JPS5840474B2 - 酵素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵素利用法 - Google Patents

酵素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵素利用法

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JPS5840474B2
JPS5840474B2 JP51061294A JP6129476A JPS5840474B2 JP S5840474 B2 JPS5840474 B2 JP S5840474B2 JP 51061294 A JP51061294 A JP 51061294A JP 6129476 A JP6129476 A JP 6129476A JP S5840474 B2 JPS5840474 B2 JP S5840474B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、共有結合によって酵素を水溶性有機重合体で
固定して水溶性の活性酵素錯体を形成し、この錯体を被
変換物質の水溶液中でこの物質の所期の変換度を得るの
に必要な時間及び温度条件下に維持して酵素反応により
有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵
素利用法に係わる。
有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換するた
めの酵素利用は特に食品工業に於いて公知である。
酵素反応を起こさせる従来の酵素利用法は、被変換物質
（いわゆる「基質」）を含有する、多くの場合液状の反
応媒中に溶解状態の酵素を導入し、この物質の所期の変
換度を得るのに必要な温度及び時間条件下にこの反応媒
を維持する工程から成る。
この利用法の実施に際しては、反応終了時に消費されず
に余った分を回収できない。
従来、反応生成物中に酵素が混入するのを防止するため
、残留酵素をその場で破壊する方法が取られる理由もそ
こにある。
また、酵素のコストは一般に高いから、経済的な理由か
ら、実際に利用できる酵素量は少量であり、従って、多
くの場合、工業的規模の酵素利用を可能にするには不充
分な緩漫な酵素反応速度しか望めない。
工業的実施が可能な公知方法はプロテアーゼやアミラー
ゼのように比較的低コストの酵素を利用する場合に限ら
れる。
もつと新しい公知方法では活性酵素錯体な形成するよう
に、共有結合によって適当な有機重合体で固定したく固
定〉酵素が利用される。
この新しい方法では酵素反応後に酵素が余ればこれを回
収することができる。
従って、酵素反応の作用を受ける物質の変換に必要な理
論量より多い酵素を利用することができ、反応速度ひい
ては単位時間生産量を高めることになる。
酵素を活性酵素錯体の形に重合体で固定するのは酵素の
安定性を高めると共に、場合によっては反応媒の有効ｐ
Ｈ範囲を拡げ、酵素反応の制御を容易にするのが目的で
ある。
即ち、活性酵素錯体という形で（固定した〉状態の酵素
を利用すれば、酵素反応生成物を酵素を含まない状態で
直接採取することができる。
酵素の固定を非水溶性の重合体で行えば、非水溶性で且
つ固体の活性酵素錯体が形成され、水溶性重合体で行え
ば水溶性の活性酵素錯体が形成される。
第１の場合には、粉末粒子状の不溶性の活性酵素錯体を
利用し、これをクロマトグラフィー・コラムに類似のコ
ラムの固体相に導入し、これに反応媒を通すか、あるい
は反応媒を収納したタンク中に前記錯体を分散させるか
すればよい。
活性酵素錯体は反応媒中で固体状態のままであるから、
酵素反応終了時に反応媒から錯体を分離し且つ回収する
のは容易であり、コストも低くてすむ。
しかし、この方法ではコラムを使用する場合、コラムが
