IT8320693A1

IT8320693A1 - Procedimento per l'immobilizzazione di materiali biologici in polimeri condensati di polialchilenimmine, composti contenenti un materiale biologico attivo e immobilizzato e procedimenti per la produzione di acido aspartico, di fenilanilina e di triptofano

Info

Publication number: IT8320693A1
Application number: IT1983A20693A
Authority: IT
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-04-20
Filing date: 1983-04-20
Publication date: 1984-10-20
Also published as: SE8302073D0; FI831203L; LU84756A1; IT8320693A0; PL241572A1; ES8502158A1; DK171383A; GB8310650D0; NL8301379A; DE3314294A1; ZA832243B; AU1344483A; IL68274A0; ES521622A0; DD212747A5; IT1164193B; JPS58190393A; GR78302B; BE896509A; FR2525234A1

Description

DESCRIZIONE del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

"Procedimento per l'immobilizzazione di materiali biologici in polimeri condensati di polialchilenimmine, composti contenenti un materiale biologico attivo e immobilizzato e procedimenti per la produzione di acido aspartico, di fenilanilina e di triptofano"

RIASSUNTO

Materiali biologici vengono immobilizzati mediante polimeri condensati di polialchilenimmina. La condensazione del polimero viene ottenuta collegando a ponte i gruppi amminici delle catene polimeriche della polialchilenimmina con un acido policarbossilico, in presenza di un agente di condensazione.

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento di immobilizzazione di materiali biologici. Pi? particolarmente l'invenzione riguarda l?immobilizzazione di materiali biologici mediante loro intrappolamento in un polimero.

Materiali biologici come enzimi o microorganismi o cellule producenti enzima, vengono spesso utilizzati quali catalizzatori per reazioni di sintesi e nelle tecniche analitiche. Tali catalizzatori sono desiderabili in quanto operano con elevata specificit? ed efficienza in condizioni di reazione generalmente blande.

Poich? gli enzimi ed altri biocatalizzatori sono generalmente solubili in acqua, essi sono adatti per l'uso in sistemi di reazione in discontinuo. La riutilizzazione di tali enzimi e di altri biocatalizzatori ? limitata, in vista delle difficolt? di recuperare detti materiali dal mezzo di reazione spento, in forma attiva o in forma utilizzabile. Inoltre i materiali hanno la tendenza di restare nel prodotto preparato quali contaminanti. Allo scopo di evitare questi problemi, sono stati sviluppati procedimenti di immobilizzazione di materiali biologici che presentano attivit? catalitica su supporti solidi ed insolubili. L'immobilizzazione ? intesa a produrre un materiale biologico stabilizzato che pu? resistere all'usura derivante dall'uso ripetuto o continuo.

Sono stati riportati vari sistemi di immobilizzazione per i materiali biologici. Gli enzimi sono stati immobilizzati mediante assorbimento in materiali insolubili come carbone di legno, vetro, cellulosa, gel di fosfato di calcio, montmorillonite, resine organiche a scambio ionico ed altri. L'immobilizzazione ? anche stata ottenuta intrappolando con amido e acrilammide gel, con legame covalente tra gli enzimi ed i polimeri organici insolubili, come pure con legame covalente tra le molecole dell'enzima stesso.

I procedimenti della tecnica nota danno spesso luogo a prodotti con attivit? enzimatica ridotta, quando confrontata con quella del corrispondente materiale biologico non legato. Questi materiali biologici sono noti per la loro sensibilit? alla denaturazione o disattivazione termica e chimica. La perdita di attivit? biologica ha spesso luogo quando le operazioni di immobilizzazione vengono condotte in condizioni severe, che possono essere particolarmente problematiche quando vengono utilizzate reazioni di condensazione polimerica. Inoltre i prodotti risultanti dai procedimenti della tecnica nota sono spesso svantaggiosi relativamente alle loro caratteristiche di idrofilia, resistenza, durata e porosit?.

