WO2005078430A1 - 化学物質の分離方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for separating a chemical substance. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently separating chemical substances by using an interaction between a specific temperature-sensitive carrier and a substance having an anchor site.
  • An object of the present invention is to provide a method for separating a substance using a solid phase, in which a substance immobilized on the solid phase can be easily treated without giving chemical treatment, biochemical treatment, light irradiation, application of electrical stimulation, or the like. It is to provide a method that can be separated.
  • the present invention makes it possible to control the capture or release of a specific substance by utilizing the interaction between an anchor part of a substance having an anchor part and a temperature-sensitive carrier. Things.
  • a first aspect of the present invention is a method for separating a reactant generated by a reaction between a first substance and a second substance, wherein (a) the first substance and the liquid phase (B) changing the temperature of the reaction system to a solid phase by changing the temperature of the reaction system, and fixing the anchor site of the first substance to the temperature-sensitive carrier. (C) reacting a second substance with a reaction site of the first substance immobilized on the temperature-sensitive carrier to obtain a reactant, (d) removing impurities from the reaction system, (e) reacting the reaction system.
  • the temperature-sensitive carrier is a method in which the temperature is changed to reversibly change to a solid state force and a liquid state, and the anchor site is fixed in the solid state and the anchor site is not fixed in the liquid state.
  • a second aspect of the present invention is a method for separating a reactant generated by a reaction between a first substance and a second substance, the method comprising: (a) separating the first substance and the second substance from each other; Reacting to obtain a reactant, (b) mixing the reactant with a temperature-sensitive carrier in a liquid phase, and (c) changing the temperature of the reaction system to a solid phase by changing the temperature of the reaction system. Changing the anchor of the reaction product to a part of the temperature-sensitive carrier, (d) removing impurities from the reaction system, and (e) changing the temperature of the reaction system to the liquid-phase state of the temperature-sensitive carrier.
  • a third aspect of the present invention is a method for separating a complex formed by an interaction between a first substance and a second substance, the method comprising: (a) mixing the first substance with a liquid phase Mixing the temperature-sensitive carrier with the temperature-sensitive carrier; (b) changing the temperature of the reaction system to bring the temperature-sensitive carrier into the solid state. (C) causing the second substance to interact with the interaction site of the first substance immobilized on the temperature-sensitive carrier, (D) removing impurities from the reaction system, (e) changing the temperature of the reaction system to change the temperature-sensitive carrier into a liquid phase state, and setting the anchor site of the complex to a temperature.
  • the carrier is a method in which the carrier is reversibly changed into a solid state force and a liquid phase state by changing the temperature, and the anchor site is fixed in the solid phase state and the anchor site is not fixed in the liquid phase state.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for separating a complex formed by an interaction between a first substance and a second substance, the method comprising: (a) separating the first substance from the second substance; (B) mixing the complex with a temperature-sensitive carrier in a liquid phase, and (c) changing the temperature of the reaction system to solidify the temperature-sensitive carrier. (D) removing impurities from the reaction system, and (e) changing the temperature of the reaction system to convert the temperature-sensitive carrier into a liquid. Changing the phase state to release the anchor site of the complex with the temperature-sensitive carrier, wherein the first substance is an anchor site that can be immobilized on the temperature-sensitive carrier, and the second substance is a second substance.
  • an anchor site is introduced into the complex, and the temperature-sensitive carrier reversibly changes to a solid state force and a liquid phase state by changing the temperature, and the anchor site is fixed in the solid state. Then, the anchor site is not fixed in a liquid phase state.
  • FIG. 1 is a diagram showing changes in a solid state and a liquid state depending on the temperature of a temperature-sensitive carrier.
  • FIG. 2 is a view showing a temperature-sensitive carrier adsorbed on the surface of a solid-phase carrier.
  • FIG. 3 is a view showing a temperature-sensitive carrier in a micelle or emulsion state.
  • FIG. 4 is a diagram showing a method for separating a complex obtained by interaction.