詰まったり、反応媒がコラムの断面の一部分だけを通過
するいわゆる「偏流現象」を生ずるおそれがあるので好
ましくない。
タンク内で酵素反応を行う場合、固体の活性酵素錯体を
利用すると、反応媒が粒子の内部へ浸透し難いかまたは
全く浸透できないため、錯体粒子と被変換物質との接触
能率が低くなる欠点がある。
反応媒中に溶けた状態の活性酵素錯体を利用すれば均質
な液状媒中で酵素反応を進めることができ、酵素錯体と
被変換物質との接触能率が改善され、従って、反応収量
が増大する。
水溶性有機重合体での酵素固定収率は不溶性有機重合体
での酵素固定収率よりも高くなる。
また、酵素固定に水溶性重合体を利用すれば、単位質量
の錯体中に含まれる酵素単位数で表わされる活性が不溶
性重合体で酵素を固定する際に得られる酵素錯体の活性
よりも高い酵素錯体を得ることができる（「酵素単位」
とは理想的な反応条件に於いて１マイクロモルの「基質
」を１分間で完全に変換するのに必要な酵素量である）
。
高分子量「基質」に対する酵素の活性は、酵素を反応媒
に不溶性の重合体で固定した場合よりも可溶性の重合体
で固定した場合の方が高いのが普通である。
反応媒中に溶解した状態で活性酵素錯体を利用する技法
では、固体状酵素錯体の場合に発生し易い微生物の増殖
を避は得る点でも不溶性の固体活性酵素錯体を利用する
技法よりも有利である。
即ち、孔径が例えば０．２ミクロン程度のマイクロフィ
ルタで可溶性酵素錯体溶液をｐ過するだげで微生物を阻
止し、と液として無菌の活性酵素錯体溶液を得ることが
できる。
しかし、従来の水溶性活性酵素錯体利用法では、反応生
成物を酵素錯体から分離し、後刻再利用の目的で酵素錯
体を回収するために反応媒の限外沢過作業を必要とする
という不便を伴なう。
この限外沢過には高価な材料を利用しなげればならず、
しかもこれが総体的な収率低下の原因となる。
これらの欠点が水溶性活性酵素錯体の工業的利用を妨げ
る。
本発明の目的は、上記のような欠屯を伴なうことなく、
不溶性活性酵素錯体利用の利点と可溶性活性酵素錯体利
用の利点とを結合することにある。
本発明の方法は、再溶解後もなお酵素活性を維持する可
逆沈殿性の活性酵素錯体を形成する有機重合体類の中か
ら使用すべき有機重合体を選択することと、被変換物質
の所期変換度を得た後、酵素錯体を沈殿させこれを反応
媒から分離することを特徴とする。
なお、本明細書中「可逆沈殿性」とあるのは、該酵素錯
体が沈殿後再び溶解可能であり、この再溶解で得られた
溶液からあらためて沈殿することができ、従って、溶解
状態に於いても沈殿状態に於いても錯体σ物理化学的性
質及び酵素としての性質に変化を伴なわずに沈殿及び再
溶解を順次果てしなく反復できることを意味する。
但し、酵素錯体の沈殿及び再溶解に際してみられる現象
は熱力学的な意味では必ずしも「可逆的」ではなく、外
部媒質による熱変化が起こることもあり得る。
水溶性有機重合体としては、例えば温度、ｐＨ１濃度な
ど水性媒体の少くとも１つ０吻理化学的パラメータに変
化が生ずることによって、または２価または３価金属イ
オンのようなイオンをこの水性媒体に添加することによ
って該水性媒中で可逆的に沈殿または凝結し、酵素錯体
の沈殿を促すことができ、さらに、前記イオンのキレー
ト試薬を併用することによって活性酵素錯体の再溶解を
促す性質を示す化学基を含有する、ポリアクリルアミド
のようなポリアクリル酸誘導体、またはデキストラン、
カルボキシメチルセルローズ、ポリエチレングリコール
を利用することができる。
有機重合体として利用できるものを具体的に挙げれば、
側鎖基として−ＣＯＯＨを含むポリアクリルアミドの誘
導体があり、これは媒質のｐＨが４．５乃至５より低く
なれば多量に且つ可逆的に沈殿し、ｐＨがこれより高く
なれば同じ媒体中に溶解できる性質を有する。
さらに具体的には安息香酸またはイソフタル酸＊＊のよ