E' stato ora trovato che i materiali biologici possono essere immobilizzati in maniera semplice ed economica, pur mantenendo ad un grado elevato la loro attivit? catalitica. Il procedimento della presente invenzione produce un composito di materiale biologico insolubilizzato, che contiene il materiale biologico intrappolato in un polimero condensato di polialchilenimmina. Sebbene il compo? sito venga preparato facendo avvenire le reazioni di condensazione del polimero in presenza del materiale biologico, le condizioni di reazione sono cos? blande che avviene una perdita molto piccola di attivit?. Tali compositi presentano eccellenti valori di resistenza e di durata. Inoltre le caratteristiche idrofile di questi materiali possono essere aggiustate variando il grado di condensazione. Il procedimento della presente invenzione produce un composito che pu? essere separato dalle miscele di reazione mediante semplice filtrazione, oppure pu? essere utilizzato in procedimenti di reazione in continuo, come quelli in cui un substrato reattivo fluisce attraverso un reattore a colonna impaccato.

In accordo con il procedimento della presente invenzione, un polimero di polialchilenimmina viene condensato con una quantit? condensante di un acido policarbossilico in presenza di una quantit? condensante di un agente di condensazione, in cui detto materiale biologico viene mescolato con detto polimero di polialchilenimmina durante detta reazione di condensazione. L'aggiunta dell'agente di condensazione comporta la formazione di un composito di materiale biologico insolubilizzato, in cui il materiale biologico ? immobilizzato nel polimero. L'immobilizzazione del materiale biologico nel polimero pu? avvenire mediante intrappolamento fisico, come pure mediante legame covalente tra la polialchilenimmina o l'agente di condensazione ed i gruppi reattivi nel materiale biologico. Per esempio il materiale biologico pu? essere immobilizzato tramite il legame covalente, in quanto i gruppi amminici e carbossilici del materiale biologico possono sostituirsi ad un gruppo amminico sulla polialchilenimmina oppure ad un gruppo carbossilico sull'acido policarbossilico ed infine risultano legati covalentemente al polimero.

Il procedimento della presente invenzione consente la preparazione di un'ampia variet? di compositi di materiale biologico, che possono differire tra di loro per quanto riguarda le caratteristiche idrofile, di resistenza, di durata e di porosit?. Diminuendo il grado di condensazione si pu? ottenere un composito dotato di una maggiore solubilit? in acqua. L'aggiunta di agenti di reticolazione polifunzionali pu? aumentare la resistenza e la durata del composito polimero-materiale biologico, mentre l'aggiunta di gruppi funzionali condensa ulteriormente il polimero di polialchilenimmina.

La porosit? globale della matrice pu? essere aumentata mediante l'aggiunta di un materiale in particelle solubile in acqua alla miscela del polimero prima di completare la condensazione. Il materiale anidro viene successivamente allontanato mediante aggiunta di acqua dopo la condensazione, ci? che discioglie il solido. La porzione del composito precedentemente spostata dai solidi viene lasciata vuota, aumentando cos? la porosit? della matrice. Per aumentare la porosit? della miscela si pu? utilizzare qualsiasi materiale in particelle solubile in acqua che non influenza negativamente in modo significativo il polimero o il materiale biologico. Acidi policarbossilici solubili in acqua, come quelli fatti interagire con la polialchilenimmina non condensata, sono particolarmente adatti per aumentare la porosit? della matrice, in quanto le quantit? in eccesso utilizzate per incrementare la porosit? non interferiscono sostanzialmente con le reazioni di condensazione.

Le polialchilenimmine utilizzate nel procedimento e nei compositi della presente invenzione, sono polimeri che possono essere sintetizzati mediante polimerizzazione di addizione catalizzata con acidi di monomeri alchilenimmina. Tali polimeri variano generalmente da 30.000 a 100.000 per quanto riguarda il peso molecolare, in dipendenza delle condizioni di reazione e preferibilmente presentano una struttura di catena ramificata.

