FI59265C - Foerfarande foer framstaellning av 6-aminopenicillansyra - Google Patents

Description

ESSr^l [B] (H) *^u ulutusjulkaisu ,ΛΛ,ς

JSTäk lJ UTLÄGGN I NGSSKIU FT

58¾¾ C. Patentti ay "nr.:- tty !0 07 1031

Patent ccddelnt ^ (S1) Kv.ik-Wci.3 C 12 N 11/02, C 12 P 37/00 // C 07 G 7/00 SUOMI—FINLAND (21) Nt^«ih«k*mu.-p««««»ökn<n, 781273 8"·0,,·τ8 ' * (23) Aikupilvi—GlMghetsdkg 11.08.75 (41) Tulhit |ulklMkil — Blhrlt offmcilg 2k. 0U. 78 ΡΜΜΙΙ·|. r.kUMril*mtu. Μ·***™. I.

Pttant- och iwgirtMvtyralMn ’ Amaktn uthgd och utUknfun puUkmd 31.03.8l (32)(33)(31) ·«/ «tuoJkeu*—B«ftrd prloritat 13 · 08.7*+ 26.OU.75 Iso-Britannia-Storl»ritannien(GB) 35556M, 17W75 (71) Beecham Group Limited, Beecham House, Great West Road, Brentford,

Middlesex, Englanti-England(GB) (72) Richard Anthony Godwin Smith, Wellington, Surrey, Englanti-England(GB) (7*0 Berggren Oy Ab (5^) Menetelmä β-aminopenisillaanihapon valmistamiseksi - Förfarande för framställning av 6-aminopenicillansyra (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 752275 - Avdelad frän ansokan 752275

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää 6-aminopenisillaanihapon valmistamiseksi sekä reaktiossa käytetyn entsyymin mahdolliseksi uudelle e nkäyttämi seksi.

Entsymaattisesti katalysoidut reaktiot ovat tärkeitä vaiheita eräissä kemiallisissa menetelmissä esim. saippuoitaessa lipidejä käyttäen hydrolaasia, kuten lipaasia, hajotettaessa proteiinia käyttäen pro-teolyyttistä entsyymiä, kuten trypsiiniä, valmistettaessa steroideja käyttäen dehydrogenaasia, valmistettaessa glukoosisiirappeja tärkkelyksestä hydrolaasia käyttäen ja valmistettaessa 6-aminopenisil-laanihappoa penisilliineistä, kuten bentsyylipenisilliinistä tai fenoksimetyylipenisilliinihaposta, penisilliiniasylaasia käyttäen.

Entsymaattiset reaktiot suoritetaan yleensä entsyymin ollessa liuotettuna substraatin sisältävään väliaineeseen. (Tässä selityksessä tarkoitetaan sanonnalla "substraatti" sitä ainetta, jonka entsyymi muuttaa halutun lopputuotteen saamiseksi). Koska entsyymi on liuotettu reaktioväliaineeseen on usein erittäin vaikeata erottaa entsyymiä substraatista tai lopputuotteesta reaktion päätyttyä. Kun 2 59265 tuote on erotettu reaktioseoksesta aiheuttaa tämä erotusmenetelmä yleensä entsyymin deaktivoitumisen. Tämä luonnollisesti aiheuttaa sen, että entsyymiä ei voida käyttää uudelleen.

Tämän erotusvaikeuden välttämiseksi ja sellaisen entsyymijärjestelmän aikaansaamiseksi, jota voidaan käyttää uudelleen, on tunnettua kiinnittää entsyymi liukenemattomaan kiinteään kantajaan joko adsorboimalla (katso esim. brittiläistä patenttijulkaisua n:o 1 264 147) tai kovalenssisidosten avulla joko suoraan tai epäsuorasti sillan-muodostusryhmien välityksellä. (Katso esim. brittiläisiä patenttijulkaisuja n:ot 1 349 498, 1 387 460 ja 1 365 886). Tällaisilla liukenemattomilla valmisteilla on kuitenkin joukko haittoja. Koska ne ensiksikin ovat kiinteitä aineita, ovat ne alttiita mekaaniselle vaurioitumiselle ja mahdollisesti hajoavat. Toiseksi entsyymin kiinnittyminen kiinteän kantajan pinnalle ja täten valmisteen spesifinen aktiivisuus on usein alhainen, ja kolmanneksi substraatin pääsy entsyymin aktiiviseen kohtaan estyy usein. Yritykset parantaa tällaisten liukenemattomien entsyyml-polymeeripreparaattien spesifistä aktiivisuutta lisäämällä kiinteän aineen pinta-alaa vaativat kiinteän valmisteen osasten koon pienenemisen mikä tekee käsittelyn ja erikoisesti suodattamalla tapahtuvan erottamisen vaikeammaksi, ja lisättäessä sisäistä pinta-alaa tekemällä osaset huokoisemmiksi saadaan osasia, joilla on alhaisempi mekaaninen lujuus.

On myös esitetty valmistettaviksi määrättyjä vesiliukoisia entsyy-mi-polymeerikomplekseja (katso esim. brittiläistä patenttijulkaisua n:o 1 284 925 ja suomalaista patenttia n:o 50882), jossa entsyymi on sidottu joko suoraan tai epäsuorasti sillanmuodostusryhmän avulla vesiliukoiseen polymeeriseen kantajaan. Nämä entsyymi-polymeeri-kompleksit voidaan ottaa talteen vesipitoisesta reaktioväliaineesta ultrasuodattamisen avulla. Ultrasuodatus on kuitenkin vaikea ja kallis menetelmä erikoisesti suuressa mittakaavassa ja tämän johdosta huonosti sopiva teolliseen käyttöön.

Hydrofobisten ryhmien hyväksikäyttöä kromatografiässä esim. proteiinien erotuksessa käsittelevät Er-el et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Comm., 49 (1972) s. 383 ja hofstree, ibid 50 (1973) s. 751 sekä Bartling et ai julkaisussa Nature, 243 (1973) s. 342.

3 59265

Er-el et ai. ja Hofstree tutkivat entsyymien puhdistusta käyttäen hydrofobista (affiniteetti) kromatografiaa, jossa entsyymi kiinnitetään kantajaan (sefaroosiin) alkyyliketjujen välityksellä. Kantajan alkyyliketjut menettävät täten hydrofobisuutensa tullessaan sidotuksi entsyymiin. Tämä sitoutuminen ei sisällä kemiallista reaktiota vaan se perustuu pelkästään hydrofobiselle vaikutukselle. Bartling et ai. kuvaavat entsyymin sitomista styreenin ja 4-vinyylibentsoehapon ko-polymeeriin. Entsyymin kiinnittäminen polymeeriin tapahtuu entsyymin aminoryhmän ja polymeerin karboksyyliryhmän muodostaman amidisidoksen välityksellä. Sitomisreaktio suoritetaan veteenliukenevassa polaarisessa, orgaanisessa liuottimessa, dimetyyliformamidissa.

Eräs toinen menetelmä entsyymien erottamiseksi reaktioväliaineista on mikrokapselointi (katso esim. "Immobilised Enzymes", O.R. Zaborsky, CRC Press 1973, sivut 93-101). Tämä menetelmä perustuu fysikaalisen esteen tai puoliläpäisevän kalvon muodostamiseen entsyymiä sisältävän vesipisaran ympärille. Este on riittävän läpäisykykyinen substraatin päästämiseksi mikrokapseliin, niin että se voi reagoida entsyymin kanssa ja muodostuneen tuotteen päästämiseksi ulos, kun sen sijaan entsyymin ulospääsy samalla on estetty.

Pysyviä mikrokapseleja voidaan valmistaa muodostamalla esimerkiksi polymeerisestä aineesta oleva puoliläpäisevä kalvo entsyymiä sisältävän vesipisaran ympärille. Käytössä pysyvät mikrokapselit disper-goidaan substraattia sisältävään vesipitoiseen väliaineeseen ja poistetaan sen jälkeen suodattamalla.