  • FIG. 5 is a view showing a temperature-sensitive micelle carrier.
  • FIG. 6 is a diagram showing peptide synthesis.
  • FIG. 7 is a diagram showing peptide synthesis.
  • the temperature-sensitive carrier used in the present invention is reversibly changed into a solid state force and a liquid state by changing the temperature, and fixes the anchor site of the first substance in the solid state to form a liquid phase. It does not fix the anchor site in this state and has properties.
  • the temperature-sensitive carrier is not particularly limited as long as it has such properties, and examples thereof include hydrocarbons. Among them, normal tetradecane, normal hexadecane, normal octadecane, eicosane, and cyclohexane, which are preferably hydrocarbons having 10 to 30 carbon atoms, are more preferable. By changing the carbon chains of these hydrocarbons, the temperature at which the solid phase changes to the liquid phase can be changed as desired. Also, by mixing two or more hydrocarbons, the temperature at which the solid state force changes to the liquid phase state is changed.
  • a solid state force changes to a liquid phase state by increasing the temperature. Conversely, a liquid state force also changes to a solid state state by increasing the temperature. May be used.
  • the liquid phase state includes not only a liquid phase but also a softened or semi-solid state of a temperature-sensitive carrier.
  • the solid phase includes not only a solid phase but also a state in which a temperature-sensitive carrier is cured. When the temperature-sensitive carrier is cured, the anchor portion is fixed, and in a softened or semi-solid state, the anchor portion is not fixed.
  • the form of the temperature-sensitive carrier used in the present invention includes, as shown in FIG. 1, a form in which the solid state force of the entire temperature-sensitive carrier also reversibly changes to a liquid phase state, as shown in FIG.
  • a form in which a temperature-sensitive carrier is adsorbed or bonded to the surface of another solid carrier may be used.
  • the solid carrier used at this time is not particularly limited as long as it can adsorb or bind to the temperature-sensitive carrier.
  • silica gel (ODS) having octadecyl groups bound to its surface, glass beads, platinum powder, And the like.
  • alkanes having a higher melting point than cyclohexane which have been dissolved in These can be regarded as carriers by cooling and precipitating them in the form of a mixture with the solvent.
  • the temperature-sensitive carrier used in the present invention may be a form of micelle or emulsion surrounded by a surfactant.
  • the surfactant used at this time is not particularly limited as long as it forms micelles or emulsions. Examples thereof include phospholipids such as phosphatidylcholine and lysophosphatidylcholine. These surfactants may be used as a mixture of two or more kinds as appropriate.
  • the first substance used in the present invention includes an anchor site that can be fixed to a temperature-sensitive carrier, a reaction site that reacts with the second substance, or an interaction site that interacts with the second substance. It has.
  • the anchor site is not particularly limited as long as it can be immobilized on a temperature-sensitive carrier, and examples thereof include a long-chain alkyl group, a polyether chain such as polyethylene glycol (PEG), and polymers such as polystyrene and polyethylene. There are things to mention.
  • the reaction site of the first substance is not particularly limited as long as it reacts with the second substance.
  • examples thereof include an amino group, a carboxyl group, an aldehyde group, a sulfonic acid group, and a Xyl groups, thiol groups, halogenated alkyl groups, unsaturated hydrocarbon groups, nitro groups, acid anhydrides, acid halide isocyanate groups, isothiocyanate groups and the like can be mentioned.
  • the interaction site of the first substance is not particularly limited as long as it interacts with the second substance.
  • the first substance used in the present invention can be produced by binding the anchor site to a reaction site or an interaction site. If necessary, a part of the linker may be provided between the anchor site and the reaction site or interaction site.
  • the linker moiety has a function of providing an appropriate distance between the anchor site and the reaction site or interaction site, and facilitating the reaction or interaction with the second substance.
  • examples thereof include a long-chain alkyl group, a polyether chain such as polyethylene glycol (PEG), and a polythioether chain.
  • PEG polyethylene glycol
  • the method for producing these first substances is not particularly limited, and can be obtained by ordinary chemical synthesis or the like.