La polietilenimmina (PEI) ? la polialchilenimmina preferita, in quanto attualmente ? reperibile con facilit? con costo relativamente basso e funziona bene nelle reazioni di condensazione utilizzate secondo il presente procedimento. La polietilenimmina viene prodotta mediante polirnerizzazione con apertura dell'anello di etilenimmina in presenza di catalizzatori, come acidi minerali. Il polimero ? altamente ramificato e contiene gruppi amminici primari, secondari e terziari. PEI ? solubile in acqua e dopo condensazione delle catene polimeriche, d? luogo ad un prodotto insolubile in acqua. Un procedimento altamente efficiente di condensazione utilizza un acido policarbossilico (PCA) per collegare a ponte i gruppi amminici su catene adiacenti di PEI. Gli agenti di condensazione, preferibilmente le carbodiimmidi, influenzano facilmente la condensazione. Le reazioni coinvolte nella formazione di polietilenimmina condensata della presente invenzione vengono illustrate di seguito:

La reazione (1) illustra la polimerizzazione della etilenimmina per formare PEI dotata di una struttura di catena ramificata, in cui n e n' sono interi superiori a 0 e n" pu? essere 0 (indicando che il gruppo

? assente) oppure pu? essere superiore a 0. La reazione

(2) mostra la formazione di un sale dei gruppi amminici di PEI con un acido policarbossilico, in cui R pu? essere un legame diretto oppure un gruppo idrocarburico sostituito o non sostituito, ad esempio un idrocarburo a catena lineare o ramificata portante eventualmente gruppi aliciclici, olefinici o aromatici, come pure vari gruppi funzionali, come idrossili, carbonili, gruppi carbossilici, ammine, nitrili, ammidi, esteri e simili, che non influenzano negativamente la reazione di condensazione, i materiali biologici, oppure il composito risultante. Tali gruppi possono variare in un ampio ambito, per provvedere un ampio ambito di acidi policarbossilici utili, come di seguito descritto. Le reazioni (3) e (4) mostrano la condensazione di PEI e del policarbossilico, utilizzando carbodiimide quale agente di condensazione. R1 e R" sono gruppi idrocarburici, che, unitamente agli altri reagenti e nelle condizioni delle reazioni illustrate, vengono descritti pi? dettagliatamente in seguito.

In generale gli acidi policarbossilici adatti per l?uso secondo la presente invenzione possono essere acidi carbossilici sostituiti o non sostituiti, dotati di almeno due gruppi carbossilici. Preferibilmente gli acidi policar? bossilici sono solubili in acqua, cosicch? possono essere utilizzati per aumentare la porosit? del composito, come pure per condensare la polialchilenimmina. Esempi di acidi policarbossilici che possono essere utilizzati nei procedimenti e nei compositi della presente invenzione, comprendono gli acidi adipico, azelaico, 1,ll-undecandioico,l,12-dodecandioico,traumatico, pentadecandioico, esadecandioico, sebacico, suberico, glutarico, maionico, pimelico, succinico, malico, maleico, glutammico, aspartico, ossalico, fumarico, poliaspartico e simili. Gli acidi bicarbossilici sono preferiti per l'uso secondo la presente invenzione e comprendono gli acidi maleico, succinico, glutarico ed adipico. Acidi policarbossilici superiori comprendono qualsiasi sostanza che contenga due o pi? gruppi acidi carbossilici, ad esempio materiali polimerici con peso molecolare elevato, come l'acido poliaspartico, avente un peso molecolare da circa 5.000 a 70.000. Le reazioni di condensazione sono generalmente esotermiche, pertanto la miscela di reazione viene vantaggiosamente raffreddata ad una temperatura che non influenza negativamente il materiale biologico da immobilizzare, ad esempio circa 37? o meno.

Il rapporto molare dell'acido policarbossilico rispetto alla polialchilenimmina (PCA:PAI) pu? variare entro ampi limiti, data la variazione del peso molecolare dei reagenti. Generalmente l'acido policarbossilico pu? essere utilizzato in qualsiasi quantit? di condensazione ed il rapporto di PCA rispetto a PAI varia generalmente da 1:20 a 1:0005. Nel caso in cui l'acido policarbossilico viene aggiunto per aumentare la porosit? del composito della presente invenzione, viene spesso utilizzato un considerevole eccesso molare dell'acido policarbossilico.

Nella preparazione dei compositi, si pu? utilizzare qualsiasi ordine di aggiunta degli ingredienti. Ad esempio il materiale biologico da immobilizzare pu? essere introdotto in qualsiasi momento prima della solidificazione del polimero, ma ? preferibile che venga aggiunto dopo l'aggiunta dell'acido policarbossilico alla polialchilenimmina. Un procedimento preferito per la preparazione dei compositi della presente invenzione, consiste nell'aggiungere una quantit? condensante di un acido policarbossilico alla polialchilenimmina in condizioni di prepolimerizzazione per formare un prepolimero solubile in acqua. Il prepolimero ? generalmente un liquido viscoso, al quale il materiale biologico pu? essere aggiunto convenientemente e mantenuto in sospensione durante la reazione di condensazione. Viene quindi aggiunto l'agente di condensazione per provocare la condensazione e la solidificazione del composito polimero-materiale biologico. Il pH della miscela di reazione viene mantenuto ad un livello che non disattiva sostanzialmente o che non influisce in modo negativo sul materiale biologico. Il pH pu? variare da circa 2 a 12 e preferibilmente varia da circa 5 a 10.

La quantit? di materiale biologico aggiunto al polimero pu? variare in accordo con l'uso finale specifico del composito di materiale biologico. Generalmente esso varia da circa 0,001 a 10 g (su base anidra del peso) per grammo di pol?alchilenimmina utilizzata, preferibilmente da circa 0,1 g a 5 g per grammo di PAI. Il materiale biologico pu? comprendere enzimi, celle microbiche, antigeni, anticorpi, antibiotici, carboidrati, coenzimi, cellule di piante, cellule animali, batteri, lieviti, funghi, colture di tessuti o miscele relative. Gli enzimi possono essere aggiunti alla miscela di reazione in soluzione acquosa o sotto forma di polvere, preferibilmente in quest'ultima forma. Le cellule possono essere aggiunte sotto forma di pasta umida o di particelle anidre.

Come sopra indicato, per far avvenire la condensazione delle catene di pol?alchilenimmina con gli acidi policarbossilici, viene vantaggiosamente utilizzato un agente di condensazione. Generalmente si pu? utilizzare qualsiasi agente di condensazione che catalizza o facilita la reazione delle ammine e degli acidi carbossilici. Esempi di tali agenti di condensazione comprendono: N-etil-5-fenil--isoazolio-3-solfonato, n-etossicarbonil-2-etossi-l,2?di? idrochinolina e varie carbodiimmidi. Sono preferiti gli agenti di condensazione carbodiimmide e tali agenti comprendono generalmente composti con formula R'-N=C-N-R", in cui R1 e R" sono gruppi idrocarburici contenenti da 3 a circa 20 atomi di carbonio, preferibilmente da circa 5 a circa 12 atomi di carbonio. Tali agenti di condensazione carbodiimmide comprendono l-etil-3,3-dimetilamminopropil cabodiimmide, dicicloesil carbodiimmide, 1-cicloesil?3-(2--morfolinoetile) carbodiimmide meto-p-toluene solfonato e sali relativi. Gli agenti di condensazione carbodiimmide vengono aggiunti alla miscela di reazione in quantit? condensanti, che generalmente sono costituite dalla quantit? stechiometrica; ad esempio da circa 0,2 a 3 volte, preferibilmente da circa 0,5 a 1,5 volte la quantit? stechiometrica. Ciascuna molecola della carbodiimmide reagisce con un singolo gruppo acido dell'acido policarbossilico. Per esempio vengono generalmente utilizzati rapporti molari carbodi? immide/acido dicarbossilico di circa 2:1 nel procedimento della presente invenzione; tuttavia rapporti molari molto inferiori vengono utilizzati se viene utilizzato un eccesso di acido policarbossilico, per incrementare la porosit? del composito. Dopo aggiunta dell'agente di condensazione alla temperatura ambiente, avviene una polimerizzazione notevole entro 30 secondi, che generalmente va a completamento entro circa 2 ore.

Attuazioni specifiche della presente invenzione possono comportare addizionalmente il post-trattamento del composito con un agente di reticolazione amminico per impartire stabilit? e resistenza addizionali. Gli agenti di reticolazione comprendono dialdeide glutarica, diisocianati, poliisocianati, 2,4,6-tricloro-S-triazina, bisossirano, bisimmidato, divinilsolfone, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene e simili. La di?ldeide glutarica ? preferita per questo scopo.

Mediante l'uso dei procedimenti sopra descritti dalla presente invenzione, risulta possibile immobilizzare una grande variet? di materiali biologici per produrre nuovi compositi biocatalitici. Negli esempi che seguono, le procedure di immobilizzazione vengono descritte in maggior dettaglio. Questi esempi descrivono il metodo ed il procedimento per fabbricare ed utilizzare la presente invenzione ed illustrano varie attuazioni dell'invenzione, ma non sono stati riportati a scopo limitativo.

ESEMPIO I

Polietilenimmina (4,0 g di soluzione acquosa al 30%) fu miscelata con acido succinico (2 grammi). La temperatura della miscela di reazione aument? a 45?C e si lasci? raffreddare a 22?C. A questo punto la miscela risultante era un prepolimero solubile in acqua. Fu preparata una soluzione di aspartasi acquoso libero da cellule in accordo con le procedure dell'esempio I, paragrafo 1, della domanda di brevetto U.S. numero di serie 311.618, depositata il 15 ottobre 1981. Un mi della soluzione di aspartasi fu quindi appiunto alla miscela del prepolimero solubile in acqua che fu successivamente condensato mediante l'aggiunta di cloroidrato di l-etil-3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide sotto forma di polvere. L'aggiunta dell'agente di condensazione comport? la polimerizzazione entro 30 secondi che dava un composito di materiale biologico fissato sotto forma di gel. Il gel fu quindi macinato in un mortaio con un pestello per dare piccole particelle.

ESEMPIO II

Il composito di materiale biologico in particelle dell'esempio I fu posto in 50 ml di una soluzione di fumarato di ammonio 1 molare, di solfato di magnesio 1 millimolare, a pH 8,5 e la miscela fu agitata per 30 minuti. La soluzione fu filtrata e la procedura fu ripetuta due volte, con la seconda agitazione continuata per 16 ore. Le particelle furono quindi poste in 35 mi della stessa soluzione del substrato fumarato di ammonio a 37?C. Dopo un'ora, le particelle biologicamente attive furono trovate aver convertito 1509 u moli di fumarato di ammonio in acido L-aspartico. Le particelle furono quindi risciacquate con substrato fresco, parzialmente anidrificate e poste ancora in 35 mi di soluzione di substrato di fumarato di ammonio a 37?C. Ancora, dopo un'ora, 1509 ? moli di fumarato di ammonio erano state convertite in acido L-aspartico, indicando che era stata mantenuta l'attivit? biologica del composito.

ESEMPIO III

Polietilenimmina (6 g) fu mescolata con acido succinico in polvere (3 g) e si lasci? raffreddare alla temperatura ambiente. Una pasta di cellule umide contenente circa 75% di acqua in peso, fu preparata da E. coli contenente aspartasi fresco, mediante la procedura che segue. Un mezzo di fermentazione fu preparato disciogliendo in un litro di acqua, 24 grammi di estratto di lievito, 30 grammi di acido fumarico, 2 grammi di carbonato di sodio, solfato di magnesio 2 mM e cloruro di calcio 0,1 mM ed il valore di pH fu aggiustrato a circa 7,2 con idrossido di ammonio. Questo mezzo fu inoculato con 1 ml di una coltura di E. coli (ATCC No. 31976), che era stato sottoposto ad incubazione per 12-16 ore a 37?C in un mezzo di peptone contenente 0,5% di glutammato monosodico. Il mezzo,inoculato fu sottoposto ad incubazione per 12-14 ore a 37?C. Le cellule furono raccolte centrifugando a 5000 giri per minuto per 30 minuti. Tre grammi della pasta di cellule umide furono aggiunti uniformemente al prepolimero. Fu quindi aggiunto cloroidrato di l-etil-3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide (EDAC-HC1) (2 g) e si sottopose a miscelazione per circa un minuto. Fu polimerizzata la miscela risultante. Dopo riposo nelle condizioni ambientali per 2 ore la miscela polimerizzata fu macinata in particelle. Le particelle di gel furono quindi immerse in soluzione acquosa di fumarato di ammonio 1,5 M, pH 8,5, a 22?C. Questa immersione fu ripetuta con substrato fresco, quindi il gel fu risciacquato con una terza aliquota del substrato. Il gel fu saggiato per l'attivit? aspartasi misurando la scomparsa dell'acido fumarico in uno spettrofotometro a 240 nm. Le particelle del gel furono agitate continuamente alla temperatura ambiente in un reattore discontinuo per un'ora, in presenza di 75 ml di substrato. Fu osservata una conversione pari a circa 98%, che corrisponde all'equilibrio noto di reazione. La reazione fu quindi ripetuta con risultati simili. La tabella I mostra la diminuzione della concentrazione di fumarato di ammonio con il tempo per due reazioni in discontinuo.

ESEMPIO IV

Met? del gel utilizzato per le reazioni in discontinuo dell'esempio III, fu caricata in una colonna con diametro pari a 0,9 cm. Il volume risultante del letto era pari a 14 ml. Una soluzione di fumarato di ammonio 1,5 M (22?C;

pH 8,5) fu pompata attraverso la colonna (flusso verso l'alto) con volume spaziale 1 (SV) per ora (14 ml/ora)

in modo continuo per 70 giorni. Campioni dell'effluente

furono analizzati in relazione alla scomparsa del fumarato

di ammonio. I risultati sono riportati nella tabella II

che segue. La velocit? iniziale di conversione della collonna era pari a 190 g di fumarato di ammonio per litro di

volume del letto e per ora a 22?C e questa velocit? cadeva

a 168 g/l/ora dopo 70 giorni di operazione continua. Ci? rappresenta una perdita di produttivit? pari soltanto al

12A??

1

ESEMPIO V

PEI (3 grammi) fu mescolato con 1,4 grammi di acido succinico e si lasci? raffreddare alla temperatura ambiente. 1,5 grammi di cellule di lievito raccolte, Rhodotorula

rubra (ATCC-4056) contenenti attivit? fenilalanina ammoniaca-liasi furono mescolate nella miscela. Fu aggiunto un

grammo di -l-etil-3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide cloridrato e si agit? per 1 minuto. La miscela risultante polimerizz? in un materiale del tipo gel duro. Il gel fu macinato in un mortaio con un pestello quindi disperso, lavato e ridisperso in una soluzione del substrato contenente acido t-cinnamico e idrossido di ammonio a pH 9,5. Il materiale lavato rimaneva di color rosso, mentre la soluzione di lavaggio era visivamente incolore e l?mpida, ci? che indicava che le cellule rosse di R. rubra rimanevano nelle particelle del composito. Dopo 39 ore, la miscela risultante di reazione fu filtrata ed il filtrato fu analizzato in relazione a L-fenilalanina. La concentrazione di fenilalanina nel filtrato fu trovata pari a circa 0,5 grammi/litro.