Pysymättömiä mikrokapseleita voidaan valmistaa sulkemalla entsyymiä sisältävä vesipisara orgaanisen nesteen kautta pinta-aktiivisen aineen kalvon sisään. Pinta-aktiivinen aine stabiloi nestefilmin, joka pinta-aktiivinen aine kerääntyy sisäänsuljetun vesipisaran ja orgaanisen nesteen väliseen rajapintaan. Käytössä orgaaninen neste, johon on dispergoitu entsyymiä sisältäviä vesipisaroita, dispergoidaan vuorostaan vesipitoiseen väliaineeseen, jolloin muodostuu orgaanisen nesteen pisaroita, jotka vuorostaan sisältävät entsyymipitoisen vesipitoisen väliaineen pisaroita. Neste valitaan siten, että substraatti voi läpäistä kalvon ja reagoida sisäänsuljetun entsyymin kanssa, minkä jälkeen mikä tahansa muodostunut tuote voi poistua samalla kun entsyymin poistuminen on estetty. Orgaaniset pisarat 4 59265 saavat yhtyä ja sen jälkeen voidaan entsyymi erottaa poistamalla orgaaninen faasi, joka kuljettaa sisäänsuljetun entsyymin mukanaan.

Nyt on todettu, että määrätyt entsyymit voidaan kiinnittää ei-polaa-risiin ryhmiin valmisteen tekemiseksi erotettavaksi vesipitoisesta väliaineesta sen affinisuuden perusteella veden kanssa sekoittamattomiin nesteisiin.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on aikaansaatu menetelmä 6-amino-penisillaanihapon valmistamiseksi käsittäen penisilliinin saattamisen kosketukseen entsyymivalmisteen kanssa vesiväliaineessa, joka ent-syymivalmiste koostuu penisillaaniasylaasista, joka on sidottu suoraan tai vaihtoehtoisesti 3-6 hiiliatomia sisältävän dialdehydin tai 1-6 hiiliatomia sisältävän diaminin välityksellä sakkaroosin ja epikloorihydriinin tai metyylivinyylieetterin ja maleiinihappoanhydri-din kopolymeeriin, 6-aminopenisillaanihapon talteenottamisen vesi-väliaineesta ja mahdollisesti entsyymin uudelleen käytön saattamalla se kosketukseen tuoreen substraattiliuoksen kanssa, ja keksintö on pääasiallisesti tunnettu siitä, että entsyymi johdannainen sisältää riittävään määrään sellaisia kovalenttisesti sidottuja ei-polaarisia ryhmiä että entsyymijohdannainen kun se saatetaan kosketukseen iner-tin veteen sekoittumattoman liuoksen kanssa, kuten 7-10 hiiliatomia sisältävän, alkaanin tai alkoholin kanssa, siirtyy veteen liukenemattomaan liuokseen ja on erotettavissa 6-aminopenisillaanihappoa sisältävästä vesiväliaineesta.

Tässä yhteydessä tarkoitetaan "inertillä, veteen sekoittumattomalla nesteellä” sellaista, joka ei reagoi entsyymipreparaatin kanssa niin, että se oleellisesti huonontaisi entsyymin aktiivisuutta.

Termi "siirtyy", jota edellä on käytetty, tarkoittaa kaikenlaatuista entsyymipreparaatin ei-polaaristen ryhmien ja veteen sekoittumattoman nesteen molekyylien välistä vuorovaikutusta, joka on riittävän pysyvä aikaansaamaan entsyymipreparaatin erottamisen vesipitoisesta väliaineesta.

5 59265

Eräitä entsyymejä käytettäessä aikaansaa ei-polaaristen ryhmien kiinnittyminen määrätyssä lukumäärässä suoraan entsyymimolekyyliin muodonmuutoksen ja entsyymin aktiivisuuden muutoksen. Johtuen tästä ja muutamissa tapauksissa entsyymin rakenteesta ei aina ole mahdollista liittää riittävästi ei-polaarisia ryhmiä entsyymiin preparaatin tekemiseksi erotettavaksi vesipitoisesta väliaineesta pienentämättä haitallisesti entsyymin aktiivisuutta.

Eräs sopiva vesiliukoisten kopolymeerien luokka ovat metyylivinyyli-eetteri/maleiinihappoanhydridi-kopolymeerit, joita myydään tavaramerkillä "Gantrez AN", (valmistaja GAF Corporation, New York, USA).

Entsyymi voi olla kiinnitettynä suoraan polymeeriin, joka sisältää ei-polaarisen ryhmän, tai vaihtoehtoisesti polymeeriseen kantajaan voi olla sidottuna sellaisia sillanmuodostavia ryhmiä, joihin entsyymi voi olla kiinnitettynä. Sillanmuodostusryhmä voi olla 3-6 hiiliatomia sisältävä d;Laldehydi tai 1-6 hiiliatomia sisältävä di-amini. Sillanmuodostusryhmän amino- tai aldehydifunktio on kiinnittynyt polymeeriin ja toinen on vapaa kiinnittymään entsyymiin. Tällaisten bifunktionaalisten sillanmuodostusryhmien käyttö aikaansaa myös jossain määrin ristikytkeytymistä entsyymi- ja polymeeriyksiköi-den välillä. Sillanmuodostusryhmiä voidaan käyttää entsyymin ja kantaja-aineen, entsyymin ja ei-polaarisen ryhmän (kantaja-aineen läsnäollessa), tai kantaja-aineen ja ei-polaarisen ryhmän välillä.

Näiden ei-polaaristen ryhmien määrä, jotka ovat kiinnittyneet keksinnön mukaisiin valmisteisiin, riippuu useasta tekijästä. Ei-polaaristen ryhmien kiinnittyminen polymeeriin ja/tai entsyymiin aikaansaa hydrofobisen ympäristön entsyymin läheisyydessä. Muutamia entsyymejä käytettäessä aikaansaa liian suuri hydrofobisuusaste entsyymin deaktivoitumisen johtuen samanaikaisesta rakennemuutoksesta.

Tasapaino on tarpeellinen sellaisten ei-polaaristen ryhmien minimimäärän kiinnittymisen välillä, jotka ovat välttämättömiä vesipitoisen väliaineen erottumisen mahdollistamiseksi, ja sen maksimilukumäärän välillä, jonka entsyymin stabiilisuus sallii. Tämän tasapainon määräys tapahtuu tavanomaisten kokeiden ja korjattujen virheiden perusteella. Ne seikat, joiden avulla tämä tasapaino on määrättävä, ovat seuraavat: 6 59265 (1) Polymeerisen kantajan molekyylipaino.

(2) Monomeeriyksikön molekyylipaino.

(3) Monomeeriyksiköiden prosenttimäärä siinä polymeerissä, joka on substituoitu ei-polaarisilla ryhmillä.

(4) Ei-polaaristen ryhmien koko.

(5) Entsyymin laatu.

(6) Polymeerin substituutioaste entsyymillä.

Kun kantaja on esim. Gantrez AN 119 (polymeeri, jonka molekyylipaino on 230 000, monomeeriyksikön molekyylipaino 156), jolloin 1 mooli Gantrez AN 119 on substituoitu 1 moolilla penisilliiniasylaasia, tapahtuu välttämätön minimisubstituutio tehokkaan erottumisen aikaansaamiseksi vesipitoisesta väliaineesta silloin, kun noin 25 % mono-meeriyksiköistä on substituoitu n-dekyyliryhmillä, ja maksimisubs-tituutio, joka säilyttää entsymaattisen aktiivisuuden, tapahtuu silloin, kun noin 50 % monomeeriyksiköistä on substituoitu n-oktade-kyyliryhmillä.

