JP4124361B2 - 化学物質の分離方法 - Google Patents

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Description

本発明は、化学物質の分離方法に関する。さらに詳しくは、特定の温度感受性担体と、アンカー部位を有する物質との相互作用を用い、化学物質を効率的に分離する方法に関する。
化学プロセス、生化学プロセスにおける物質の化学反応や相互作用は、多くの場合溶液中で実施される。このようなプロセスにおいて、必要な物質と不要な物質を各々分離する操作は、目的物質をできる限り高い純度で効率よく得るために必須である。従来、物質の分離を行うために、固体である担体粒子を用いた各種クロマトグラフィーや、固相合成法が広く用いられている。例えば、アフィニティークロマトグラフィーは、固相担体表面に予め化学結合させたプローブ分子に対し、親和性の高いリガンド分子が特異的に結合することにより、その他の分子と区別し、分離を行うものである。この方法では、固相に結合した物質と液相に溶解した物質の分離は容易である一方で、固相から物質を切断して目的物を得るためには、一定の処理を行わなければならない。すなわち、表面に物質を捕捉した後、再放出させるためには特定の化学処理、生化学処理、光照射、電気刺激付与などの物理処理などが必要となる（非特許文献１参照）。
「コーン・スタンプ 生化学」第３版、ｐ１３３、東京化学同人
本発明の課題は、固相を利用した物質の分離方法において、固相に固定された物質を、化学処理、生化学処理、光照射、電気刺激付与等を与えることなく、容易に分離することができる方法を提供することにある。
本発明は、アンカー部分を有する物質のアンカー部分と、温度感受性担体との相互作用を利用することにより、特定物質の捕捉または放出を制御することを可能にするものである。
即ち、本発明の第１の態様は、第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の反応部位に第２の物質を反応させて反応物を得る工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第２の態様は、第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と第２の物質とを反応させて反応物を得る工程、
（ｂ）反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第３の態様は、第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の相互作用部位に第２の物質を相互作用させて複合体を得る工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用しうる相互作用部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第４の態様は、第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と第２の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、（ｂ）複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用する相互作用部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを相互作用させることにより、複合体にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明により化学物質、生化学物質の連続合成・精製・分離作業が著しく効率化するばかりではなく、生体物質間の相互作用を利用した物質分離生成法や特定物質の検出・分析法などきわめて広範な技術分野において革新的な進展が可能となる。
本発明に用いる温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態で第１の物質のアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない性質を有するものである。温度感受性担体としては、このような性質を有するものであれば特に制限はないが、例えば、炭化水素を挙げることができる。この中でも、炭素原子数１０〜３０の炭化水素が好ましく、ノルマルテトラデカン、ノルマルヘキサデカン、ノルマルオクタデカン、エイコサン、シクロヘキサンがより好ましい。そして、これらの炭化水素の炭素鎖を変化させることにより、固相状態から液相状態に変化する温度を、所望により変化させることができる。また、２種以上の炭化水素を混合することにより、固相状態から液相状態に変化する温度を変化させることもできる。
なお、これらの炭化水素では、温度を上昇させることにより固相状態から液相状態に変化するが、逆に、温度を上昇させることにより液相状態から固相状態に変化する物質を用いてもよい。
なお、本発明において、液相状態とは、液相であることのほか、温度感受性担体が軟化した状態若しくは半固体の状態も含まれる。また、本発明において、固相状態とは、固相であることのほか、温度感受性担体が硬化した状態も含まれる。そして、温度感受性担体が硬化した状態では、アンカー部を固定し、軟化した状態若しくは半固体の状態では、アンカー部を固定しない性質を示すこととなる。
本発明に用いる温度感受性担体の形態としては、図１に示すように、温度感受性担体全体が固相状態から液相状態に可逆的に変化する形態のほか、図２に示すように、他の固体担体の表面に温度感受性担体を吸着若しくは結合させた形態でもよい。この際に用いる固体担体としては、温度感受性担体を吸着若しくは結合できるものであれば特に制限はないが、例えば、オクタデシル基を表面に結合させたシリカゲル（ＯＤＳ）やガラスビーズ、白金粉末、等を挙げることができる。また、シクロヘキサン等にあらかじめ溶解させた、シクロヘキサンより融点の高いアルカン類を、シクロヘキサンと混合物の形で冷却、析出させることにより、これらを担体とみなすこともできる。
また、本発明に用いる温度感受性担体の他の形態としては、図３に示すように、界面活性剤に囲まれたミセルまたはエマルジョンの形態でもよい。この際に用いる界面活性剤としては、ミセルまたはエマルジョンを形成するものであれば特に制限はないが、例えば、ホスファチジルコリンやリゾホスファチジルコリン等のリン脂質等を挙げることができる。これらの、界面活性剤は、適宜２種以上を混合して用いることもできる。
本発明に用いる、第１の物質としては、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位若しくは第２の物質と相互作用する相互作用部位とを有するものである。アンカー部位としては、温度感受性担体に固定されうるものであれば特に制限はないが、例えば、長鎖アルキル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリエーテル鎖、ポリスチレンやポリエチレンなどのポリマー類等を挙げることができる。