  • the second substance used in the present invention is not particularly limited as long as it reacts with a reaction site of the first substance.
  • examples thereof include a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, a sulfonic acid group, and a hydroxyl group.
  • the second substance is not particularly limited as long as it interacts with the interaction site of the first substance.
  • biotin, avidin, antigen, antibody, bioactive substance, peptide, oligosaccharide examples include glycopeptides, nucleic acids, peptides and protein epitopes.
  • an amino group is protected as a reaction site of the first substance, an amino group is protected with t BOC as the second substance, and a carboxyl group is protected with diisopropyl rubidiimide (DIPCD ) And the like.
  • DIPCD diisopropyl rubidiimide
  • a first aspect of the present invention is a method for separating a reactant generated by a reaction between a first substance and a second substance, wherein (a) the first substance and the temperature in a liquid state are separated from each other. (B) changing the temperature of the reaction system to a solid phase by changing the temperature of the reaction system, and fixing the anchor site of the first substance to the temperature-sensitive carrier; (C) reacting a second substance with a reaction site of the first substance immobilized on the temperature-sensitive carrier to obtain a reactant; (d) removing impurities from the reaction system; (e) reacting the reaction substance.
  • the susceptible carrier is a method in which, by changing the temperature, the solid state force is reversibly changed to a liquid state, and the anchor site is fixed in the solid state, and the anchor site is not fixed in the liquid state. .
  • the first substance and the temperature-sensitive carrier are uniformly dissolved or dispersed.
  • the first substance and the temperature-sensitive carrier are dissolved or appropriately used with a solvent such as water. May be dispersed.
  • the temperature-sensitive carrier is changed to a solid phase by changing the temperature.
  • the anchor site of the first substance is fixed to the temperature-sensitive carrier.
  • the reaction site of the first substance reacts with the second substance, and a reactant having the anchor site fixed is obtained.
  • a reaction accelerator, a reaction activator, or the like may be used.
  • impurities such as unreacted second substance, reaction accelerator and reaction activator are removed.
  • the removal method include washing the reaction system with a solvent and filtering.
  • the anchor site of the reactant is fixed to the temperature-sensitive carrier, it is possible to easily separate the impurity from the reactant.
  • the size of the temperature-sensitive solid is small, separation by centrifugation using the specific gravity difference between the temperature-sensitive solid and the solvent or separation of the surface of the temperature-sensitive solid to separate the solvent or impurities dissolved in the solvent.
  • the substance With a high affinity for a specific substance, the substance is pre-bound or trapped and used to interact with another solid surface that interacts with this affinity moiety or with a specific solid surface using a polymer.
  • Small temperature sensitive solid particles may be immobilized. In this case, separation can be easily performed even when there is no difference in specific gravity between the solution and the temperature-sensitive solid particles.
  • the temperature-sensitive carrier is brought into a liquid phase state, whereby the reactant is released from the temperature-sensitive carrier. At this time, the reactant can be released without performing a chemical reaction or the like.
  • the target substance can be obtained by collecting the released reactant.
  • step (d) the desired amino can be obtained by repeating step (c) and step (d) using an extending amino acid as the second substance.
  • Acid-length peptides can be synthesized.
  • a second aspect of the present invention is a method for separating a reactant generated by a reaction between a first substance and a second substance, wherein (a) the first substance and the second substance are separated from each other. Reacting to obtain a reactant, (b) mixing the reactant with a temperature-sensitive carrier in a liquid phase, and (c) changing the temperature of the reaction system to a solid phase by changing the temperature of the reaction system. Immobilizing a part of the anchor of the reactant by changing the temperature to a temperature-sensitive carrier, and (d) removing impurities from the reaction system.
  • the first substance and the second substance are reacted to obtain a reactant.
  • a reaction accelerator, a reaction activator, or the like may be used. This reaction can be performed in a homogeneous system in a solvent, and can be performed more efficiently than the conventional solid phase synthesis method.