*

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty entsyymipreparaatti voidaan valmistaa saattamalla yhdiste, jolla on kaava (I): R - X (I) jossa R on ei-polaarinen ryhmä ja X on funktionaalinen ryhmä, kosketuksiin penisillaaniasylaasin kanssa, joka on kiinnittynyt aktiiviseen ryhmään, joka kykenee reagoimaan ryhmän X kanssa.

Ryhmä X voi olla 3-6 hiiliatomia sisältävä dialdehydi, kuten gly-oksaali tai glyseraldehydi, tai 1-6 hiiliatomia sisältävä diamiini, kuten 1,6-heksametyleenidiamiini tai etyleenidiamiini.

Se aktiivinen ryhmä, joka on kiinnittynyt entsyymiin ja kykenee reagoimaan ryhmän X kanssa, voi olla entsyymissä läsnä oleva ryhmä, joko alunperin esiintyvä tai modifioimisen avulla aikaansaatu, kuten esim. karboksyyli-, amino-, tioli- tai fenolihydroksiryhmä tai anhydridisidos, tai polymeerinen kantajamateriaali, joka sisältää tällaisen aktiivisen ryhmän, tai reaktiokykyinen kytkentäryhmä, kuten esim. kysymyksen ollessa edellä mainitusta ryhmästä X.

7 59265

Reaktio kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja entsyymin välillä toteutetaan edullisimmin pääasiallisesti neutraalissa pH-arvossa, sopivasti pH alueella 4-9, ja lämpötila-alueella välillä -4 ja +40°C entsyymistä riippuen. Edullisesti pH-arvo on noin 7,0 ja lämpötila alueella 0-5°C.

On edullista, että kantaja ensin modifioidaan ei-polaarisen ryhmän lisäämiseksi ja mikäli välttämätöntä sillanmuodostusryhmien lisäämiseksi ennen sen liittämistä entsyymin kanssa. Tässä toteutusmuodossa tarkoittaa ryhmä X edellä mainitussa kaavassa (I) sellaista polymeeristä materiaalia, joka on sitoutunut ei-polaariseen ryhmään R ja funktionaaliseen ryhmään.

Entsyymi/modifioidut polymeerivalmisteet voidaan sitten valmistaa millä hyvänsä tunnetulla menetelmällä entsyymien liittämiseksi polymeereihin. Tällaisia liittämismenetelmiä on kuvattu esimerkiksi brittiläisessä patentissa n:o 1 325 912 ja se käsittää entsyymin kytkemisen polymeeriin käyttämällä sellaisia reagensseja, kuten halo-geenisyanideja, erikoisesti bromisyanidia, s-triatsiineja, erikoisesti 2-amino-4,6-dikloori-s-triatsiinia, asyyliatsideja, diatsonium-yhdisteitä, esim. 2-hydroksi-3-(p-diatsofenyyli)propyylieetteriä, orgaanisia syanaatteja, kuten fenyylisyanaattia, ja karbodi-imidejä. Usein tällaisia kytkentäaineita saatetaan ensin reagoimaan polymeerin kanssa aikaansaamaan niihin reaktiokykyisiä ryhmiä, jotka ryhmät saatetaan sitten reagoimaan entsyymin kanssa. Muutamissa tapauksissa voivat entsyymit reagoida suoraan polymeerin kanssa esim. mikäli tämä sisältää tai on modifioitu siten, että se sisältää, aktiivisia ryhmiä, kuten anhydridisidoksia tai happoatsidiryhmiä.

Tämän johdosta on huomattava, että reaktiomenetelmä ja olosuhteet, joita käytetään modifioitujen polymeerien valmistamiseksi ja niiden sitomiseksi entsyymeihin, vaihtelevat riippuen entsyymin ja polymeerisen materiaalin luonteesta.

Useimpia entsyymi/polymeeripreparaatteja varten on eräs sopiva menetelmä esitetty kaaviossa I. Ensimmäisen vaiheen muodostaa ei-polaa-risten ryhmien liittäminen polymeeriin (a) edullisesti primäärisen tai sekundäärisen amiinin R*NH2 tai R2*NH välityksellä, ja (b) sillanmuodostusryhmien, kuten a,ω-diamiinien, liittäminen tämän jälkeen entsyymiin dialdehydiryhmien välityksellä. Nämä reaktiot toteutetaan sopivasti vesipitoisessa liuoksessa tai suspensiossa alkalisessa pH-arvossa (sopivasti pH 8-12) ja huoneen lämpötilassa. Dialdehydiryhmiä sisältävä entsyymi voidaan sitten kytkeä modifioituun polymeeriin vesipitoisessa väliaineessa pääasiallisesti neutraalissa pH-arvossa.

<· 59265 8

KAAVIO I

---- -P_ nh . R

Polymeeri -_y Polymeeri y_ --RNH9 tai IUNH -k.

+ 2 2 ^NH(CH2)xNK2 nh2(ch2)xnh2

. CH0(CHo) CHO Entsyymi “ N=CH(CH2) CHO

Entsyymi__L2L___) y y_

___ NH. R

Polymeeri

---J— NH. (CH?) -N

-Ί V

Entsyymi _ N=CH-(CH2)V-CH

1/ jossa R on ei-polaarinen ryhmä, kuten edellä on määritelty; ΝΗ2(0Η2)χΝΗ2 on a,ω-diamiini; ja CHO(CH2)yCHO on dialdehydi.

Usein on välttämätöntä aktivoida polymeerissä olevat ryhmät edullisesti syaanibromidilla ennen kuin liittäminen ei-polaaristen ryhmien kanssa on mahdollinen.

Toiselta puolen muutamissa polymeereissä on sellaisia ryhmiä, joita voidaan käyttöä kytkennän aikaansaamiseksi ei-polaaristen ryhmien ja/tai entsyymin kanssa niin haluttaessa ilman sillanmuodostusryh-miä. Tällä tavoin valmistetuissa keksinnön mukaisissa entsyymiprepa-raateissa ei ole ristikytkentää, joka aiheutuu sillanmuodostusryh-mien käytöstä, ja niillä on usein edellä mainitut edulliset ominaisuudet .

Esimerkiksi sellaisissa polymeereissä, jotka perustuvat maleiini-happoanhydridimonomeeriin, kuten Gantrez-materiaaleihin, voidaan perusketjussa olevia anhydridiryhmiä käyttää sekä ei-polaaristen ryhmien että entsyymien liittämiseksi. Polymeeri modifioidaan sopivasti ensin kiinnittämällä siihen ei-polaarisia ryhmiä ja polymeerissä olevia jäljelle jääneitä anhj Iridiryhmiä käytetään sitten suoraan kytkennän aikaansaamiseksi eni.syymin kanssa. Tämä menetelmä on esitetty kaaviossa II: 9 59265

t KAAVIO II

OCH, I 3 CHp-CH-CH-CH-- + m RNh2 -y c c ΑΛ 0 0 0 _ _n (j)CH3 och5 --CH2-CH-CH-CH-----CHo-CH-CH-CH-- M li C0,H C=0 p n nhr NHK 000 — —_ __n-m x enz-nh2 och, och, och, I > I 3 I 3 ? --CHp-CH-CH-CH---CHp-CH-CH-CH---CHg-CH-Cff-CH—

h,o „„ 1 1 M II

COpH C=0 C02H <j? = 0 C02M COpH

NHR _ NH

L. jm | L enz_x [_ n-(m+x) jossa R on edellä mainittu ei-polaarinen ryhmä; ENZ-NHp on entsyymi, jossa on aminoryhmä.

Gantrez-polymeereiliä} esim. Gantrez AM 119 ja Gantrez AN 1^9» on edelleen etuna se, että ne liukenevat reagoimatta määrättyihin ap-roottisiin, vettä sisältämättömiin liuottimiin, kuten dimetyyliform-amidiin, jotka ovat myös hyviä amiinien RNHp ja RpNH liuottimia. Homogeeninen reaktioseos on mahdollinen, ja tämän johdosta tällaiset liuottimet aikaansaavat edullisia reaktioväl.iaineita ei-polaariSten ryhmien kiinnittämiseksi näihin polymeereihin keksinnön mukaisia ent-syymipreparaatteja valmistettaessa.