また、第１の物質の反応部位としては、第２の物質と反応するものであれば特に制限はないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルフォン酸基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化アルキル基、不飽和炭化水素基、ニトロ基、酸無水物、酸ハロゲン化物イソシアネート基、イソチオシアネート基等を挙げることができる。
さらに、第１の物質の相互作用部位としては、第２の物質と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、アビジン、ビオチン、抗原、抗体、生理活性物質、ペプチド、オリゴ糖、糖ペプチド、核酸、ペプチドやタンパク質のエピトープ等を挙げることができる。
本発明に用いる、第１の物質は上記アンカー部位と、反応部位若しくは相互作用部位とを結合させることにより製造することができる。また、必要に応じ、アンカー部位と反応部位若しくは相互作用部位との間に、リンカー部位を設けてもよい。リンカー部位は、アンカー部位と反応部位若しくは相互作用部位との間に、適切な距離を持たせ、第２の物質と反応若しくは相互作用しやすくする働きを有する。リンカー部位としては、特に制限はないが、例えば、長鎖アルキル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリエーテル鎖、ポリチオエーテル鎖等を挙げることができる。
なお、これら第１の物質を製造する方法としては特に制限はなく、通常の化学合成等により得ることができる。
本発明に用いる第２の物質としては、第１の物質の反応部位と反応するものであれば特に制限はないが、例えば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、スルフォン酸基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化アルキル基、不飽和炭化水素基、ニトロ基、酸無水物、酸ハロゲン化物イソシアネート基、イソチオシアネート基等を有するものをあげることができる。または、第２の物質としては、第１の物質の相互作用部位と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、生理活性物質、ペプチド、オリゴ糖、糖ペプチド、核酸、ペプチドやタンパク質のエピトープ等を挙げることができる。
例えば、ペプチド合成を行う場合には、第１の物質の反応部位としてはアミノ基を、第２の物質としては、アミノ基をｔ−ＢＯＣで保護し、カルボキシル基をジイソプロピルカルビジイミド（ＤＩＰＣＤ）等で活性化したアミノ酸を挙げることができる。
次に、本発明の第１の態様について説明する。
本発明の第１の態様は、第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の反応部位に第２の物質を反応させて反応物を得る工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
上記（ａ）工程では、第１の物質と温度感受性担体が均一に溶解または分散することとなる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第１の物質と温度感受性担体を溶解または分散させてもよい。次に、（ｂ）工程において、温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させ、このときに第１の物質のアンカー部位が温度感受性担体に固定されることとなる。そして、（ｃ）工程において、第１の物質の反応部位と第２の物質とが反応し、アンカー部位を固定された反応物が得られることとなる。この際に、反応促進剤や、反応活性化剤等を用いてもよい。さらに、（ｄ）工程において、未反応の第２の物質、反応促進剤、反応活性化剤等の不純物を除去することとなる。除去の方法としては、反応系を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、反応物のアンカー部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と反応物とを分離することが可能となる。また、温度感受性固体のサイズが小さい場合には、溶媒または溶媒に溶解した不純物との分離のために、温度感受性固体と溶媒との比重の差を利用した遠心分離による分離、あるいは温度感受性固体表面に特定の物質に対し親和性の高い物質を予め結合または捕捉させ、この親和性部分と相互作用する別の固体表面、あるいは高分子との相互作用を用いて、特定の固体表面に対し、サイズの小さな温度感受性固体粒子を固定してもよい。この場合は、溶液と温度感受性固体粒子との比重差がない場合でも、容易に分離が可能となる。そして、（ｅ）工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより反応物が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなしに反応物を放出することができることとなる。この放出された反応物を回収することにより、目的物を得ることができる。
なお、例えば、ペプチド合成の場合は、（ｄ）工程の後、さらに伸張するアミノ酸を第２の物質として用いて（ｃ）工程および（ｄ）工程を繰り返し行うことにより、所望のアミノ酸長のペプチドを合成することができる。
次に、本発明の第２の態様について説明する。
本発明の第２の態様は、第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と第２の物質とを反応させて反応物を得る工程、
（ｂ）反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
上記（ａ）工程では、第１の物質と第２の物質を反応させて反応物を得ることとなる。この際に、反応促進剤や、反応活性化剤等を用いてもよい。この反応は、溶媒中の均一系で行うことが可能であり、従来の固相合成法に比べ、効率的な反応が可能となる。次に（ｂ）工程において、反応物と温度感受性担体が均一に溶解または分散することとなる。そして、（ｃ）工程において、温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させ、このときに反応物のアンカー部位が温度感受性担体に固定されることとなる。さらに、（ｄ）工程において、未反応の第２の物質、反応促進剤、反応活性化剤等の不純物を除去することとなる。除去の方法としては、反応系を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、反応物のアンカー部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と反応物とを分離することが可能となる。そして、（ｅ）工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより反応物が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなしに反応物を放出することができることとなる。この放出された反応物を回収することにより、目的物を得ることができる。
なお、例えば、ペプチド合成の場合は、（ｅ）工程の後、さらに伸張するアミノ酸を第２の物質として用いて（ａ）工程〜（ｅ）工程を繰り返し行うことにより、所望のアミノ酸長のペプチドを合成することができる。図７に、ペプチド合成の概念図を示す。図７（ｉ）において、例えば０℃においてＤＭＦ中に分散された固相（ＯＤＳ）表面にシクロヘキサンが保持され固化する。このとき、アンカー分子に結合したＣ末端アミノ酸は、固相担体表面に固化したシクロヘキサンとともに保持される。そして、図７（ｉｉ）において、例えば５０℃に加温することにより、固相表面のシクロヘキサンはＤＭＦに完全に溶解する。それに伴い、アンカー分子に結合したＣ末端アミノ酸もＤＭＦ相に溶解する。このとき、アミノ酸伸張試薬と均一溶液中で反応が起こる。そして、図７（ｉｉｉ）において、撹拌しながら再び０℃まで冷却すると、ＤＭＦ中に溶解していたアンカー分子およびシクロヘキサンは、ＯＤＳ表面において、シクロヘキサンの固化によって強く保持される。この状態で、過剰のアミノ酸伸張試薬をＤＭＦをもちいて洗浄、除去することができることとなる。
次に、本発明の第３の態様について説明する。
本発明の第３の態様は、第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の相互作用部位に第２の物質を相互作用させて複合体を得る工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用しうる相互作用部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
上記（ａ）工程では、第１の物質と温度感受性担体が均一に溶解または分散することとなる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第１の物質と温度感受性担体を溶解または分散させてもよい。次に、（ｂ）工程において、温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させ、このときに第１の物質のアンカー部位が温度感受性担体に固定されることとなる。そして、（ｃ）工程において、第１の物質の相互作用部位と第２の物質とが相互作用し、アンカー部位を固定された複合体が得られることとなる。この際に、第１の物質と相互作用しない他の物質は、複合体を形成することはなく、溶媒に溶解または分散したままとなる。さらに、（ｄ）工程において、第１の物質と相互作用しない他の物質等の不純物を除去することとなる。除去の方法としては、反応系を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、複合体は、アンカー部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と複合体とを分離することが可能となる。そして、（ｅ）工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより複合体が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなしに複合体を放出することができることとなる。この放出された複合体を回収することにより、目的物を得ることができる（図４参照）。
次に、本発明の第４の態様について説明する。
本発明の第４の態様は、第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と第２の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、（ｂ）複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用する相互作用部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを相互作用させることにより、複合体にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
上記（ａ）工程では、第１の物質と第２の物質を相互作用させて複合体を得ることとなる。この際に、第１の物質と相互作用しない他の物質は、複合体を形成することはない。次に（ｂ）工程において、複合体と温度感受性担体が均一に溶解または分散することとなる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第１の物質と温度感受性担体を溶解または分散させてもよい。そして、（ｃ）工程において、温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させ、このときに複合体のアンカー部位が温度感受性担体に固定されることとなる。さらに、（ｄ）工程において、第１の物質と相互作用していない他の物質等の不純物を除去できることとなる。除去の方法としては、反応系を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、複合体は、アンカー部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と複合体とを分離することが可能となる。そして、（ｅ）工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより複合体が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなしに複合体を放出することができることとなる。この放出された複合体を回収することにより、目的物を得ることができる。
＜アンカー付リガンド分子の合成＞
ビオチン（０．１１ｇ）、Ｎ，Ｎ‘―ジスクシイミジルカーボネート（０．１２ｇ）およびトリエチルアミン（０．２４ｇ）をＤＭＦ１５ミリリットルに溶解し、室温にて６時間攪拌した。次に、この溶液に８−アミノ−３，６−ジオキサオクタンアミンコレステリルカーバメート（０．２６ｇ）を添加し、反応溶液を１６時間攪拌した。溶媒を、ロータリーエバポレータにより減圧、留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、リガンド付きアンカー分子である、｛３−［２−（２−｛２−［５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタノイルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミックアシッド１３−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０−メチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルを収率６０％で得た。
＜温度感受性ミセル担体の調製＞
水２ミリリットルに、ホスファチジルコリン７．５ミリグラム、リゾホスファチジルコリン５．０ミリグラム、アンカー付きプローブ分子である、｛３−［２−（２−｛２−［５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタノイルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミックアシッド１３−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０−メチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル３５．０ミリグラム、ノルマルヘキサデカン３０ミリグラムを溶解させ３０℃の湯浴中にて二重円筒ミキサー（ＩＫＡ（登録商標）−ＷＥＲＫＥ）で２００００ｒｐｍにて、３分間撹拌した。その後氷浴で１０分冷却した（図５参照）。
＜電気泳動によるＡｖｉｄｉｎの検出＞
得られたミセル溶液２０マイクロリットルに、６ミリグラム／ミリリットルのアビジン（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ａｖｉｄｉｎ；ＰＩＥＲＣＥ）水溶液を２０マイクロリットルを加え１分間ホモミキサー（ＩＫＡ（登録商標）−ＷＥＲＫＥ）で撹拌した。その後サンプルを常時冷やしながら緩衝液（トリス塩酸緩衝液＋ＥＤＴＡ）を加えて洗浄し、マイクロコンＹＭ−１００（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）遠心式フィルター、Ｍ．Ｗ．１０万；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を利用して濃縮を５回繰り返した。反応液を４０℃の湯浴中で攪拌しながら、１時間加熱した。その後、遠心分離（チビタン−II卓上遠心機；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）によってミセルを取り除いて下相の水溶液をサンプリングし、以下の条件で電気泳動を行った。
電気泳動槽：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＳＹＳＴＥＭ ＥＲＩＣＡ
電気泳動用ゲル：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＧＥＬ
染色液：Ｂｉｏ−ＳａｆｅTMＣｏｏｍａｓｓｉｅ；Ｃｏｍｍａｓｉｅ（登録商標）Ｇ２５０Ｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤTM）
バッファー：０．０６２５ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％２−メルカプトエタノール、０．００５％ＢＰＢ、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ
サンプル４マイクロリットルをサンプルバッファー４マイクロリットルで希釈した後、９０℃で１５分間加熱して変性させた。電気泳動用ゲルをミリＱ水で洗浄し、６マイクロリットルずつサンプルをレーンに流し、１７分間電流（２００Ｖ）を流した。終了後ゲルをミリＱ水で３回洗浄し、染色液に一時間浸した。さらに、脱色のためミリＱ水に一晩浸漬した。本操作によりリガンドアンカー分子と相互作用することによって、ミセル表面に捕捉されたアビジン分子を分離、検出した。
＜温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムの構築（１）＞
シクロヘキサン１ミリリットル、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）９ミリリットルを２５℃で混合した溶液に、ＯＤＳ（オクタデシル基を表面に結合したシリカゲル）２．０グラムを分散させた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分離により上層の主成分となっていたシクロヘキサンはＯＤＳ表面に保持された。次にこの溶液を０℃に冷却すると、ＯＤＳ表面のシクロヘキサンは凝固し、表面保持状態で固化した。次に、この分散液を５０℃に加温すると、シクロヘキサンは融解するとともに、ＤＭＦと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが可能であった。
＜シクロヘキサン・ＤＭＦ・ＯＤＳ系を用いたペプチド結合形成＞
ＤＭＦを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムを５０℃に加温した後、２−アミノ−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシロキシ−ベンジルエステル ０．１ミリモルを溶解した。ここにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｔ ０．３ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ） ０．５ミリモルを含むＤＭＦ溶液２０ミリリットルを添加し９０分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液を除去し、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を５℃以下に冷却したＤＭＦ２０ミリリットルで３回洗浄した。次に、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を４０℃に加温、真空ポンプを用いてシクロヘキサンを減圧留去した。最後にＯＤＳをアセトニトリルを用いて洗浄した。アセトニトリル溶液から、２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−アセチルアミノ］−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシルオキシベンジルエステルを収率９７％で得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）d:７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３１（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．７，７．３Ｈｚ），６．５２（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．４４−５．３７（１Ｈ，ｂｒ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．６２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，４．８Ｈｚ），４．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．２４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．９６−３．９２（８Ｈ，ｍ），２．２１−２．１６（１Ｈ，ｍ），１．８１−１．７６（４Ｈ，ｍ），１．７５−１．７０（２Ｈ，ｍ），１．４８−１．４３（６Ｈ，ｍ），１．３７−１．２１（８４Ｈ，ｂｒ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８８（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）d:１７１．５，１６８．７，１５６．５，１５３．１，１４３．６，１４１．２，１３８．３，１３０．０，１２７．７，１２７．０，１２５．０，１２０．０，１０７．０，７３．４，６９．２，６７．５，６７．４，５７．１，４７．１，３２．０，３１．４，３０．４，２９．８，２９．７，２９．５，２９．４，２６．１，２２．８，１９．０，１７．７，１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ83Ｈ138Ｎ2Ｏ8 ［Ｍ＋Ｎａ］+ １３１４， ｆｏｕｎｄ １３１４．
＜温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムの構築（２）＞
シクロヘキサン１ミリリットル、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン） ７ミリリットルを２０℃で混合した溶液に、ＯＤＳ（オクタデシル基を表面に結合したシリカゲル） ２．０グラムを分散させた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分離により上層の主成分となっていたシクロヘキサンはＯＤＳ表面に保持された。次にこの溶液を−１０℃に冷却すると、ＯＤＳ表面のシクロヘキサンは凝固し、表面保持状態で固化した。次に、この分散液を２０℃に加温すると、シクロヘキサンは融解するとともに、ＮＭＰと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが可能であった。
＜シクロヘキサン・ＮＭＰ・ＯＤＳ系を用いたペプチド結合形成＞
ＮＭＰを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムを２０℃に加温した後、２−アミノ−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル ０．１ミリモルを溶解した。ここにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｔ ０．３ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ） ０．５ミリモルを含むＮＭＰ溶液１０ミリリットルを添加し９０分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−１０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＮＭＰ溶液を除去し、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を５℃以下に冷却したＮＭＰ２０ミリリットルで３回洗浄した。次に、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を２０℃に加温、真空ポンプを用いてシクロヘキサンを減圧留去した。最後にＯＤＳをアセトニトリルを用いて洗浄した。アセトニトリル溶液から、２−［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−アセチルアミノ］−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシルオキシ−ベンジルエステルを収率９９％で得た（図６参照）。
＜シクロヘキサン・ＤＭＦ・ＯＤＳ系を用いたペプチド結合逐次連続形成反応＞
ＤＭＦを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムを５０℃に加温した後、２−アミノ−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシロキシ−ベンジルエステル ０．１ミリモルを溶解した。ここにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｔ ０．３ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）０．５ミリモルを含むＤＭＦ溶液２０ミリリットルを添加し９０分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液を除去し、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）をＤＭＦ２０ミリリットルで３回洗浄した。次に、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を２０℃に加温した後、１０％ＤＢＵ／ＤＭＦ溶液を１０ミリリットル添加した。同温度にて２分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を０℃に冷却する。冷却固化が完了した後、再びろ過、ＤＭＦによる洗浄をおこなった。ＤＢＵ処理操作によりＮ末端アミノ基に結合したＦｍｏｃ基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）d: ７．７４（１Ｈｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．５３（２Ｈ，ｓ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），４．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，５．１Ｈｚ），３．９５（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３９（２Ｈ，ｓ），２．２４−２．１８（１Ｈ，ｍ），１．８１−１．７６（４Ｈ，ｍ），１．７５−１．７１（２Ｈ，ｍ），１．４９−１．４４（６Ｈ，ｍ），１．３７−１．２０（８４Ｈ，ｂｒ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９０−０．８６（１２Ｈ，ｍ）；13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）d:１７２．６，１７１．８，１５３．１，１３０．３，１２５．５，１０６．９，７３．４，６９．２，６７．２，５６．６，４４．８，３２．０，３１．３，３０．４，３０．３，２９．８，２９．７，２９．５，２９．４，２６．２，２２．８，１９．１，１７．８，１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ） ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ68Ｈ128Ｎ2Ｏ6 ［Ｍ＋Ｎａ］+ １０９１， ｆｏｕｎｄ １０９１．
＜シクロヘキサン・ＮＭＰ・ＯＤＳ系を用いたペプチド結合逐次連続形成反応＞
ＮＭＰを用いて作成した該温度感受性均一溶液反応（相互作用）・固相表面捕捉システムを２０℃に加温した後、２−アミノ−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル ０．１ミリモルを溶解した。ここにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｔ ０．３ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）０．５ミリモルを含むＮＭＰ溶液１０ミリリットルを添加し９０分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−１０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液を除去し、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を５℃以下に冷却したＮＭＰ２０ミリリットルで３回洗浄した。次に、固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を２０℃に加温した後、１０％ＤＢＵ／ＮＭＰ溶液を１０ミリリットル添加した。同温度にて２分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を−１０℃に冷却する。冷却固化が完了した後、再びろ過、ＮＭＰによる洗浄をおこなった。ＤＢＵ処理操作によりＮ末端アミノ基に結合したＦｍｏｃ基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
＜シクロヘキサン・ＤＭＦ・エイコサン（アルカン）を用いたペプチド結合逐次連続形成反応＞
２−アミノ−３−メチル−ブチリックアシッド３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル ０．１ミリモル、エイコサン１００ミリグラムをＤＭＦ９ミリリットル、シクロヘキサン１ミリリットル溶解した。ここにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＢｔ ０．３ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）０．５ミリモルを含むＤＭＦ溶液５ミリリットルを添加し９０分間２５℃にて攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−１０℃まで冷却した。このとき、白色固形粒子が析出した。吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液を除去し、固形物（シクロヘキサン・エイコサン）を０℃以下に冷却したＤＭＦ２０ミリリットルで３回洗浄した。次に、固形物（シクロヘキサン・エイコサン）を２０℃に加温した後、１０％ＤＢＵ／ＤＭＦ溶液を１０ミリリットル添加した。同温度にて２分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を−１０℃に冷却した。冷却固化が完了した後、再びろ過、０℃以下に冷却したＤＭＦによる洗浄をおこなった。ＤＢＵ処理操作によりＮ末端アミノ基に結合したＦｍｏｃ基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
＜アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法（ＯＤＳ粒子を利用する場合）（１）＞
５０℃においてアニリン０．０５ミリモルが溶解したＤＭＦ溶液１０ミリリットルに、３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンズアルデヒド ０．１ミリモルおよびシクロヘキサン３ミリリットルを溶解した。１６時間攪拌し、ＯＤＳ２．０グラムを添加後、攪拌しながら−１０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液と固形物（シクロヘキサン・ＯＤＳ）を分離した。固形部分は冷却時に０℃以下に冷却したＤＭＦ１０ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に９８％の反応収率で捕捉された。
＜アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法（ＯＤＳ粒子を利用しない場合）（２）＞
５０℃においてアニリン０．０５ミリモルが溶解したＮＭＰ溶液１０ミリリットルに、３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンズアルデヒド ０．１ミリモルおよびシクロヘキサン３ミリリットルを溶解した。１６時間攪拌し、攪拌しながら−１０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＮＭＰ溶液と固形物（シクロヘキサン）を分離した。固形部分は冷却時にＮＭＰ１０ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に９６％の反応収率で捕捉された。
＜アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法（ＯＤＳ粒子を利用しない場合）（３）＞
５０℃においてアニリン０．０５ミリモルが溶解したＤＭＦ溶液１０ミリリットルに、３，４，５−トリス−オクタデシロキシベンズアルデヒド ０．１ミリモル、シクロヘキサン３ミリリットル、エイコサン５００ミリグラムを溶解した。１６時間攪拌し、攪拌しながら０℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりＤＭＦ溶液と固形物（シクロヘキサンおよびエイコサンの混合物）を分離した。固形部分は冷却時にＤＭＦ１０ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に９８％の反応収率で捕捉された。
（参考例）
＜温度感受性固相担体の調製＞
水２ミリリットルに、アンカー付プローブ分子である、｛３−［２−（２−｛２−［５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタノイルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミックアシッド１３−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０−メチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル３５．０ミリグラム、ノルマルヘキサデカン３００ミリグラムを溶解させ、３０℃の湯浴中にて二重円筒ミキサー（ＩＫＡ（登録商標）−ＷＥＲＫＥ）で２００００ｒｐｍにて、３分間撹拌した。そのまま攪拌をしながら、容器を０℃まで急冷した。これにより、アンカー付プローブ分子のプローブ部分を水相に配向した形で、温度感受性担体を水中に分散、固定化した。
図１は、温度感受性担体の温度による固相状態、液相状態の変化を示す図である。 図２は、固相担体表面に吸着させた温度感受性担体を示す図である。 図３は、ミセルまたはエマルジョンの状態の温度感受性担体を示す図である。 図４は、相互作用によりえられた複合体の分離方法を示す図である。 図５は、温度感受性ミセル担体を示す図である。 図６は、ペプチド合成を示す図である。 図７は、ペプチド合成を示す図である。

Claims (4)

  1. 第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
    （ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
    （ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
    （ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の反応部位に第２の物質を反応させて反応物を得る工程、
    （ｄ）反応系から不純物を除去する工程、
    （ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
    を含み、
    ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、
    温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
    方法。
  2. 第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
    （ａ）第１の物質と第２の物質とを反応させて反応物を得る工程、
    （ｂ）反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
    （ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
    （ｄ）反応系から不純物を除去する工程、
    （ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
    を含み、
    ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と反応する反応部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、
    温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
    方法。
  3. 第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、
    （ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
    （ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
    （ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の相互作用部位に第２の物質を相互作用させて複合体を得る工程、
    （ｄ）反応系から不純物を除去する工程、
    （ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
    を含み、
    ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用しうる相互作用部位とを有し、
    温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
    方法。
  4. 第１の物質と第２の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、
    （ａ）第１の物質と第２の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、
    （ｂ）複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
    （ｃ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
    （ｄ）反応系から不純物を除去する工程、
    （ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
    を含み、
    ここで、第１の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第２の物質と相互作用する相互作用部位とを有し、第１の物質と第２の物質とを相互作用させることにより、複合体にアンカー部位が導入され、
    温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
    方法。






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