  • the reactants and the temperature-sensitive carrier are uniformly dissolved or dispersed.
  • the temperature-sensitive carrier is changed into a solid phase by changing the temperature.
  • the anchor site of the reaction product is fixed to the temperature-sensitive carrier.
  • impurities such as an unreacted second substance, a reaction accelerator and a reaction activator are removed. Examples of the removal method include washing the reaction system with a solvent and filtering.
  • the temperature-sensitive carrier is brought into a liquid phase state, whereby the reactant is released from the temperature-sensitive carrier.
  • the reactant can be released without performing a chemical reaction or the like.
  • the target substance can be obtained by collecting the released reactant.
  • a desired amino acid can be obtained by repeating (a) step-one step (e) using a further extending amino acid as a second substance after the step (e).
  • Long peptides can be synthesized.
  • Figure 7 shows a conceptual diagram of peptide synthesis.
  • cyclohexane is retained and solidified on the surface of a solid phase (ODS) dispersed in DMF.
  • ODS solid phase
  • a third aspect of the present invention is a method for separating a complex formed by an interaction between a first substance and a second substance, comprising: Mixing the temperature-sensitive carrier with a temperature-sensitive carrier, (b) changing the temperature of the reaction system to a solid phase by changing the temperature of the reaction system, and fixing the anchor site of the first substance to the temperature-sensitive carrier; (C) a step of allowing a second substance to interact with an interaction site of the first substance immobilized on the temperature-sensitive carrier to obtain a complex; (d) a step of removing impurities from the reaction system; (e) Changing the temperature-sensitive carrier to a liquid phase state by changing the temperature of the reaction system to release the anchor site of the complex by the temperature-sensitive carrier force, wherein the first substance is a temperature-sensitive carrier.
  • An anchor site that can be immobilized on a carrier and an interaction site that can interact with a second substance The temperature-sensitive carrier reversibly changes to a solid state force and a liquid state by changing the temperature, fixes the anchor site in the solid state, and changes the anchor site in the liquid state. Do not fix, is the way.
  • the first substance and the temperature-sensitive carrier are uniformly dissolved or dispersed.
  • the first substance and the temperature-sensitive carrier may be dissolved or dispersed using a solvent such as water as appropriate.
  • the temperature-sensitive carrier is changed to a solid phase by changing the temperature.
  • the anchor site of the first substance is fixed to the temperature-sensitive carrier.
  • the interaction site of the first substance and the second substance interact with each other, and a complex in which the anchor site is fixed is obtained. At this time, other substances that do not interact with the first substance remain dissolved or dispersed in the solvent without forming a complex.
  • step (d) impurities such as other substances that do not interact with the first substance are removed.
  • the removal method is the reaction system Can be washed with a solvent and filtered.
  • the anchor portion of the complex is fixed to the temperature-sensitive carrier, impurities and the complex can be easily separated.
  • the step (e) the temperature-sensitive carrier is brought into a liquid phase state, whereby the complex is released from the temperature-sensitive carrier. At this time, the complex can be released without performing a chemical reaction or the like.
  • the target substance can be obtained by collecting the released complex (see FIG. 4).
  • a fourth aspect of the present invention is a method for separating a complex formed by an interaction between a first substance and a second substance, wherein (a) the first substance and the second substance are separated.
  • Changing the phase state to release the anchor site of the complex with the temperature-sensitive carrier, wherein the first substance is an anchor site that can be immobilized on the temperature-sensitive carrier, and the second substance is a second substance.
  • an anchor site is introduced into the complex, and the temperature-sensitive carrier reversibly changes to a solid state force and a liquid phase state by changing the temperature, and the anchor site is fixed in the solid state. Then, the anchor site is not fixed in a liquid phase state.
  • the first substance and the second substance are allowed to interact with each other to obtain a complex. At this time, other substances that do not interact with the first substance do not form a complex.
  • the complex and the temperature-sensitive carrier are uniformly dissolved or dispersed. In this case, the first substance and the temperature-sensitive carrier may be dissolved or dispersed using a solvent such as water as appropriate.
  • the temperature is changed to change the temperature-sensitive carrier into a solid phase, and at this time, the anchor site of the complex is fixed to the temperature-sensitive carrier.
  • impurities such as other substances that do not interact with the first substance can be removed.
  • the removal method examples include washing the reaction system with a solvent and filtering. At this time, the complex is anchored Since the site is fixed to the temperature-sensitive carrier, impurities and the complex can be easily separated. Then, in the step (e), the temperature-sensitive carrier is brought into a liquid phase state, whereby the complex is released from the temperature-sensitive carrier. At this time, the complex can be released without performing a chemical reaction or the like. The target substance can be obtained by collecting the released complex.
  • Electrophoresis tank XV PANTERA SYSTEM ERICA
  • Electrophoresis gel XV PANTERA GEL
  • the sample was denatured by heating at 90 ° C. for 15 minutes.
  • the gel for electrophoresis was washed with Milli-Q water, and the sample was applied to the lane in 6-microliter steps, and a current (200 V) was applied for 17 minutes. After completion, the gel was washed three times with Milli-Q water and immersed in the staining solution for one hour. Furthermore, it was immersed in Milli-Q water for decolorization.
  • the avidin molecule captured on the micelle surface was separated and detected.
  • ODS sica gel having octadecyl groups bonded to the surface
  • Example 3 Temporal-Sensitive Homogeneous Solution Reaction (Interaction) • Construction of Solid-Phase Surface Capture System (2)> 1 ml of cyclohexane and 7 ml of NMP (N-methyl-2-pyrrolidone) were mixed at 20 ° C. 2.0 g of ODS (silica gel with octadecyl groups attached to the surface) were dispersed. By stirring at the same temperature using a vortex mixer, cyclohexane, which was the main component of the upper layer due to separation into two phases, was retained on the ODS surface.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the NMP solution was removed by suction filtration, and the solid (cyclohexane 'ODS) was washed three times with 20 ml of NMP cooled to 5 ° C or lower.
  • the solid (cyclohexane 'ODS) was heated to 20 ° C, and cyclohexane was distilled off under reduced pressure using a vacuum pump.
  • the ODS was washed with acetonitrile.
  • the temperature-sensitive homogeneous solution reaction created using NMP ⁇
  • 2-amino-3-methylbutyric acid 3,4,5-tris- 0.1 mmol of octadecyloxybenzyl ester was dissolved.
  • 10 ml of an NMP solution containing 0.3 mmol of Fmoc-Gly-OBt and 5 mmol of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) was added and stirred for 90 minutes.
  • the reaction system was cooled to ⁇ 10 ° C. while stirring.
  • the DMF solution was removed by suction filtration, and the solid (cyclohexane / eicosane) was washed three times with 20 ml of DMF cooled to 0 ° C or lower.
  • the solid (cyclohexane / eicosane) was heated to 20 ° C., and then 10 ml of a 10% DBUZDMF solution was added.
  • the reaction solution was cooled to ⁇ 10 ° C. with stirring.
  • filtration and washing with DMF cooled to 0 ° C or less were performed again.
  • the Fmoc group bound to the N-terminal amino group was removed by DBU treatment and converted to an amino group. By repeating this operation, peptide bonds could be formed sequentially.
  • the mixture was stirred with a mixer (IKA (registered trademark) WERKE) at 20000 rpm for 3 minutes. Don't stir Meanwhile, the container was quenched to o ° c. As a result, the temperature-sensitive carrier was dispersed and fixed in water with the probe portion of the probe molecule with the anchor oriented in the aqueous phase.
  • IKA registered trademark
  • the present invention not only significantly reduces the efficiency of continuous synthesis, purification and separation of chemical substances and biochemical substances, but also significantly increases the efficiency of separation and production methods utilizing the interaction between biological substances and the detection and analysis of specific substances.