うな酸側鎖を有する有機重合体を利用することができる
。
このような重合体は、沈殿後浴液中に残る錯体の割合が
当初量に対し１ ｐｐｍ以下が普通であって、４．５以
下のｐＨで充分な量の沈殿を生成せしめ得るという利点
がある。
実施例 Ｉ Ａ、活性酵素錯体の調製ニ アクリル酸塩化物とｐ−アミノ安息香酸とを反応式 に従って反応させてから、得られる単量体を少量のＮ
−Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド及び重合触媒
として作用する過硫酸アンモニウムの存在に於いて窒素
雰囲気下で水性媒体中で重合せしめる。
こうして水溶性の重合体、即ち、繰返し単位を有する巨
大分子直鎖から成るポリアクリルアミド誘導体が得られ
る。
孔径０．２２ミクロンのフィルタに通してこの重合体水
溶液を沢過してから、クエン酸の希釈水溶液によってｐ
Ｈを４５に下げて重合体を涙液中に沈殿させる。
次いで沈殿物を回収し、乾燥させる。
下記の手順に従って、この重合体でグルコース・イソメ
ラーゼの分子を固定する。
上述のようにして得た重合体沈殿物をジオキサン中に分
散させ（沈殿物１ｚにつき１０ｍＡ’の割合でジオキサ
ンを用いて）でから、懸濁液１０ｍ１に対して１ｍｌの
割合でｎ−トリブチルアミンを添加する。
懸濁液を０℃まで冷却し、ｏ、４ｍｌのクロル蟻酸エチ
ルを添加する。
一懸濁液を１０分分間上に維持してから、懸濁液１０ｍ
１に対してｌ Ｑ ｍｌの割合でグルコース。
イソメラーゼ水溶液（２１／Ａ）を添加する。
−こうして得た混合物を１５分間０℃に維持してから乾
燥蒸発させ、得られた固形残留物を水に溶かす。
クエン酸希釈水溶液によってｐＨを４．５まで低下させ
てこの酵素錯体を沈殿させる。
沈殿物を塩化ナトリウム水溶液（０，１Ｍ）で液中に酵
素活性が現われな（なるまで洗いさらに蒸溜水で洗って
乾燥させる。
以上の操作で錯体１１につき１５００酵素単位の酵素活
性を呈する（ ｐＨ４，５以上の）水溶性酵素錯体が得
られる。
（酵素単位とは、この酵素錯体を溶液状態で含有するグ
ルコースの０．６６Ｍ溶液から５０℃で３０分間に生成
されるフラクトースのマイクロモル数で表わした量であ
る） Ｂ、グルコースをフラクトースに変換するための酵素錯
体利用 反応媒体：１２重量％のグルコース水溶液２５０１’ｌ
’Ｌ１ 反応温度：５０℃ 酵素反応中の反応媒体のｐＨ： ７．０ （好ましくは水に溶かした）活性酵素錯体を０、１８
Ｐ使用する場合とｉｙ使用する場合の両者について試験
する。
酵素錯体０．１８Ｐを使用すると４０時間の反応時間後
にグルコースが部分的にフラクトースに変換され（フラ
クトース５１重量％、グルコース４９重量％）、酵素錯
体１？を使用すると９時間に同じ結果が得られる。
反応後、クエン酸希釈溶液によって反応媒体のｐＨを４
．５に低下させて酵素錯体を沈殿させてから、鎖部によ
りこの沈殿物を反応媒体から分離する。
この沈殿物をｐＨが４．５のクエン酸水溶液で洗い、こ
れを水に溶かし、孔径０．２２ミクロンのフィルタに溶
液を通して沢過してからｐＨを４．５に下げて酵素錯体
を沈殿させ、最後に乾燥させる。
こうして得た粉末状酵素錯体は上述のように酵素活性を
失わずに再使用できる。
実施例 ２ 実施例１と同様に処理する。
但し、反応後反応媒体のｐＨを４．５に下げて酵素錯体
を沈殿させるのではなく、ｐＨが７．０の塩化カルシウ
ムＣａＣｌ２の１Ｍ溶液２ｒｕｌを反応媒体に添加して
反応媒体のｐＨを７．０に維持して沈殿を生成せしめる
。
こうして活性酵素錯体の９８％を沈殿させることができ
る。
こうして得られる沈殿物を遠心分離によって反応媒体か
ら分離してから、エチレン・ジアミン・テトラ酢酸水溶
液中に導入する（エチレン・ジアミン・テトラ酢酸はカ
ルシウムイオンのキレート試薬）。
こうして活性酵素錯体を再溶解し、エチレン・ジアミン
・テトラ酢酸−カルシウム錯体を透析によって再溶解水
性媒体から分離する。
このようにして得られるカルシウム・イオンを含まない
酵素錯体水溶液は当初と変らぬ酵素活性を有し、実施例
１に述べたようにグルコースからフラクトースの変換に
再利用できる。
実施例 ３ 実施例１及び２と同様に処理する。
但し、反応後、ｐＨが７．０の塩化カルシウム１Ｍ溶液
２ｍｌ及びエタノール５０ｍ１を同時に反応媒体に添加
して反応媒体ｐＨを７．０に維持しながら酵素錯体を沈
殿させる。
活性酵素錯体の９９．７％を沈殿させることができる。
実施例 ４ Ａ、活性酵素錯体の調製 繰返し単位 を有する線形巨大分子で形成され、分子量が５ｏｏｏｏ
のポリアクリル酸メチル・エステルを９０℃でヒドラジ
ンと反応させ、ポリアクリルアミド・ヒドラジッド（繰
返し単位 を有する線形巨大分子からなる重合体）を形成する。
次いで塩酸及び亜硝酸ナトリウムの存在下に０℃で反応
式 に従って反応させることにより、ポリアクリルアミド・
ヒドラジッドをこれに対応するアジ化誘導体に変換する
。
なお、上記反応式中ｎは巨大分子物質１分子に含まれる
上記繰返し単位の数を表わす。
グルコアミラーゼをｐＨが９．４の水性媒体中で上記重
合体と０℃で反応させ、この酵素の分子を該重合体で固
定する。
こうして水性媒体に溶けた状態の活性酵素錯体が得られ
るが、この錯体は本発明実施に必要な可逆沈殿性を具え
ていない。
そこで可逆的に溶解・沈殿する酵素錯体を得るため、上
述のようにして得られる非沈殿性の可溶性錯体と、実施
例１に述べた方法で調製せる式 で表わされるアクリルアミド誘導体単量体との共重合体
を形成する。
即ち、上記錯体と単量体との混合物を溶解状態で含む水
溶液を調製し、窒素雰囲気下で過硫酸アンモニウムの存
在に於いてこの溶液中で単量体の重合を行わせる。
こうして得た活性酵素錯体は４．５以上のｐＨでは水溶
性であり、４．５以下のｐＨでは可逆的に沈殿可能とな
り、ｌグにつき４８００酵素単位に相当する酵素活性を
呈する（１酵素単位は３０重量％の固形分を含む酵素作
用で「液化した」澱粉水溶液から６０℃で１分間に生成
されるグルコース量をマイクロモル数で表わした値に相
当する。
この澱粉水溶液はＡ、Ｅ、ステーリー・マニファクチュ
アリング・カンパニーから市販されている）。
Ｂ、澱粉をグルコースに変換するための酵素錯体の利用
： ６０℃に維持され且つｐＨを５に調製した、３０重量％
の固形分を含む「液化」澱粉水溶液２５０ｍ１に、上述
の手法で調製せる可溶性且つ沈殿性の活性酵素錯体２ｔ
を添加し、反応媒体を６０℃に維持する。
１２時間後、澱粉はほぼ完全にグルコースに変換、して
いる。
ここで反応媒体を常温まで冷却し、ｐＨを４１．５に下
げることにより酵素錯体な沈殿させ、これを遠心分離に
よって反応媒体から分離する。
こうして回収された酵素錯体は上述ε同じ態様で反復使
用することができ、最初の利用時と変らぬ高い酵素活性
を呈する。
実施例、５ Ａ、活性酵素錯体の調製 実施例４の手法でポリアクリルアミド・ヒドラジッドの
アジ化誘導体を調製し、同じく、実施例４０手法に従っ
てグルコアミラーゼ固定の場合と同じようにグルコース
・インメラーゼ分子をこの重合誘導体で固定する。
こうして酵素錯体を得る。
一方、アクリル酸塩化物とエチレン・ジアミンとを反応
させることにより式 で表わされるアクリル単量体を調製する。
この単量体を水溶液中で前記グルコース・イソメラーゼ
の酵素錯体と混合し、この溶液中で過硫酸アンモニウム
の存在に於いて窒素雰囲気下で前記単量体の重合を行う
。
こうして得た酵素錯体ではグルコース・イソメラーゼ分
子が側鎖端がアミノ基のアクリル共重合体で前記アミノ
基を介して固定されている。
この酵素錯体は水溶性ではあるが水性媒体のｐＨを７．
６（この錯体の等電点）に調整すれば沈殿性となる両性
重合体である。
Ｂ、グルコースをフラクトースに変換するための酵素錯