Näin ollen voidaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettyjä entsyymi-polymeeri-preparaatteja valmistaa saattamalla polymeerinen materiaali, jonka pääketjussa on anhydridiryhmiä, reagoimaan sellaisen amiinin kanssa, jolla on kaava RNH2 tai R2NH, aproottisessa, vettä sisältämättömässä, polaarisessa liuottimessa, jolloin R on ei- 10 5 9265 polaarinen ryhmä ja kiinnittämällä tämän jälkeen modifioitu polymeeri f ' entsyymiin.

On edullista, että amiini saatetaan reagoimaan polymeerin kanssa tertiäärisen emäksen, kuten esim. pyridiinin, läsnäollessa. Sanonta "tertiäärinen emäs", jota käytetään tässä yhteydessä, tarkoittaa tertiääristä amiinia tai heterosyklistä aromaattista amiinia.

Vettä sisältämätön aproottirien liuotin on edullisesti N,N-dimetyyli-formamidi tai itse tertiäärinen emäs. Se lämpötila, jossa reaktio toteutetaan, riippuu polymeerisen kantajan ja amiinin luonteesta. Reaktio toteutetaan kuitenkin yleensä lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan ja 100°C välillä.

Modifioitu polymeerinen kantaja voidaan erottaa siitä väliaineesta, jossa se on valmistettu, saostamalla vähemmän polaarisella liuottimena, kaikkein sopivimmin dietyylieetterillä, tai lisäämällä liuos veteen, jolloin tapahtuu turpoaminen ja anhydridin hydrolyysi ja erottamalla hydrolysoitu modifioitu polymeeri vesipitoisesta väliaineesta käyttäen veteen sekoittumatonta nestettä, tai sentrifugoimalla.

Entsyymi kiinnitetään sitten edellä mainittuun erotettuun, modifioituun kantajaan saattamalla modifioitu kantaja kosketuksiin entsyymin kanssa vesipitoisessa liuoksessa mahdollisesti käyttäen kytkentäai-netta, esim. substituoitua karbodi-imidiä. Vaihtoehtoisesti voidaan hydrolysoimaton reaktioseos tai hydrolysoimaton modifioitu polymeeri, joka on liuotettu pieneen tilavuusmäärään polaarista, vettä sisältämätöntä liuotinta, lisätä suoraan entsyymin vesiliuokseen.

Vaihtoehtoisesti voidaan kytkentä aikaansaada aikaansaamalla ensin edellä mainittu hydrolysoimaton kantaja ja käsittelemällä sitä hydratsiinihydraatilla dimetyyliformamidi liuoksessa. Tämä käsitelty kantaja, joka hydrolysoidaan sitten ja erotetaan vesipitoisesta väliaineesta sentrifugoimalla, voidaan kytkeä entsyymin kanssa vesipitoisessa väliaineessa käyttäen aktivaattorina natriumnitriittiä..

11 59265

Entsyymipreparaatin erottamiseksi vesipitoisesta väliaineesta käytetään 7-10 hiiliatomia sisältäviä alkaaneja tai alkoholeja. Sopivia alkaaneja ovat esim. heptaani, oktaani, nonaani, dekaani, heksa-dekaani, ja sopivia alkoholeja ovat C^-C^ alifaattiset alkoholit, kuten n-dekanoli.

Kosketuksen jälkeen tällaisen nesteen kanssa muodostaa entsyymipre-paraatti pintakerroksen kosketusalueelle näiden kahden välillä. Haluttaessa maksimoida tämä kösketusalue käsittää kosketusvaihe tavallisesti sekoittamisen esim. sekoituslaitteella tai ravistamalla veteen sekoittumattoman nesteen hajottamiseksi pieniksi pisaroiksi. Kutakin pisaraa ympäröi tällöin entsyymipreparaatti, joka kiinnittyy sen pintaan.

Se miten entsyymipreparaatti liittyy veteen sekoittumattomaan nesteeseen vaihtelee riippuen siitä polymeerisestä materiaalista ja/tai i2 59265 niistä ei-polaarisista ryhmistä, jotka sisältyvät entsyymipreparaat-tiin. Esimerkiksi käytettäessä sellaisia entsyymi/polymeeri-prepa-raatteja, joissa esiintyy huomattava ristikytkeytyminen, muodostuu kiinteitä aggregaatteja, ja nämä osaset kiinnittyvät veteen sekoit-tumattoman nesteen pisaroihin. Käytettäessä kuitenkin ei-ristikytket-tyjä valmisteita, kuten esim. "Gantrez"-kantaja-aineita (ja ei-poly-meeripitoisia valmisteita), ei yleensä tapahdu poikittaista kiinteiden aineiden kiinnittymistä pisaroihin ja pisaroille muodostuu ent-syymipreparaatin yksinkertainen kerros.. Tämä on erittäin edullista silloin, kun entsyymireaktio toteutetaan saattamalla entsyymiprepa-raatti ensin kosketukseen veteen sekoittumattoman nesteen kanssa tällaisen järjestelmän aikaansaamiseksi.

Olipa kiinnittymisen luonne mikä hyvänsä, mahdollistaa entsyymiprepa-raatin ja veteen sekoittumattoman nesteen (tavallisesti pisaroiden muodossa) välinen kosketus entsyymipreparaatin erottamisen vesipitoisesta väliaineesta. Entsyymipreparaatilla päällystettyjen pisaroiden tiheys on suunnilleen sama kuin veteen sekoittumattoman nesteen tiheys. Annettaessa pisaroiden seistä ne joko nousevat vesipitoisen väliaineen pinnalle (kysymyksen ollessa nesteistä, jotka ovat kevyempiä kuin vesi) tai laskeutuvat pohjalle (raskaammista nesteistä puheen ollen). Täten aikaansaadaan erillinen kerros, joka sisältää veteen sekoittumatonta nestettä yhdessä entsyymipreparaatin kanssa, joka voidaan ottaa helposti talteen vesipitoisesta väliaineesta.

Sellaisten nesteiden kysymyksessä ollessa, jotka eivät kellu vesipitoisen väliaineen pinnalla tai laskeudu riittävän nopeasti sen pohjalle, voidaan käyttää muunlaisia erotusmenetelmiä, kuten esim. sentrifugoimista tai seoksen johtamista vettä hylkivän suodattimen lävitse, jonka jälkeen vesipitoinen väliaine menee sen lävitse ja veteen sekoittumaton neste (yhdessä entsyymipreparaatin kanssa) jää suodattimelle ja erotetaan siitä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä suoritetaan 6-aminopenisillaanihapon valmistus penisilliinistä käyttäen penisilliiniasylaasientsyymiin perustuvaa valmistetta. Asylaasientsyymi saadaan edullisesti bakteereista, kuten Escherichia coli-kannasta, jollaista käytetään bentsyylipenisilliinin lohkaisemisek-si tai fencksinietyylipenisilliinin käsittelemiseksi voidaan käyttää Actincmycetes-sukua olevaa sientä. Tällaiset entsyymit ovat hyvin tunnettuja. Niitä käytetään valmistettaessa 6-APA:ta pH-alueella 6,0-9,0, edullisesti 7,0-8,5. Koska peni- 13 59265 silliinin deasyloiminen aikaansaa vapaan hapon erottumisen penisilliinin sivuketjusta, on välttämätöntä ylläpitää edellä mainittu pH-alue keksinnön mukaisen menetelmän aikana lisäämällä, mikäli välttämätöntä, alkalia, kuten natrium- tai ammoniumhydroksidin tai tri-etyyliamiinin liuosta.

