉＣＤの保存安定性を大幅に高
めることがはじめて可能となった。
【図１】Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ由来のイソクエ
ン酸脱水酵素（化学修飾ｉＣＤ、非修飾ｉＣＤ）の３７
℃での保存安定性を示す。
ン酸脱水酵素（化学修飾ｉＣＤ、非修飾ｉＣＤ）の３７
℃での保存安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−341183（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−153088（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−273585（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 ポリオキシアルキレングリコールアルキ
ル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体で
化学修飾することを特徴とするイソクエン酸脱水素酵素
の安定化方法。 - 【請求項２】 ポリオキシアルキレングリコールアルキ
ル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体
が、下記化１に示される一般式（Ｉ）で表わされる共重
合体であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。 【化１】 - 【請求項３】 イソクエン酸、マグネシウムから選ばれ
るいずれか一方あるいは両方の共存下に化学修飾を行う
こと、を特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方
法。 - 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
載の方法により化学修飾され安定化されたイソクエン酸
脱水素酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06226022A JP3083710B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | イソクエン酸脱水素酵素の安定化 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06226022A JP3083710B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | イソクエン酸脱水素酵素の安定化 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856658A JPH0856658A (ja) | 1996-03-05 |
| JP3083710B2 true JP3083710B2 (ja) | 2000-09-04 |
Family
ID=16838565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06226022A Expired - Fee Related JP3083710B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | イソクエン酸脱水素酵素の安定化 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3083710B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101532014B1 (ko) * | 2015-01-13 | 2015-06-29 | 주식회사 로이첸 | 걸름망 제조장치 및 방법과 이를 이용한 걸름망 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4636530B2 (ja) * | 2004-09-30 | 2011-02-23 | 国立大学法人東京工業大学 | 芳香族化合物の処理方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01153088A (ja) * | 1987-12-09 | 1989-06-15 | Mihama Hisaharu | 修飾酵素 |
| JP2658165B2 (ja) * | 1988-04-23 | 1997-09-30 | 日本油脂株式会社 | 修飾されたコレステロールオキシダーゼおよびそれを用いるステロイド類の定量方法 |
| JPH04341183A (ja) * | 1991-05-16 | 1992-11-27 | Tokyo Inst Of Technol | 化学修飾セルラ−ゼ |
-
1994
- 1994-08-29 JP JP06226022A patent/JP3083710B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101532014B1 (ko) * | 2015-01-13 | 2015-06-29 | 주식회사 로이첸 | 걸름망 제조장치 및 방법과 이를 이용한 걸름망 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0856658A (ja) | 1996-03-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |