NL8301379A - Werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen in gecondenseerde polyalkyleeniminepolymeren. - Google Patents

Description

*

V

VO 4722

Werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen in gecondenseerde polyalkyleeniminepolymeren.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het immobiliseren van biologische materialen. Meer in het bijzonder betreft de uitvinding een immobilisatie van biologische materialen door ze in een polymeer op te sluiten.

5 Biologische materialen, zoals enzymen of enzym-producerende microorganismen of cellen, worden vaak gebruikt als katalysatoren voor synthetische reacties en voor analytische technieken. Dergelijke katalysatoren zijn gewenst, omdat ze zeer specifiek en efficiënt werken onder gewoonlijk milde reactievoorwaarden.

10 Omdat enzymen en andere biokatalysatoren gewoonlijk in water oplosbaar zijn, zijn ze geschikt voor toepassing in reactiesystemen van het chargegewijs werkende type. Hernieuwd gebruik van dit soort enzymen en andere biokatalysatoren is beperkt mogelijk, vanwege moeilijkheden bij het terugwinnen van deze materialen uit het gebruikte 15 reactiemedium in een actieve of bruikbare vorm. Bovendien hebben de materialen de neiging achter te blijven in het verkregen produkt als onzuiverheden. Om deze problemen te vermijden, zijn methoden ontwikkeld, om biologische materialen die een katalytische activiteit bezitten op onoplosbare vaste dragers te immobiliseren - Deze immobili-20 satie beoogt een gestabiliseerd biologisch materiaal, dat herhaaldelijk of zelfs continu kan worden gebruikt.

Diverse innnobilisatiesystemen voor biologische materialen zijn eerder beschreven. Enzymen zijn geïmmobiliseerd door een absorptie op onoplosbare materialen, zoals actieve kool, glas, cellulose, 25 calciumfosfaatgelen, montmorilloniet en organische ionen-uitwisselende harsen etc. Ook is geïmmobiliseerd door opsluiting in zetmeel en acryl-amidegelen, door een covalente hechting tussen enzymen en onoplosbare organische polymeren, alsmede door een covalente hechting tussen enzym-moleculen onderling.

30 De bekende procédé's resulteren vaak in produkten met een ver minderde enzymatische activiteit vergeleken met die van het overeenkomstige ongebonden biologische materiaal. Van deze biologische materialen is bekend, dat zij gevoelig zijn voor thermische en chemische 8301379 -2- denaturering of inactivering. Het verlies aan biologische activiteit resulteert vaak, wanneer de immobilisatie wordt uitgevoerd onder minder milde voorwaarden, die bijzonder problematisch kunnen zijn, wanneer polymeercondensatiereacties daarbij optreden. Voorts zijn de 5 bekende produkten vaak ongunstig wat betreft hun hydrofiele eigenschappen, sterkte, duurzaamheid en porositeit.

Er werd nu gevonden, dat biologische materialen op een eenvoudige en economische wijze kunnen worden geïmmobiliseerd, terwijl ze een hoge mate van katalytische activiteit behouden. De onderhavige 10 methode produceert een geinsolubiliseerd biologisch composietmateriaal, dat het biologisch materiaal gevangen binnen een gecondenseerd poly-alkyleeniminepolymeer bevat. Hoewel dit composietmateriaal wordt bereid door de polymeercondensatiereacties bij aanwezigheid van het biologische materiaal uit te voeren, zijn de reactievoorwaarden zo 15 mild, dat bijzonder weinig verlies aan activiteit optreedt. Dergelijke composietmaterialen hebben een voortreffelijke sterkte en duurzaamheid. Voorts kan de hydrofiliteit van deze materialen worden geregeld door de mate van condensatie te variëren. De onderhavige werkwijze produceert een composietmateriaal dat door eenvoudig te filtreren uit het 20 reactiemengsel kan worden afgescheiden, of dat kan worden gebruikt in continue reactieprocessen, zoals die, waarbij een reactiesubstraat door een gepakte kolomreactor stroomt.

Volgens de uitvinding wordt een polyalkyleeniminepolymeer gecondenseerd met een condenserende hoeveelheid van een polycarbonzuur 25 bij aanwezigheid van een condenserende hoeveelheid condensatiemiddel, waarbij het biologische materiaal met het polyalkyleeniminepolymeer tijdens de condensatiereactie is gemengd. Toevoeging van het condensatiemiddel leidt tot de vorming van een geinsolubiliseerd biologisch composietmateriaal, waarin het biologische materiaal binnen het poly-30 meer is geïmmobiliseerd. Immobilisatie van een biologisch materiaal binnen een polymeer kan plaatsvinden door fysische opsluiting alsmede door covalente binding tussen polyalkyleenimine of condensatiemiddel en reactieve groepen op het biologische materiaal. Bijvoorbeeld kan het biologische materiaal worden geïmmobiliseerd via covalente bindin-35 gen, omdat amin - en carbonzuurgroepen van het biologische materiaal respectievelijk een aminogroep op het polyalkyleenimine of een carbon- 8301379 ♦ * -3- zuurgroep op het polycarbonzuur kunnen substitueren en aldus uiteindelijk covalent worden gebonden aan het polymeer.

De onderhavige werkwijze maakt de bereiding van een reeks biologische composietmaterialen mogelijk, die qua hydrofiele eigenschap-5 pen, sterkte, duurzaamheid en porositeit kunnen variëren. Afname van de mate van condensatie kan resulteren in een composietmateriaal met een betere oplosbaarheid in water. De toevoeging van multifunctionele verknopingsmiddelen kan de sterkte en de duurzaamheid van het composietmateriaal verhogen, waarbij de verdere functionele groepen het 10 polyalkyleeniminepolymeer verder kunnen condenseren.

De totale porositeit van de matrix kan worden verhoogd door een toevoeging van een in water oplosbaar deeltjesvormig materiaal aan het polymeermengsel alvorens volledig te condenseren. Dit materiaal wordt vervolgens verwijderd, door een toevoeging van water 15 na de condensatie, dat dit materiaal oplost. Het gedeelte van het composietmateriaal, dat tevoren door dit vaste materiaal werd ingenomen, blijft open, waardoor de porositeit van de matrix toeneemt. Elk in water oplosbaar deeltjesvormig materiaal, dat het polymeer of het biologische materiaal niet ongunstig beïnvloedt, kan worden ge-20 bruikt voor de verhoging van de porositeit van het mengsel. In water oplosbare polycarbonzuren, zoals met het ongecondenseerde polyalkyleen-imine worden omgezet, zijn bijzonder geschikt voor het verhogen van de matrix-porositeit, omdat overmaathoeveelheden gebruikt voor het verhogen van de porositeit de condensatiereacties niet aanmerkelijk 25 storen.

Polyalkyleeniminen, die bij de werkwijze worden gebruikt en compositiematerialen volgens de uitvinding zijn polymeren, die kunnen worden gesynthetiseerd.door een door zuur gekatalyseerde additie-polymerisatie van alkyleeniminemonomeren. Dergelijke polymeren varië-30 ren gewoonlijk in molecuulgewicht van 30.000 tot 100.000, afhankelijk van de reactievoorwaarden, en bezitten gewoonlijk een vertakt ketenvormige structuur.

Polyethyleenimine (PEI) is een voorkeurspolyalkyleenimine, omdat dit betrekkelijk goedkoop en gemakkelijk te krijgen is, en bij-35 zonder goed functioneert bij de condensatiereacties volgens de uitvinding. Polyethyleenimine wordt bereid door een ring-openingspoly- 8301379 ♦ ♦ -4- merisatie van ethyleenimine bij aanwezigheid van katalysatoren, zoals anorganische zuren. Het polymeer is sterk vertakt en bevat primaire, secondaire en tertiaire amino groepen. PEI is in water oplosbaar en bij condensatie van de polymeerketens resulteert een in water onoplos-5 baar produkt. Een bijzonder effectieve condensatiemethode maakt gebruik van een polycarbonzuur (PCA) voor het overbruggen van amino-groepen aan naburige PEI-ketens. Condensatiemiddelen, liefst carbodi-imiden, veroorzaken een vlot verlopende condensatie. De reacties bij het bereiden van een gecondenseerd po lyethyleenimine volgens de uit-10 vinding zijn weergegeven in schema A van het formuleblad.

Reactie (1) illustreert de polymerisatie van ethyleenimine tot PEI met een vertakt ketenvormige structuur, waarbij n en n' gehele getallen zijn groter dan 1, terwijl n" 0 kan wezen (aangevende dat de [C^C^NH]-groep afwezig is) of meer dan 0. Reactie (2) geeft de vor-15 ming weer van een zout van de aminogroepen van PEI met een polycarbonzuur, waarbij R een directe binding of een gesubstitueerde of niet gesubstitueerde koolwaterstofgroep kan zijn, bijvoorbeeld een rechte of vertakte koolwaterstof met eventueel alicyclische, alkeen- of aromatische groepen, alsmede diverse functionele groepen, zoals hydro-20 xyl-, carbonyl-, carbonzuur-, amino-, nitril-, amide-, estergroepen en dergelijke, die de condensatiereactie, de biologische materialen of het resulterende composietmateriaal niet ongunstig beïnvloeden.

Dergelijke groepen kunnen sterk variëren waardoor een breed scala aan bruikbare polycarhonzuren optreedt, zoals hieronder nader wordt toe-25 gelicht. De reacties (3) en (4) geven de condensatie van het PEI en het polycarbonzuur weer onder toepassing van een carbodiïmide-condensatiemiddel. R' en R” zijn koolwaterstofgroepen, die tezamen met de andere reactanten en de voorwaarden voor de weergegeven reacties nader hieronder zijn beschreven.

30 Over het algemeen kunnen polycarbonzuren die geschikt zijn voor toepassing bij de uitvinding gesubstitueerd^ of ongesubstitueerde carbonzuren zijn met ten minste twee carbonzuurgroepen. Bij voorkeur zijn deze polycarbonzuren in water oplosbaar, zodat ze kunnen worden gebruikt voor het verhogen van de porositeit van het composietmate-35 riaal, alsmede voor het condenseren van het polyalkyleenimine.

----- — ^ 8301379

J

-5-

Voorbeelden van polycarbonzuren, die bij de werkwijze en de composietmaterialen van de uitvinding kunnen worden gebruikt omvatten adipine-zuur, azelainezuur, 1,11-undecaandizuur, 1,12-dodecaandizuur, trau-matinezuur, pentadecaandizuur, hexadecaandizuur, sebacinezuur, suberine-5 zuur, glutaarzuur, malonzuur, pimellinezuur, bamsteenzuur, appelzuur, maleinezuur, glutaminezuur, asparaginezuur, oxaalzuur, fumaarzuur, polyasparaginezuur en dergelijke. Dicarbonzuren genieten de voorkeur voor toepassing bij de onderhavige uitvinding en omvatten malelnezuur, barnsteenzuur, glutaarzuur en adipinezuur. Hogere polycarbonzuren 10 omvatten stoffen met twee of meer carbonzuurgroepen, zoals hoogmole-culaire polymere materialen, bijvoorbeeld polyasparaginezuur, met een molecuulgewicht tussen 5.000 en 70.000. De condensatiereacties verlopen gewoonlijk exotherm, vandaar dat de reactiemengsels liefst worden gekoeld tot een temperatuur die niet schadelijk is voor het te immobili-15 seren biologische materiaal, bijvoorbeeld op of 37°C.

De molverhouding van polycarbonzuur tot polyalkyleenimine (PCA:PAI) kan sterk variëren, gezien de variatie in molecuulgewicht van de reactanten. Gewoonlijk kan het polycarbonzuur in elke condenserende hoeveelheid worden gebruikt,, terwijl de verhouding van PCA tot 20 PAI gewoonlijk is gelegen tussen 1:20 en 1:0,005. Indien een polycarbonzuur wordt toegevoegd om de porositeit van het onderhavige composietmateriaal te verhogen, wordt veelal een aanmerkelijke molaire overmaat aan polycarbonzuur toegepast.

Bij het bereiden van de composietmaterialen kan elke volgorde 25 van toevoeging van de bestanddelen worden toegepast. Bijvoorbeeld kan het biologische materiaal op ieder tijdstip voor het vast worden van het polymeer worden toegevoegd, maar het wordt bij voorkeur toegevoegd na de toevoeging van het polycarbonzuur aan het polyalkyleenimine. Een voorkeursmethode voor het bereiden van de composietmate-30 rialen volgens de uitvinding is een toevoeging van een condenserende hoeveelheid van een polycarbonzuur aan een polyalkyleenimine onder voorpolymerisatievoorwaarden, waardoor een in water oplosbaar prepoly-meer wordt gevormd. Dit prepolymeer is gewoonlijk een visceuze vloeistof, waaraan het biologische materiaal zonder moeite kan worden toe-35 gevoegd, en in suspensie kan worden gehouden tijdens de condensatie-reactie. Het condensatiemiddel wordt vervolgens toegevoegd om de con- 8301379 — «h -6- densatie en het vast worden van het polymeer-biologische materiaal/ composietmateriaal te effectueren. De pH van het reactiemengsel wordt op een zodanige waarde gehouden, dat het biologische materiaal niet wordt geïnactiveerd of ongunstig wordt beïnvloed. De pH kan zijn ge-5 legen tussen 2 en 12, bij voorkeur tussen 5 en10.

De hoeveelheid aan het polymeer toe te voegen biologisch materiaal kan variëren naargelang van het specifiek gewenste gebruik van het biologische composietmateriaal. Gewoonlijk ligt deze hoeveelheid tussen 1 mg en 10 g (droge gewichtsbasis) per gram gebruikt poly-10 alkyleenixnine, liefst tussen 0,1 g en 5 g per gram PAI. De biologische materialen kunnen enzymen, microbecellen, antigenen, antilichamen, antibiotica, koolhydraten, coënzymen, plantecellen, dierlijke cellen, bacteriën, gisten, schimmels, weefselcultures of mengsels daarvan omvatten. Enzymen kunnen in de vorm van waterige oplossingen of in 15 poedervorm, liefst als de laatste aan het reactiemengsel worden toegevoegd. Cellen kunnen in de vorm van een vochtige pasta of als droge deeltjes worden toegevoegd.

Als eerder gezegd wordt voor de condensatie van de polyalkyleen-imineketens door polycarbonzuren bij voorkeur een condensatiemiddel 20 gebruikt. Gewoonlijk kan elk condensatiemiddel dat de reactie van aminen met carbonzuren katalyseert of gemakkelijker doet verlopen, worden gebruikt. Voorbeelden van dit soortcondensatiemiddelen zijn: N-ethyl-5-fenyl-isoxaznlium-3-sulfonaat, n-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihyörochinoline, en diverse carbodi-25 imiden. Carbodiïmidecondensatiemiddelen verdienen de voorkeur en dit soort middelen omvatten gewoonlijk verbindingen met de formule RT—N=C=N-R", waarbij R' en R" koolwater stof groepen met 3-20 koolstof-atomen, liefst 5-12 koolstofatomen voorstellen. Dergelijke carbodi-imide-condensatiemiddelen omvatten l-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl-30 carbodiïmide, dicyclohexylcarbodilmide, l-cyclohexyl-3-(2-morfolino- ethyl)carbodilmide-metho-p-tolueensulfonaat en de zouten daarvan. Carbodiimide-condensatiemiddelen worden aan het reactiemengsel in een condenserende hoeveelheid toegevoegd, welke gewoonlijk nagenoeg stoe-chiometrisch is; bijvoorbeeld ca. 0,2 tot 3 maal, liefst 0,5 tot 1,5 35 maal de stoechiometrische hoeveelheid. Elk carbodiïmidemolecuul reageert met een enkele zuurgroep van het polycarbonzuur. Bijvoorbeeld 8301379 W -9 -7- worden gewoonlijk carbodilmide-tot-dicarbonzuur-molver houdingen van ca. 2:1 gebruikt bij de onderhavige uitvinding; evenwel kunnen aanmerkelijk lagere molverhoudingen worden toegepast, indien een overmaat polycarbonzuur wordt gebruikt voor het verhogen van de porosi-5 teit van het composietmateriaal. Na toevoeging van het condensatie-middel bij kamertemperatuur treedt binnen 30 sec een duidelijke polymerisatiereactie op, en deze is gewoonlijk na ca. 2 uren afgelopen.

Specifieke uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen voorts 10 nog een nabehandeling van het composietmateriaal met een amine-ver-knopingsmiddel omvatten}waardoor de stabiliteit en de sterkte wordt verhoogd.Dergelijke verknopingsmaterialen omvatten glutaar-di-aldehyde, dilsocyanaten, polyisocyanaten, 2,4,6-trichloor-S-triazine, bisoxiran, bisimidaat, divinylsulfon, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzeen 15 en dergelijke. Glutaar-dialdehyde wordt voor dit doel bij voorkeur gebruikt.

Met de onderhavige werkwijze is het mogelijk een reeks biologische materialen te immobiliseren, waardoor nieuwe biokatalytische composietmaterialen worden verkregen. In de volgende voorbeelden 20 zijn deze immobilisatieprocedures nader in detail beschreven. Deze voorbeelden geven diverse uitvoeringsvormen van de uitvinding weer, maar moeten niet als beperkend worden beschouwd.

VOORBEELD I

4,0 g van een 30%'s waterige oplossing van polyethyleenimine 25 werd gemengd met 2 g bamsteenzuur. De temperatuur van het mengsel werd op 45°C verhoogd en daarna werd afgekoeld op 22°C. Op dit tijdstip was het verkregen mengsel een in water oplosbaar prepolymeer.

Een celvrije waterige aspartase-oplossing werd bereid volgens voor- 3 beeld I, alinea 1 van de Amerikaanse octrooiaanvrage 311.618.. 1 cm 30 van deze aspartase-oplossing werd vervolgens toegevoegd aan het in water oplosbare prepolymeermengsel, dat vervolgens door een toevoeging van l-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiiinide-hydrochloride in poedervorm werd gecondenseerd. De toevoeging van het condensatie-middel resulteerde in een polymerisatie binnen 30 sec, waardoor een ' 35 gefixeerd biologisch materiaal in gelvorm ontstond. Dit gel werd in een mortier met een stamper fijngewreven tot kleine deeltjes.

8301379 m ** -8-

VOORBEELD II

Het deeltjesvormige biologische composietmateriaal volgens voorbeeld I werd in 50 cm3 van een oplossing van 1 mol ammoniumfumaraat, 1 millimol magnesiumsulfaat met pH 8,5 gebracht en het meng-5 sel 30 min geroerd. De oplossing werd gefiltreerd en deze procedure tweemaal herhaald waarbij de tweede roerbehandeling 16 uur duurde.

De deeltjes werden vervolgens in 35 cm3 van dezelfde ammonium-fumaraatsubstraatoplossing van 37°C gebracht. Na 1 uur bleken de biologisch actieve deeltjes 1509 u mol ammoniumfumaraat in L-aspara- 10 ginezuur te hebben omgezet. De deeltjes werden vervolgens gewassen 3 met vers substraat, gedeeltelijk gedroogd en opnieuw in 35 cm van een ammoniumfumaraatsubstraatoplossing van 37°C gebracht. Opnieuw bleek na 1 uur 1509 u mol ammoniumfumaraat in L-asparaginezuur te ' zijn omgezet; hieruit volgt, dat de biologische activiteit van het 15 composietmateriaal volledig behouden was gebleven.

VOORBEELD XII

6 g po lyethyleenimine werd gemengd met 3 g poedervormig bam-steenzuur en weggezet, tot dit mengsel weer op kamertemperatuur was afgekoeld. Een vochtige celpasta met daarin ca. 75 gew.% water werd 20 bereid uit verse aspartase-houdende E. coli volgens de volgende procedure. Een fermentatiemedium werd bereid door oplossen in 1 liter water van 24 g gistextract, 30 g fumaarzuur, 2 g natriumcarbonaat, 2 mU magnesiumsulfaat en 0,1 mM calciumchloride, waarna de pH met 3 ammonia op ca. 7,2 werd gebracht. Dit medium werd geënt met 1 cm van 25 een cultuur van E. coli (ATCC No. 31976) die tevoren 12-16 uur bij 37°C in een peptonmedium met 0,5% mononatriumglutamaat was gelncubeerd.

Het geinoculeerde medium werd 12-14 uur bij 37°C geïncubeerd. De cellen werden gewonnen door 30 min bij 5.000 tpm te centrifugeren.

Drie gram van de vochtige celpasta werden gelijkelijk aan het pre-30 polymeer toegevoegd. 2 g l-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiïmide-hydrochloride (EDAC-HC1) werd vervolgens toegevoegd, en het geheel 1 min gemengd. Het verkregen mengsel polymeriseerde. Na 2 uur staan bij kamervoorwaarden werd het gepolymeriseerde mengsel tot deeltjes verwreven. De geldeeltjes werden vervolgens geïmpregneerd in een wa-35 terige oplossing van 1,5 M ammoniumfumaraat met pH 8,5 van 22°C.

8301373 -9-

Deze impregnering werd herhaald met vers substraat, waarna het gel werd uitgewassen met 1/3 aliquot substraat. Het gel werd onderzocht op zijn aspartase-activiteit door de verdwijning van het fumaarzuur met een spectrofotometer bij 240 nm te meten. De geldeeltjes werden 5 continu bij kamertemperatuur in een batchreactor gedurende 1 uur bij aanwezigheid van 75 cm^ substraat geroerd. Een omzetting van ca. 98% werd hierbij waargenomen, hetgeen correspondeert met het bekende evenwicht van de reactie. De reactie werd vervolgens herhaald met overeenkomstig resultaat. Tabel A geeft de afname in ammoniumfumaraatconcen-10 tratie met de tijd voor deze 2 batch-reacties weer.

TABEL A

Afname in substraatconcentratie met de tijd

Reactieduur _mg/ml ammoniumfumaraat_ _proef 1_proef 2_ 15 0 174,0 174,0 15 77,9 78,6 30 37,6 36,5 60 1,8 2,7

VOORBEELD IV

20 De helft van het gel dat gebruikt werd voor de reacties van voorbeeld III werd gebracht in een kolom met een diameter van 0,9 cm.

3

Het verkregen bedvolume bedroeg 14 cm . 1,5 M ammoniumfumaraatoplos-sing met pH 8,5 van 22°C werd vervolgens opwaarts door de kolom gepompt met een snelheid van 14 cm^/uur en wel continu gedurende 70 dagen. 25 Monsters van het effluent werden geanalyseerd op de verdwijning van ammoniumfumaraat. De resultaten zijn weergegeven in tabel B. De aanvankelijke omzettingssnelheid in de kolom bedroeg 190 g ammoniumfumaraat, per literbed per uur bij 22°C en deze snelheid liep terug tot 168 g/l/u na 70 dagen continu werken. Dit betekent een productivi-30 teitsverlies van slechts 12%.

TABEL B

dag % omzetting 1 95,4 2 95,9 22 96,8 35 38 93,1 70 84,2 8301379 -10-

VOORBEELD V

3 g PEI werd gemengd met 1,4 g bamsteenzuur waarna het mengsel werd weggezet tot het weer op kamertemperatuur was gekomen. 1 1/2 g gewonnen gistcellen van Rhodotorula rubra (ATCC-4056) met een 5 fenylalanine-ammoniak-lyaseactiviteit werden in dit mengsel gemengd.

1 g 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiImide-hydrochloride werd vervolgens toegevoegd, waarna 1 min werd gemengd. Het verkregen mengsel polymeriseerde tot een stijf gelvormig materiaal. Dit gel werd in een mortier met een stamper fijngewreven en daarna geïmpregneerd, 10 gewassen en opnieuw geïmpregneerd in een substraatoplossing met daarin t-kaneelzuur en ammoniumhydroxyde met een pH van 9,5. Het gewassen materiaal bleef rood van kleur, terwijl de gewassen oplossing visueel kleurloos en helder was, hetgeen aangeeft, dat de rode R. rubra-cellen in het composietmateriaal waren opgesloten gebleven. Na 39 uren werd 15 het verkregen reactiemengsel gefiltreerd en het filtraat geanalyseerd op L-fenylalanine. De concentratie aan fenylalanine in het filtraat bleek ca. 0,5 g/1 te bedragen.

VOORBEELD VI _____ _

Een reeks experimenten werd uitgevoerd om de effecten van het 20 polycarbonzuur op het systeem te onderzoeken. Voor elk experiment werd de methode van voorbeeld III gevolgd met de volgende verschillen: 3 g PEI, 2 g polycarbonzuur, 1,5 g EDAC.HCl en 1 g E. coli-celpasta werden gebruikt. Een afzonderlijke immobilisatiereactie werd uitgevoerd voor elk van de volgende polycarbonzuren: azelalnezuur, 25 1,11-undecaandizuur, 1,12-dodecaandizuur, traumatinezuur, pentadecaan- dizuur, hexadecaandizuur, sebacinezuur, suberinezuur, glutaarzuur, malonzuur en pimellinezuur. Elk polycarbonzuur bleek effectief voor het immobiliseren van de cellen. Zes van de verkregen composietmaterialen die van laag tot hoog molecuulgewicht (glutaarzuur, pimelline-30 zuur, sebacinezuur, 1,11-undecaandizuur, 1,12-dodecaandizuur en suberinezuur) liepen,werden geselecteerd voor een analytisch onderzoek op hun biologische activiteiten. Alle zes composietmaterialen bleken effectief bij de omzetting van ammoniumfumaraat in asparagine-zuur.

8301379 J > -11-

VOORBEELD VII

5 g PEI werd gemengd met 1 g polyasparaginezuur, daarna werd 1,5 g EDAC-HC1 toegevoegd. Binnen 5 min resulteerde een polymerisatie, waarbij een taai gel-vormig polymeer werd gevormd, dat onoplosbaar 5 was in water.

VOORBEELD VIII

Tryptofan-synthetase (EC 4.2.1.20) is een enzym, dat kan worden verkregen uit een reeks microbenbronnen, zoals Proteus-, Erwinia-, Escherichia·? Pseudomonas- en Aerobacter-organismen. (Zie Methods in 10 Enzymology, Chem. Tech. Rev. Academie Press (1980)). Dit enzym kan worden gebruikt voor een katalyse van de omzetting van indool en serine in tryptofan. Dit voorbeeld beschrijft de immobilisatie van een tryptofan-synthetase enzymextract uit E. coli-ceHen. 4 g PEI en 2 g barnsteenzuur werden gemengd en dit mengsel weggezet tot het weer 3 15 was af gekoeld tot kamertemperatuur. 0,5 cm enzymextract werd aan het mengsel toegevoegd gevolgd door 1,5 g EDAC.HC1. Het gevormde gel werd fijngewreven en vervolgens goed gewassen. De verkregen deeltjes werden vervolgens toegevoegd aan een substraatoplossing met daarin 0,05 M L-serine en 0,05 M indool. Het composietmateriaal bleek zeer effectief 20 voor een omzetting van het substraat in L-tryptofan bij twee achtereenvolgens uitgevoerde proeven.

8301379

Claims (34)

1. Werkwijze voor het immobiliseren van een biologisch materiaal door een geïmmobiliseerd biologisch composietmateriaal te bereiden, met het kenmerk, dat men een polyalkyleeniminepolymeer met een condenserende hoeveelheid van een polycarbonzuur bij aanwezigheid van 5 een condenserende hoeveelheid van een condensatiemiddel condenseert, waarbij het genoemde biologische materiaal met het polyalkyleeniminepo lymeer tijdens de polycondensatiereactie wordt gemengd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het poly-alkyleeniminepolymeer is geselecteerd uit de volgende groep: . 10 polyethyleenimine, polypropyleenimine, polybutyleenimine en poly- pentyleenimine.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het polyalky leeniminepo lymeer een polyethyleenimine is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het poly-15 carbonzuur een dicarbonzuur is.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het polycarbonzuur gekozen is uit: adipinezuur, azelainezuur, 1,11-undecaan-dizuur, 1,12-dodecaandizuur, traumatinezuur, pentadecaandizuur, hexa-decaandizuur, sebacinezuur, suberinezuur, glutaarzuur, malonzuur, 20 pimellinezuur, barnsteenzuur, appelzuur, maleinezuur, glutaminezuur, asparaginezuur, oxaalzuur, fumaarzuur en polyasparaginezuur.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het polycarbonzuur barnsteenzuur is.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het con-25 densatiemiddel is gekozen uit: N-ethyl-5-fenyl-isoxazolium-3-sulfonaat, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy- 1,2-dihydrochinoline.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het condensatiemiddel een carbodiimidecondensatiemiddel is.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het carbo diimidecondensatiemiddel : l-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodlïmlde, dicyclohexylcarbodiimide, 1-cyclohexy1-3-(2-morfolinoethyl)-carbo-diimide-metho-p-tolueensulfonaat of een zout daarvan is. —_____ 8301379 -13-

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het carbo-dilmidecondensatiemiddel het 1-ethyl— 3,3-dimethylaminopropylcarbo-dilmide of een zout daarvan is.

11. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het conden-5 satiemiddel 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropy learbodilmide of een zout daarvan is.

12. Werkwijze volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de mol-verhouding van polyalkyleenimine tot polycarbonzuur is gelegen tussen ca. 1:20 en 1:0005.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het conden- satiemiddel wordt toegepast in een hoeveelheid van ca. 0,2 tot 3 maal de stoechiometrische, berekend op het polycarbonzuur.

14. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het condens at iemiddel wordt toegepast in een hoeveelheid tussen ca. 0,5 en 15 1,5 maal de stoechiometrische, berekend op het polycarbonzuur.

15. Werkwijze volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat het polyalkyleenimine en het polycarbonzuur eerst worden gemengd, waarna het biologische materiaal wordt toegevoegd, en tenslotte het conden-satiemiddel wordt toegevoegd.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het te immobiliseren materiaal een enzym is.

17. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het te immobiliseren biologische materiaal gehele cellen omvat.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat de gehele 25 cellen: E. coli-cellen zijn met daarin aspartase.

19. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het biologische materiaal aspartase is.

20. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het biologische materiaal fenylalanine-ammoniak-lyase omvat.

21. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het biolo gische materiaal tryptofansynthetase omvat.

22. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het ge-insolubiliseerd biologische composietmateriaal door een nabehandeling verder wordt versterkt en gestabiliseerd.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat als amino- verknopingsmiddel glutaardialdehyde, een diïsocyanaat, een polyiso- 8301379 * -14- * cyanaat, 2,4,6-trichloor-S-triazine, bisoxiran, bisimidaat, divinyl-sulfon of l,5-difluor-2,4-dinitrobenzeen wordt gebruikt.

24. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat het amine-verknopingsmiddel glutaardialdehyde is.

25. Geinsolubiliseerd biologisch composietmateriaal met daarin een biologisch actief materiaal dat geïmmobiliseerd is binnen een gecondenseerd polyalkyleeniminepolymeer, waarbij de aminogroepen op de polyalkyleenimineketen zijn overbrugd door een polycarbonzuur.

26. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat 10 het biologisch actieve materiaal uit een enzym, microbecellen, anti- genen, antilichamen, antibiotica, koolhydraten, coënzymen, plante-cellen, dierlijke cellen, bacteriën, gisten, schimmels en weefsel-culturen bestaan.

27. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat 15 het biologisch actieve materiaal bestaat uit een enzym of uit gehele cellen.

28. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het biologisch actieve materiaal aspartase is.

29. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat 20 het biologische materiaal bestaat uit gehele cellen van E. coli die aspartase bevatten.

30. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het biologische materiaal fenylalanine-ammoniak-lyase bevat.

31. Composietmateriaal volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat 25 het biologische materiaal tryptofansynthetase bevat.

32. Werkwijze voor het bereiden van asparaginezuur, met het kenmerk, dat men onder asparaginezuur-producerende voorwaarden een substraat met daarin ammoniumfumaraat in contact brengt met een gelnsobiliseerd biologisch composietmateriaal van aspartase of aspartage-houdende 30 microbecellen die geïmmobiliseerd zijn binnen een gecondenseerd polyalkyleeniminepolymeer, waarbij de aminogroepen op de polyalkyleen-iminepolymeerketens zijn overbrugd door polycarbonzuur.

33. Werkwijze voor het bereiden van fenylalanine, met het kenmerk, dat men onder fenylalanine-producerende voorwaarden een substraat met 35 daarin t-kaneelzuur en ammoniak in contact brengt met een geinsolubiliseerd biologisch composietmateriaal van fenylalanine-ammoniak-lyase 8301379 tn>r ii -15- of fenylalanine-ammoniak-lyase-houdende microbecellen, geïmmobiliseerd binnen een gecondenseerd' polyalkyleeniminepolymeer, waarbij de amino-groepen op de polyalkyleeniminepolymeerketens zijn overbrugd door een ( po lycarbonzuur.

34. Werkwijze voor het bereiden van tryptofan, met het kenmerk, dat men onder tryptofan-producerend voorwaarden een substraat met daarin indool en serine in contact brengt met een geïnsolubiliseerd biologisch composietmateriaal van tryptofansynthetase of tryptofan-synthetase-houdende microbecellen, geïmmobiliseerd binnen een gecon-10 denseerd polyalkyleeniminepolymeer, waarbij aminogroepen op de polyalkyleeniminepolymeer ketens zijn overbrugd door een polycarbonzuur-zuur. L, 8301379 λ - A H?C—CH2—>[CH2CH2N] n[CH2CH2NH}n«CH2CH2NH2 \ / N tCH2CH2NHln»-CH2CH2NH2 {PEI) (PS*) NH2 o NH3 COOH C-O- R *--» * I 1 + COOH C-0“ nh3 NH2 Π 0 (PSI) (PEI) 2 (PEI) CPEI)_

0 NH2 O NH34* R' / NH-RT II c-o-c C-O- N X N-R" - - R + 2 11 —» R N C-O" NH3+ I ^N-R" 'r- c-o-c b1 II NH-R* ______ (CDI) 0 * (PEI) NH2 3 (PEI j (PEI)_ (PEI) ___ O NH2 ns ✓NH—R' - ,R" C-O-C. 0=C j ^N-R" NH r - - > R +2 0 - C NH λΝ-R" I C-O-C 0=c R> Ij x NH-R' I

0 NH nh2 O 7 Λ 4 7 *7 rt (PEI) (PEI) 8301379 u Genex Corporation