Esimerkeissä esitetty jatkuva entsymaattinen reaktiomenetelmä voidaan toteuttaa esim. sellaisessa laitteistossa, joka on esitetty oheenliitetyssä piirustuksessa 1, joka esittää kaaviollisesti erästä sopivaa reaktoria.

Kuten kuviosta 1 ilmenee, on siinä reaktorisäiliö 1, jossa on sekoi-tuslaite 2, syöttöjohdot 3, 4 ja 5 vastaavasti substraattia, alkalia ja entsyymitaasia varten, ja poistojohto 6. Säiliössä 1 on myös pH-arvon mittauslaite 7, jota säätää venttiili 8, joka on yhdistetty alkalin syöttöjohtoon 4. Poistojohto 6 johtaa pumpun 9 kautta erotus-säiliöön 10 tulojohdon 11 kautta. Erotussäiliössä on ylempi poisto-johto 12, joka on yhdistetty reaktorisäiliön syöttöjohtoon 5, alempi poistojohto 13 reaktiotuotteen poistamiseksi pumpun 14 kautta, ja lasisintterisuodatin 15, joka on sovitettu alemman poistojohdon 13 yläpuolelle. Substraatin syöttöjohdossa 3 on pumppu 16, ja pumput 14 ja 16 on kytketty siten, että ne toimivat samalla nopeudella.

Käsittelyn aikana johdetaan reaktiosäiliöön 1 johdon 3 kautta substraattia vesipitoisessa väliaineessa yhdessä keksinnön mukaisen entsyymipreparaatin ja veteen sekoittumattoman nesteen kanssa. Seos dispergoidaan sekoittajan 2 avulla emulsion aikaansaamiseksi. Säiliötä 1 voidaan pitää vakiolämpötilassa esim. vesivaipan (ei esitetty) avulla, joka ympäröi säiliötä. Alkalia lisätään säiliössä olevaan emulsioon johdon 4 kautta, ja tällaista lisäysnopeutta säädetään venttiilin 8 avulla, jota taas säädetään näytteenottokohdan 7 avulla niin, että reaktioseoksen pH pidetään optimireaktiota varten tarpeellisella alueella. Reaktion aikana toimii pumppu 9 ja seos poistetaan poistojohdosta 6 ja edelleen erotussäiliöön 10 johdon 11 kautta. Säiliössä 10 muodostaa veteen sekoittumaton vettä kevyempi neste erillisen ylemmän kerroksen 17, johon jää myös entsyymipreparaatti. Reaktiotuotteen sisältävä alempi vesipitoinen kerros 18 poistetaan suodattimen 15 lävitse ja tämän jälkeen johdon 13 kautta pumpun 14 avulla. Ylempi kerros 17, joka sisältää 59265 entsyymipreparaatin yhdessä veteen sekoittumattoman nesteen kanssa, saa virrata poistojohdon 12 kautta ja se palautetaan reaktiosäiliöön 1 johdon 5 kautta. Kun tuote on poistettu johdon 13 kautta, lisätään lisää substraattiliuosta säiliöön 1 syöttöjohdon 3 kautta pumpun 16 avulla. Pumput 14 ja 16 on säädetty siten, että substraatin syöttö-nopeus on yhtä suuri kuin tuotteen poistonopeus.

Virtausnopeudet, viipymisaika reaktorisäiliössä ja muut reaktiopara-metrit riippuvat käytetystä entsyymipreparaatti-substraatti-järjestelmästä. Alustavista tuloksista voidaan todeta, että 10 000 litran reaktorissa käytettäessä 1000 kg entsyymipreparaattia, joka perustuu Gantrez AN 149-kantajalle kiinnitettyyn penisilliiniasylaasiin, voidaan käsitellä noin 2000 kg penisilliini G:tä vuorokaudessa väkevyyden ollessa 5 % paino/tilavuus lämpötilassa 22°C ja pH-arvossa 7,8.

Seuraavat esimerkit kuvaavat muutamien keksinnössä käytettyjen penisillaaniasylaasi-polymeerikompleksien valmistusta ja ominaisuuksia.

Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhennelmiä polymeerien ja modifioitujen polymeerien, entsyymin, kytkentäryhmien, ei-polaaristen ryhmien ja kytkentäaineiden määrittelemiseksi.

Entsyymi: PA : Penisilliiniasylaasi

Kantaja-aineet: F : Ficoll (sakkaroosin ja epikloorihydriinin kopolymeeri, valmistaja Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi) GAN : Gantrez (vinyylimetyylieetterin ja maleiinihappo- anhydridin kopolymeeri, valmistaja GAF Corporation, New York, USA)

Entsyymi/kantaja-sidosryhmä: HD : 1,6-diaminoheksaani

Ei-polaariset ryhmät: D : n-dekyyliamino DD : n-dodekyyliamino OD : n-oktadekyyliamino i5 5 92 65

Ristikytkentäaineot ja aktivoimir.aineet ja aktivoivat ryhmät: CMC : 1-sykloheksyyli-3-(2-morfolinoetyyli)-karbodi-imidi- metano-p-tolueenisulfonaatti G : Glutaraldehydi A : Hydratsidi

Kokonaisluku merkinnän jälkeen tarkoittaa valmistuserän numeroa.

Esimerkiksi esimerkin 1 mukaista entsyymipreparaattja merkitään merkinnällä PAFHDDG. Entsyymi on tällöin penisilliiniasylaasi (PA). Kantaja on Ficoll (I·'), jossa on heksametyleenidiamiiniryhmiä (HD) kiinnittymisen aikaansaamiseksi entsyymiin ja myös dekyy]iryhmiä (D) ei-polaarisina ryhminä. Heksametyleenidiainiiriiseoksen vapaan aminoryh-män ja entsyymin välinen kytkentä aikaansaadaan käyttäen glutaralde-hydiä (G).

Myös GAN 1U9 HDOD on modifioitu kantaja, joka on valmistettu sellaisesta Gantrez 1^9:stä, joka on modifioitu 1,6-diaminoheksaanilla ja oktadekyyliamiinilla, ja PAGAN 1*19 HDOD-G on sellainen edellä mainittu modifioitu kantaja, johon on kiinnitetty penisilliiniasylaasia glutaraldehydin läsnäollessa.

Esimerkki 1 (a) n-dekyyliamino, (6-aminoheksyyli amino)-Ftcoll (FHDD-1)

Ficoll'ia (5 g) liuotettiin veteen (300 ml) ja säädettiin pH-arvoon 11,0. Lisättiin syaanibromidia (lg) ja pH pidettiin oikeassa arvosea reaktion aikana 2-n NaOHrn avulla- Reaktio päättyi 20 minuutin kuluttua huoneen lämpöti ] assa j a n-dekyy li arni itu (;l g) ja 1,6-diaminohc-k-saani (0,5 g) liuotettuna rnetanoliin (10 ml) lisättiin sitten. Tämän jälkeen pH säädettiin arvoon 9,5 2-n HCl:n avulla ja seosta sekoitettiin 16 tuntia lämpötilassa i|<pC. Saatua kolloidaalista liuosta sent-rifugoiti.in arvossa 22 000 g/1 tunti, jolloin saatiin valkoinen kakku (märkäpaino 35 g), joka otettiin talteen ja samea, sakan yläpuolella oleva neste heitettiin pois.

(b) Penisiliiiniasylaasi /n-dekyyliamino, (6-aminoheksyyliamino )-Ficoll/ ( PAFHDDG-1), FHDD-1 (21,6 g, märkäpaino) sekoitettiin 0,1-m natriumfosfaattipusku-rin kanssa, pH 6,0 (20 ml), ja säädettiin pH-arvoon 6,2 2-n HClillä.