ESEMPIO VI

Fu condotta una serie di prove per studiare gli effetti dell'acido policarbossilico sul sistema. Per ciascuna prova fu seguita la procedura dell'esempio III, con le seguenti varianti: furuno utilizzati 3 grammi di PEI, 2 grammi di acido policarbossilico, 1,5 grammi di EDAC.HC1 ed 1 grammo di pasta di cellule di E. coli. Una reazione di immobilizzazione separata fu condotta per ciascuno dei seguenti acidi policarbossilici: acido azelaico, 1,11-undecandioico, 1,12-dodecandioico, traumatico, pentadecandioico, esadecandioico, sebacico, suberico, glutarico, malonico e pimelico. Ciascun acido policarbossilico era efficace nella immobilizzazione delle cellule. Sei tra i compositi risultanti, variabili da un peso molecolare basso ad uno elevato (glutarico, pimelico, sebacico, 1,11-undecandioico, 1,12-dodecandioico e suberico) furono scelti per il saggio analitico della loro attivit? biologica. Tutti i sei compositi erano efficaci nel convertire il fumarato di ammonio in acido aspartico.

ESEMPIO VII

PEI (5 grammi) fu mescolata con un grammo di acido poliaspartico, quindi furono aggiunti 1,5 grammi di EDAC--HC1. Si ebbe polimerizzazione entro 5 minuti, con formazione di un polimero del tipo gel duro che era insolubile in acqua.

ESEMPIO Vili

Triptofano sintetasi (EC 4.2.1.20) ? un enzima che pu? derivare da una variet? di sorgenti microbiche, ad esempio dai microorganismi Proteus, Erwinia, Escherichia, Psudomonas e Aerobacter (si veda Methods in Enzymology, Chem. Tech. Rev. Academic Press (1980)). Questo enzima pu? essere utilizzato per catalizzare la conversione di indolo e semina in triptofano. Questo esempio descrive la immobilizzazione dell'enzima triptofano sintetasi estratto da cellule di E, coli. Furono mescolati PEI (4 g) ed acido succinico (2 g) e la miscela fu lasciata raffreddare alla temperatura ambiente. Fu aggiunto mezzo millilitro di estratto di enzima alla miscela, facendo seguire l'aggiunta di 1,5 g di EDAC.HC1. Il gel risultante fu macinato in particelle e lavato a fondo. Le particelle risultanti furono quindi aggiunte ad una soluzione del substrato contenente L-serina 0,05 M e indolo 0,05 M. Il composito fu trovato efficace nel convertire il substrato in L-triptofano nella miscela di reazione in due prove successive.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per immobilizzare un materiale biologico mediante preparazione di un composito di materiale biol?gico insolubilizzato, comprendente il condensare un polimero di polialchilenimmina con una quantit? condensante di un acido policarbossilico in presenza di una quantit? condensante di un agente di condensazione, in cui detto materiale biologico viene mescolato con detto polimero di polialchilenimmina durante detta reazione di condensazione.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina viene scelto nel gruppo consistente di polietilenimmina, polipropilenimmina, polibutilenimm?na e polipentilenimmina.

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina ? polietilenimmina.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'acido policarbossilico ? un acido dicabossilico.

5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che l'acido policarbossilico viene scelto nel gruppo consistente di acido adipico, azelaico, 1,11-undecandioico, 1,12-dodecandioico, traumatico, pentadecandioico, esadecandioico, sebacico, suberico, glutarico, maionico, pimelico, succinico, malico, maleico, glutammico, aspartico, ossalico, fumarico e poliaspartico.

6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che l'acido policarbossilico ? acido succinico.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione viene scelto nel gruppo consistente di N-etil-5-fenilisossazolio-3--solfonato, N-etossicarbonil-2-etossi-l,2-diidrochinolina.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione ? un agente condensate carbodiimmide.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione carbodiimmide ? l-etil-3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide, dicicloesil carbodiimmide, l-cicloesil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimmide meto-p-toluen solfonato, o un sale relativo.

10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione carbodiimmide ? l-etil-3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide o un sale relativo.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione ? 1-etil--3,3-dimetilamminopropil carbodiimmide o un sale relativo.

12. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3 o 4, caratterizzato dal fatto che il rapporto molare della polialchilenimmina rispetto all'acido policarbossilico varia da circa 1:20 a 1:0005.

13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione viene utilizzato in quantit? variabile da circa 0,2 a 3 volte quella stechiometrica, relativamente all'acido policarbossilico.

14. Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione viene utilizzato in quantit? variabile da circa 0,5 a 1,5 volte la quantit? stechiometrica relativamente all'acido policarbossilico.

15. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3, 4 o 5, caratterizzato dal fatto che la polialchilenimmina e l'acido policarbossilico vengono dapprima miscelati, viene quindi aggiunto il materiale biologico e .quindi viene aggiunto l'agente di condensazione.

16. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico immobilizzato ? un enzima.

17. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico immobilizzato comprende cellule intere.

18. Procedimento secondo la rivendicazione 17, caratterizzato dal fatto che le cellule intere sono cellule di E. coli contenenti aspartasi.

19. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico ? aspartasi.

20. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico comprende fenilalanina ammoniaca-liasi.

21. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico comprende triptofano sintetasi.

22. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprende ulteriormente 1'insolubilizzazione del composito di materiale biologico mediante post--trattamento con un agente di reticolazione dell'ammina per impartire resistenza e stabilit? addizionali al composito.

23. Procedimento secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che l'agente di reticolazone dell'ammina viene scelto nel gruppo consistente di dialdeide glutarica, diisocianati, poliisocianati, 2,4,6-tricloro-S-triazina, bisossirano, bisimmidato, divinilsolfone e 1,5-difluoro--2,4-dinitrobenzene.

24. Procedimento secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che l'agente di reticolazione dell'ammina ? dialdeide glutarica.

25. Composito di materiale biologico insolubilizzato comprendente un materiale biologicamente attivo immobilizzato entro un polimero condensato di polialchilenimmina, in cui i gruppi amminici delle catene della polialchilenimmina sono legati a ponte mediante un acido policarbossilico.

26. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo viene scelto nel gruppo consistente di enzimi, celle microbiche, antigeni, anticorpi, antibiotici, carboidrati, coenzimi, cellule vegetali, cellule animali, batteri, lieviti, funghi e colture di tessuti.

27. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo viene scelto nel gruppo consistente di enzimi e cellule intere.

28. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo ? aspartasi.

29. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico ? costituito da cellule intere di E.coli che contengono aspartasi.

30. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico comprende fenilalanina ammoniaca-liasi.

31. Composito secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico comprende triptofano sintetasi.

32. Procedimento per produrre acido aspartico, comprendente il fatto di porre a contatto, in condizioni di produzione di acido aspartico, un substrato contenente fumarato di ammonio, con un composito di materiale biologico insolubilizzato di aspartasi o cellule microbiche contenenti aspartasi, immobilizzate entro un polimero condensato di polialchilenimmina, in cui i gruppi amminici sulle catene del polimero di polialchilenimmina sono collegate a ponte mediante un acido policarbossilico.

33. Procedimento per produrre fenilalanina, che comprende il porre a contatto, in condizioni di produzione della fenilalanina, un substrato contenente acido t-cinnamico ed ammoniaca, con un composito di materiale biologico insolubilizzato di fenilalanina ammoniaca-liasi o di cellule microbiche contenenti fenilalanina ammoniaca-liasi, immobilizzate entro un polimero condensato di polialchilenimmina, in cui i gruppi amminici sulle catene polimeriche della polialchilenimmina sono collegati a ponte mediante un acido policarbossilico.

34. Procedimento per produrre triptofano, comprendente il fatto di porre a contatto, in condizioni di produzione di triptofano, un substrato contenente indolo e serina, con un composito di materiale biologico insolubilizzato di triptofano sintetasi o di cellule microbiche contenenti triptofano sintetasi, immobilizzate entro un polimero condensato di polialchilenimmina, in cui i gruppi ammin sulle catene polimeriche della polialchilenimmina sono collegati a ponte mediante un acido policarbossilico.