体利用： 実施例１０手法と同様に処理する。
但し、反応媒体のｐＨを７．６に調整することにより、
反応後、酵素錯体な沈殿させる。
実施例 ６ ｔ、活性酵素錯体の調製： カルボキシメチルセルロース・ヒドラジッドを亜硝酸ナ
トリウム及び塩酸の存在下に０℃で反応させて、対応す
るアジ化誘導体に変換し、こうして得られるアジ化物を
常に０℃に維持しながらｐＨが８．７の水性媒体中でオ
ルト・アミノ安息香酸及びラクターゼ（マイルズ）の混
合物と反応させる。
ヒドラジッド誘導体１グに対し、ラクターゼ０．５１及
びオルト・アミノ安息香酸０．２グを使用する。
こうして得られる活性酵素錯体は４．５以上のｐＨでは
水溶性であるが４．５以下のｐＨでは可逆的に沈殿性と
なり、オルト・アミノ安息香酸の誘導側鎖とラクターゼ
分子から成る側鎖とを有するポリアンヒドログルコーゼ
巨大分子鎖で構成され、前記側鎖はいずれも式 で表わされる基によってポリアンヒドログルコーゼ鎖と
結合されている。
この酵素錯体の酵素活性は１グにつきラクターゼ５２０
単位に相当する。
Ｂ、ラクトーゼをガラクトース及びグルコースに変換す
るための酵素錯体利用： ５重量％のラクトースを含み、ｐＨが６．６、温度４０
℃の水溶液２５０ｍ１に上記の手法で得た酵素錯体１ｚ
を添加する。
２時間に亘って酵素反応を行わせた後、クエン酸の希釈
溶液で反応媒体のｐＨを４．５に下げて酵素錯体を沈殿
させ、沈殿物を何泊処理によって反応媒体から斗離する
。
回収した酵素錯体はｐＨが７．０の水性媒に再溶解させ
、孔径が例えば０．２２ミクロンのフィルタに通してｐ
過すれば当初と変らぬ酵素活性を維持したまま反復して
再使用できる。
酵素錯体分離後、反応媒体を分析した結果、ラクトース
の当初量の３０％がガラクトース及びグルコースに変換
されていることが判明した。
以上に述べた方法は極めて広い領域に亘って、特に下記
の領域に於いて工業的に応用できる。
ラクトースの加水分解によるラクトセラム形成。
甘味添加性の高いグルコース及びフラクトースのシロッ
プを得るためのグルコース・イソメラーゼによるグルコ
ースの異性化。
インベルターゼによるサッカロースからの転化糖製造。
アルファ・アミラーゼ及びアミログルコシダーゼによる
澱粉からグルコースへの解重合。
ベータ・アミラーゼ及びアミログルコシダーゼによる澱
粉からのマルトース製造。
ビール醸造用の高醗酵性シロップ製造。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ 共有結合によって酵素を水溶性有機重合体で固定し
    て水溶性の活性酵素錯体を形成し、この錯体を溶解状態
    において被変換物質の水溶液中でこの物質の所期の変換
    度を得るのに必要な時間及び温度の条件下に維持して酵
    素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質
    に変換する酵素利用法において、該有機重合体として、
    再溶解後もなお酵素活性を維持する可逆沈殿性の活性酵
    素錯体な形成する有機重合体を選択し、且つ、被変換物
    質の所期の変換度を得た後、酵素錯体を沈殿させ、これ
    を反応媒から分離することを特徴とする酵素利用法。
JP51061294A 1975-05-30 1976-05-28 酵素反応により有機物質を少くとも１種類の他の有機物質に変換する酵素利用法 Expired JPS5840474B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH696575A CH596313A5 (ja) 1975-05-30 1975-05-30

Publications (2)

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