E. cöli penisilliiniasylaas i -liuos (50 ml, 3'l0 mg proteiinia, osittain puhdistettu) säädettiin p|[-arvoon 6,2 lämpötilassa 0°C ja lisät- 16 59265 tiiivglutaraldehydiä (5 ml, 25 % p/t vesiliuos). Kun oli sekoitettu lämpötilassa 0°C 30 min, lisättiin FHDD-1 suspensio. Seosta sekoitettiin lämpötilassa 0°C 3 tuntia ja lämpötilassa *Ι°0 *1 tuntia ja jäähdytettiin sitten (~20°C) 16 tuntia. Sulamisen jälkeen suspensio sentrifugoitiin (20 000 g/4°C/45 min), jolloin saatiin ruskea, geeli-mäinen kakku. Tämä geeli suspendoiti in uudelleen 0,1-m natriumfos- faattipuskuriin, pH 7,0 (30 ml), ja sentrifugoitiin uudelleen (20 00C g/^C/^O min). Sakan yläpuolella olevat nesteet yhdistettiin ja ruskea kakku (märkäpaino noin 6,3 g) suspendoitiin 0,1-m natriumfosfaatti-puskuriin, pH 7,0, ja varastoitiin lämpötilassa Jl0C. Kakun suspensio sekoitettuna ainakin oman painonsa kanssa n-dekanolia kelluu dekano-lin kanssa vesiliuosten pinnalla, jolloin jäljelle jää entsyymivapaa liuos. Kakun, sakan yläpuolella olevan liuoksen ja perusentsyymin entsyymiaktiivisuudet on esitetty taulukossa 1. Näin % alkuperää- . sestä entsyymiaktiivisuudesta saadaan talteen käytännöllisesti katsoen kokonaan konjugaatissa. Kompleksin aktiivisuus voidaan ottaa talteen oleellisesti penisilliiniliuoksista joko kelluttamisen tai tavanomaisen sentrifugoimisen avulla.

Taulukko 1 PAFHDDG-1:n penisiliiiniasylaaslaktiivisuus

Koemenetelmä: Penisilliini G:tä (natriumsuolaa) liuotetaan sopivassa väkevyydessä 20 ml:an 0,02-m natriumfosfaattipuskuria, pH 7,8, lämpötilassa 37°C ja lisätään entsyyminäyte. Lisäämällä 0,1-n tai 0,5~n NaOH:ta ylläpidetään haluttu pH-arvo ja aktiivisuus esitetään C-aminopenisillaanihapon (6-ΛΡΛ) valmistuksen alkuperäisen nopeuden perusteella. Tarkistuskok eessa 1. lisätään 2 ml n-dekanolia sekoitettuun reaktioseokseen ja määräyksen jälkeen annetaan suspension erottua kahdeksi kerrokseksi. Ylempi kerros poistetaan imemällä ja käytetään uudelleen. Käsittelyssä 2 sentrifugoidaan lopullista suspensiota (2000 g/15 min) ja kakku käytetään uudelleen.

17 59265 , . 6-APA:n alkuvalmis- M . . ,. ........ % (paino/til) tusnopeus moolia/

Materiaali Maara penisilliiniä min _____ G kokeessa x io~ ^ ·

Perusentsyymi 1 ml 5 0 PAPHDDG-1 sakan yläpuolella oleva neste 1 ml 5 0 008 PAPHDDG-1 0,5 g 5 1,500 PAPHDDG-1 tark.kokeet Käsittely 1. 1. 0,5 g 5 0,860 ' 2· °>5 g 5 0,550 5· S 5 0,500 Käsittely 2. 1. 0,5 g 5 1,500 2· 0,5 g 5 1,210 3· 0,5 g 5 1,110

Jl· °>5 g 5 1,030

Esimerkki 2 (a) > (6-aminoheksyyIiamino)-Pieni 1 (FODKD-1) Ficoll (5 g) liuotettiin veteen (300 ml) ja liuosta käsiteltiin syaanibromidi11a (1 g) pH-arvossa 11,0 edellä esitetyllä tavalla.

20 minuutin kuluttua säädettiin liuos pH-arvoon 10,0 2-n HCl:llä ja lisättiin n-oktadekyyliamiinin (5 g) ja 1,6-diaminoheksaanin (0,5 g) liuos metanolissa (20 ml). Tämän jälkeen pH säädettiin uudelleen arvoon 10,0 2-n HCl:llä ja seosta sekoitettiin lämpötilassa H°C 72 tuntia. Tuotetta sentrifugo.itiin (20 000 gM°C/fl5 min). Jäljelle jäi löyhä valkoinen kakku (25 ml) ja kirkas sakan yläpuolella oleva neste, jonka pinnalla oli vaahtoa (oktadekyyiiamiini).

(b) Penisilliiniasylaasi /n-oktadekyyliamlno, (6-aminoheksyyli-amino)-Ficoll.7 (PAFODHDG-i)

Penisilliiniasylaasi (25 ml, 170 mg proteiinia) säädettiin pH-arvoon 6,2 huoneen lämpötilassa ja lisättiin glutaraldbhydiä (2,5 ml, 25 % p/t). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 min, lisättiin FODHD-l:tä (10 ml) ja suspensio säädettiin pH-arvoon 6,2 2-n HCl:llä. Kun oli sekoitettu lämpötilassa *l°C 3 tuntia, sentri fugoitiin materiaali (20 000 g/i|°C/30 min). Vaaleanpunainen kakku suspendoitiin uudelleen 0,3-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0, ja sitä varastoitiin lämpötilassa 4°C. Suspensio saatettiin kellumaan n-dekanolin avulla ja sen aktiivisuus on esitetty taulukossa 2. Aktiivisuuoc-n talteenotto oli noin 60 %.

18 59265

Taulukko 2 PAFQDHDG-1;n aktiivisuus

Koemenetelmä: sama kuin taulukossa 1. Kaikissa määräyksissä käy tettiin 5 %:sta paino/til. penisilliini G:tä.

f 6-APA:n alkuperäinen va^mistus-Materiaali_Määrä_ nopeus moolia/min x 10_

Perusentsyymi 1 ml 0,885 PAFODHDG-1 0,5 g 0,940

Tarkistuskokeet (menetelmä 2) 1. 0,5 g 0,800 2. 0,5 g 0,585

Esimerkki 3 (a) GAN149HDOD-1

Metanoliin (10 ml) suspendoitiin n-oktadekyyliamiinia (1 g) ja 1,6-diaminoheksaania (0,2 g) ja suspensio lisättiin 0,2-m natriumfosfaat-tipuskuriin, pH 8,0 (200 ml), joka sisälsi metanolia (40 ml). Gantrez 149 (2 g) lisättiin pienissä määrissä samalla voimakkaasti sekoittaen. Seosta sekoitettiin 16 tuntia huoneen lämpötilassa ja se sentri-fugoitiin sitten (12 000 g/1 h) huoneen lämpötilassa. Vaahto ja sakan yläpuolella oleva neste heitettiin pois ja kakku suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0 (100 ml), ja sentrifugoitiin jälleen edellä esitetyllä tavalla. Geelimäistä kakkua (80 g) varastoitiin lämpötilassa 4°C.

(b) PAGAN149HDOD-1-G

_7

Penisilliiniasylaasiliuos (20 ml, 1,36 x 10 yks., 136 mg proteiinia) säädettiin pH-arvoon 6,2 ja lisättiin glutaraldehydiä (2 ml; 25 %:sta paino/til. vedessä). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa ja lisättiin suspensio, jossa oli GAN149HDOD-1 (10 g) 0,1-m natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,0 (12 ml). pH pidettiin arvossa 6,2 sekoittamista jatkettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Suspensiota sentrifugoitiin 1 tunti (20 000 g/4°C) ja kakku (14 g) otettiin talteen. Kakku suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0 (10 ml), ja sentrifugoiminen toistettiin. Lopullista kakkua varastoitiin lämpötilassa 4°C.

i9 5 9 2 6 5

Spesifinen aktiivisuus: 3 x 10 ^ moolia 6-APA min ^ (5 % peni silliini G:tä, pH 7,8 22°C)

Talteenotettu aktiivisuus: 21 %. Voidaan saattaa kellumaan n-dekano- lin tai n-dekaanin avulla.

Esimerkki 4 (a) GÄN149HDOD-2

Etanoliin (50 ml) liuotettiin n-oktadekyyliamiinia (5 g) ja lisättiin 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 9,0 (1 litra), joka sisälsi etanolia (200 ml). Gantrez 149 (5 g) lisättiin pienissä määrissä 3/4 tunnin kuluessa samalla sekoittaen. pH pidettiin välillä 8 ja 9 2-n NaOH:n avulla. Gantrez-lisäyksen jälkeen lisättiin 1,6-diaminohek-saania (5 g) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 6 tuntia. pH alennettiin sitten arvoon 3,0 väkevän HCl:n avulla ja suspensio sentrifugoitiin (12 000 g/1 h) huoneen lämpötilassa. Sakan yläpuolella oleva neste heitettiin pois ja kakku suspendoitiin uudelleen veteen (550 ml) ja sentrifugoitiin uudelleen lopullisen valkoisen kakun (150 g) saamiseksi, jota varastoitiin lämpötilassa 4°C.

(b) PAGAN149HDOD-2-G

Penisilliiniasylaasiliuosta (100 ml, 9,8 x 10 6 yks., 88 mg proteiinia) sekoitettiin GAN149HDOD-2:n (15 g), 0,1-m natriumfosfaatti-puskurin, pH 6,0 (20 ml), ja 2 %:n paino/til. natriumatsidia (1 ml) kanssa ja homogenoitiin lyhyen ajan lämpötilassa 0°. Seos säädettiin pH-arvoon 6,8 lämpötilassa 0°C 4 1/2 tunnin ajaksi ja sentrifugoitiin sitten (20 000 g/4°C/l h). Kakku suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0, ja sentrifugoitiin jälleen. Nämä käsittelyt toistettiin sitten lopullisen kakun, paino 11,2 g, saamiseksi, jota varastoitiin lämpötilassa 4°C.

Spesifinen aktiivisuus: 1,8 x 10 5 moolia 6-APA min-^ g-1.

(Olosuhteet samat kuin edellä)

Aktiivisuuden talteenotto: 55 %. Voitiin saattaa kellumaan n-dekano- lilla tai n-dekaanilla.

Esimerkki 5

Penisilliiniasylaasi (n-oktadekyyliamino Gantrez AN 119) (PAGAN1190D) Gantrez AN 119 (0,5 g) liuotettiin dimetyyliformamidiin (2,5 ml) ja lämmitettiin lämpötilaan 80°C vesihauteen avulla. Oktadekyyliamii-nia (0,28 g) liuotettiin myös dimetyyliformamidiin (2,5 ml) lämpö- 20 5 9 2 6 5 tilassa 80°C ja lisättiin nopeasti Gantrez-liuokseen kuumana. Seosta sekoitettiin ja lisättiin pyridiiniä (0,1 ml). Jäähdyttämisen jälkeen huoneen lämpötilaan 1 tunnin kuluessa lisättiin koko liuos penisilliiniasylaasiin (175 mg) vedessä (30 ml), pH 7,0, ja homogenoitiin lyhyesti lämpötilassa 0°C.

Vaaleanpunaista seosta sekoitettiin sitten lämpötilassa 0°C 3 tuntia, pH pidettiin lämpötilassa 4°C 16 tuntia, natriumkloridia (5,8 g) liuotettiin suspensioon ja seosta sentrifugoitiin (25 000 g/0°C/l h). Saatu vaaleanpunainen kakku painoi 4,0 g ja se suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0 (20 ml).

Käytettäessä 5 % paino/til. penisilliini G:tä 0,02-m natriumfosfaat-tipuskurissa, pH 7,8 (20 ml), lämpötilassa 25°C, oli tämän suspension spesifinen aktiivisuus 4,0 x 10 ^ moolia/min/ml. Tämä vastaa suunnilleen 70 %:n aktiivisuuden talteenottoa konjugaatissa. Edellä esitetty suspensio (4,0 ml) sekoitettiin 0,02-m natriumfosfaatti-puskurin (20 ml) ja n-dekanolin (5 ml) kanssa ja homogenoitiin (4000 kierr/min, 5 min) lämpötilassa 0°C. Emulsiota sentrifugoitiin (100 g) huoneen lämpötilassa 20 min ja erotettiin ylemmäksi orgaaniseksi emulsioksi ja alemmaksi vesikerrokseksi. Alempi kerros säilytettiin ja ylempi kerros suspendoitiin uudelleen 0,02-m nat-riumfosfaattipuskuriin (20 ml) ja sentrifugoitiin jälleen. Alkuperäisen alemman kerroksen kokonaisaktiivisuus oli 1,25 x 10 ^moolia/ min ja pestyn ylemmän kerroksen aktiivisuus 9,5 x 10~5 moolia/min. Spesifisten aktiivisuuksien suhde (tilavuuden perusteella laskettuna) on 21,6 (ylempi/alempi). Aktiivisuuden määräämisen jälkeen edellä mainitulla menetelmällä kierrätettiin orgaaninen kerros uudelleen varovasti sentrifugoimalla ja poistamalla vesikerros taulukossa 5 esitetyllä tavalla.

Taulukko 5 PAGAN 1190D-n-dekanolifaasin alkuperäisen aktiivisuuden talteen-ottoprosentti peräkkäisissä flotaatio-uudelleenkäyttöjaksoissa

Jakso n:o Aktiivisuus-% Jakso n;o Aktiivisuus-% 1 80 7 46 2 86 8 46 3 93 9 44 4 73 10 42 5 64 11 45 6 47 12 43 2i 5 9265

Esimerkki 6

Penisilliiniasylaasl (n-dodekyyliamino Gantrez AN 119) (PAGAN119DD) Dimetyyliformamidiin (1 ml) liuotettiin n-dodekyyliamiini-Gantrez AN 119 (0,25 g) ja lisättiin penisilliiniasylaasin liuokseen (noin 100 mg 14 ml:ssa 0,1-m natriumfosfaattipuskuria, pH 7,0).

Lyhyen homogenoimisen jälkeen lämpötilassa 0°C sekoitettiin suspensiota 16 tuntia lämpötilassa 4°C. Sitten lisättiin ammoniumsulfaat-tia (7,8 g) homogeeniseen liuokseen lämpötilassa 4°C ja pH pidettiin arvossa 7,0 1-m natriumkarbonaattiliuoksen avulla. Ammoniumsulfaatin liukenemisen jälkeen muodostui samea suspensio. Tätä materiaalia sentrifugoitiin (25 000 g/0°C/l h). Kakku suspendoitiin uudelleen ammoniumsulfaatin (7,8 g) liuokseen vedessä (30 ml), pH 7,0, ja sentrifugoitiin jälleen. Lopullinen kakku painoi 1,36 g ja se liuotettiin uudelleen veteen (10 ml), jolloin saatiin viskoosi liuos. Kakun aktiivisuus (edellä esitetty koe) oli 1,62 x 10~4 moolia/min/g märkäpainoa, mikä vastasi 80 %:n aktiivisuuden talteenottoa. Vesiliukoisen konjugaatin liikkumattomaksi tekeminen n-dekanolipisaroille esitetään seuraavan esimerkin avulla: 1 ml edellä mainittua liuosta liuotettiin 0,02-m natriumfosfaatti-puskuriin (20 ml) ja homogenoitiin n-dekanolilla (10 ml) nopeudella 4000 kierr/min 3 min lämpötilassa 0°C. Emulsio erotettiin kerroksiksi sentrifugoimalla (300 mg) 10 min. Ylemmän kerroksen kokonais-aktiivisuus oli 1,14 x 10 ^ moolia/min ja sen aktiivisuus peräkkäisissä uudelleenkiertokäsittelyissä on esitetty taulukossa 6.

Toisessa kokeessa homogenoitiin 2 ml entsyymikonjugaattiliuosta samoissa olosuhteissa n-dekanolilla (2,5 ml) ja 0,02-m natriumfos-faattipuskurilla (10 ml). Sentrifugoimisen ja pesemisen jälkeen -5 20 ml:11a samaa puskuria oli ylemmän kerroksen aktiivisuus 1,8 x 10 moolia/min ja alemman kerroksen aktiivisuus oli 8,0 x 10 ^ moolia/ min. Ominaisaktiivisuuksien suhde (yläkerros/alakerros tilavuuden perusteella) oli noin 7,5.

Taulukko 6 PAGAN119DD-n-dekanolifaasin alkuperäisen aktiivisuuden talteenotto-prosentti peräkkäisissä vaahdotus-uudelleenkäyttöjaksoissa

Jakso n:o Aktiivisuus-% 1 96 2 66 3 66 4 53 2 2 59265

Esimerkki 7 (a) Hydrolysoitu n-oktadekyyliamino Gantrez AN 119 hydratsidi (GAN1190DH)

Gantrez AN 119 (5 g) liuotettiin dimetyyliformamidiin (20 ml) ja kuumennettiin lämpötilaan 60°C vesihauteessa. Sitten lisättiin n-oktadekyyliamiinin (2,8 g) liuos kuumassa (80°C) dimetyyliformami-dissa (30 ml) ja seosta pidettiin lämpötilassa noin 60°C 1 tunti. Jäähdyttämisen jälkeen huoneen lämpötilaan lisättiin liuos hydrat-siinihydraatin (10 ml) ja dimetyyliformamidin (50 ml) seokseen huoneen lämpötilassa. Muodostui hieman ruskehtava sakka ja seosta sekoitettiin 10 min ja lisättiin vettä (500 ml). Saatiin saippua-mainen vihreä liuos, ja kun oli sekoitettu 15 min, säädettiin pH arvoon 7,0 väkevän HCl:n avulla ja lisättiin natriumkloridia (50 g). Tapahtui höytelöityminen ja suspensio sentrifugoitiin (10 000 g/30 min/ 4°C). Pelletti suspendoitiin uudelleen veteen (400 ml) ja sekoitettiin 16 g lämpötilassa 4°C ja sentrifugoitiin sitten edellä esitetyllä tavalla, jolloin saatiin sinisen harmaa kakku (märkäpaino 39 g).

(b) Penisilliiniasylaasi (n-oktadekyyliamino Gantrez AN 119)-hydratsidin kanssa kytketty PAGAN1190DH

GAN1190DH (5 g märkäpaino) suspendoitiin 2-n HCltään (50 ml) ja sekoitettiin lämpötilassa 0°C 15 min. Lisättiin natriumnitriitin (0,5 g) liuos vedessä (5 ml) ja seosta sekoitettiin lämpötilassa 0°C 10 min, se sentrifugoitiin sitten (25 000 g/30 min/0°C) ja pelletti suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH

8,0 (50 ml), lämpötilassa 0°C. Tämä suspensio lisättiin penisil-liiniasylaasiliuokseen (100 ml, joka sisälsi 55 mg proteiinia) ja säädettiin pH-arvoon 8,0. Suspensiota sekoitettiin lämpötilassa 4°C 72 tuntia ja sentrifugoitiin sitten (25 000 g/1 h/0°C), suspendoitiin uudelleen 0,1-m natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,0, ja sentrifugoitiin jälleen. Pelletin lopullinen paino 3,74 g. Spesifinen aktiivisuus (koe suoritettiin edellä esitetyllä tavalla): 5,2 x 10 moolia/min/g. Aktiivisuuden talteenotto: 32,5 %.

Edellä esitetyn konjugaatin suspensio 0,1-m natriumfosfaattipusku-rissa, pH 7,0 (0,29 g/ml, 2,5 ml), sekoitettiin 0,02-m natriumfos-faattipuskurin, pH 7,8 (20 ml), kanssa ja homogenoitiin n-dekano-lilla (7,5 ml) lämpötilassa 0°C 2 min, ja sentrifugoitaessa kierros-nopeudella 5000 kierr/min (100 g, 10 min) saatiin kaksi kerrosta.

23 59265 — 6

Alemman kerroksen kokonaisaktiivisuus oli 1,8 x 10 moolia/min ja ylemmän kerroksen aktiivisuus oli pesemisen jälkeen edellä mainitulla puskurilla (20 ml) 1,9 x 10 ^ moolia/min. Spesifisten aktiivisuuksien suhde (ylempi/alempi tilavuuden perusteella) oli noin 30. Uudelleenkierrätystulokset ylempää faasia käytettäessä on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7 PAGANl90DH-n-dekanolifaasin alkuperäisen aktiivisuuden talteen-ottoprosentti käytettäessä peräkkäisiä vaahdotusuudelleenkäyttö-jaksoja

Jakso n:o Aktiivisuus-% 1 90 2 84 3 74

Esimerkki 8

Bentsyylipenisilliinin entsymaattinen lohkaiseminen 6-aminopeni-sillaanihapon valmistamiseksi 1.0 g Gantrez AN 119 liuotettiin 10 ml:an dimetyyliformamidia ja lisättiin 0,56 g oktadekyyliamiinia. Seosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa.

48 ml osittain puhdistettua penisilliiniasylaasi-preparaattia säädettiin pH-arvoon 9,0 1-m natriumkarbonaattiliuoksen avulla. Sitten lisättiin Gantrez-hartsin liuos kahdessa yhtä suuressa erässä samalla homogenoiden ja pH säädettiin näiden kahden lisäyksen välillä. Seosta sekoitettiin sitten 3 tuntia, jolloin pH pidettiin arvossa 9.0 lisäämällä 1-m natriumhydroksidiliuosta.

Entsyymi-hartsi otettiin sitten talteen sentrifugoimalla, suspendoi-tiin uudelleen 120 ml:an 0,1-m fosfaattipuskuria, pH 7,0, ja homogenoitiin 30 sek. Entsyymi-hartsi otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin.

20 g entsyymigeeliä homogenoitiin 80 ml :11a n-dekaania ja 20 ml :11a 0,02-m fosfaattipuskuria, pH 7,8, 1 min. Homogenaatti lisättiin 250 ml:an tislattua vettä. Seos kuumennettiin lämpötilaan 37°, säädettiin pH-arvoon 7,8 ja lisättiin kaliumbentsyylipenisilliiniä (21,8 g).

24 59265

Seosta sekoitettiin 5 tuntia ja pH pidettiin arvossa 7,8 lisäämällä 4 %:sta (paino/til.) natriumhydroksidiliuosta. Reaktion lopussa seos lisättiin erotussuppiloon ja entsyymin annettiin erottua vesi-faasista. Tähän meni 30 min. Vesipitoinen kerros poistettiin sitten ja 6-amino-penisillaanihappo uutettiin seuraavalla tavalla.

Liuos väkevöitiin 1/4 tilavuuteen, jäähdytettiin lämpötilaan 5° ja yhtä suuri tilavuusmäärä metyyli-isobutyyliketonia lisättiin samalla sekoittaen. pH-arvo alennettiin 4,3:ksi lisäämällä väkevää typpihappoa, jonka jälkeen 6-aminopenisillaanihappo saostettiin. Kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja asetonilla ja kuivattiin yli yön lämpötilassa 40°.

Saatiin 7,65 g 6-aminopenisillaanihappoa.