  • innovative progress is possible in a wide range of technical fields

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Abstract

【課題】　固相を利用した物質の分離方法において、固相に固定された物質を、化学処理、生化学処理、光照射、電気刺激付与等を与えることなく、容易に分離することができる方法を提供する。 【解決手段】　第１の物質と第２の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、（ａ）第１の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（ｂ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第１の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（ｃ）温度感受性担体に固定された第１の物質の反応部位に第２の物質を反応させて反応物を得る工程、（ｄ）反応系から不純物を除去する工程、（ｅ）反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含む方法を用いる。                                                                         

Description

明 細 書
化学物質の分離方法
技術分野
[0001] 本発明は、化学物質の分離方法に関する。さらに詳しくは、特定の温度感受性担 体と、アンカー部位を有する物質との相互作用を用い、化学物質を効率的に分離す る方法に関する。
背景技術
[0002] 化学プロセス、生化学プロセスにおける物質の化学反応や相互作用は、多くの場 合溶液中で実施される。このようなプロセスにおいて、必要な物質と不要な物質を各 々分離する操作は、目的物質をできる限り高い純度で効率よく得るために必須であ る。従来、物質の分離を行うために、固体である担体粒子を用いた各種クロマトグラフ ィーや、固相合成法が広く用いられている。例えば、ァフィユティークロマトグラフィー は、固相担体表面に予め化学結合させたプローブ分子に対し、親和性の高いリガン ド分子が特異的に結合することにより、その他の分子と区別し、分離を行うものである 。この方法では、固相に結合した物質と液相に溶解した物質の分離は容易である一 方で、固相から物質を切断して目的物を得るためには、一定の処理を行わなければ ならない。すなわち、表面に物質を捕捉した後、再放出させるためには特定の化学 処理、生化学処理、光照射、電気刺激付与などの物理処理などが必要となる（「コ一 ン 'スタンプ 生化学」第 3版、 pl33、東京化学同人)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明の課題は、固相を利用した物質の分離方法において、固相に固定された物 質を、化学処理、生化学処理、光照射、電気刺激付与等を与えることなぐ容易に分 離することができる方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0004] 本発明は、アンカー部分を有する物質のアンカー部分と、温度感受性担体との相 互作用を利用することにより、特定物質の捕捉または放出を制御することを可能にす るものである。
[0005] 即ち、本発明の第 1の態様は、第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した 反応物を分離する方法であって、（a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを 混合する工程、（b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状 態に変化させて、第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、 ( c)温度感受性担体に固定された第 1の物質の反応部位に第 2の物質を反応させて 反応物を得る工程、（d)反応系から不純物を除去する工程、（e)反応系の温度を変 化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部 位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、温度感受 性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と反応する反応部位とを有し、温 度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態力 液相状態に可逆的に 変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない 、方法である。
[0006] 本発明の第 2の態様は、第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した反応物 を分離する方法であって、（a)第 1の物質と第 2の物質とを反応させて反応物を得る 工程、（b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（c)反応系の温 度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカ 一部位を温度感受性担体に固定させる工程、（d)反応系から不純物を除去する工程 、（e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて 、反応物のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と反応する 反応部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを反応させることにより、反応物にアン カー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態か ら液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアン カー部位を固定しない、方法である。
[0007] 本発明の第 3の態様は、第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複 合体を分離する方法であって、（a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混 合する工程、（b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態 に変化させて、第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（c )温度感受性担体に固定された第 1の物質の相互作用部位に第 2の物質を相互作 用させて複合体を得る工程、（d)反応系から不純物を除去する工程、（e)反応系の 温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のァ ンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、 温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と相互作用しうる相互作 用部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態力 液 相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー 部位を固定しない、方法である。
[0008] 本発明の第 4の態様は、第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複 合体を分離する方法であって、（a)第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させて複合 体を得る工程、（b)複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（c)反 応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合 体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（d)反応系から不純物を除 去する工程、（e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態 に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含 み、ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物 質と相互作用する相互作用部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させ ることにより、複合体にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化さ せることにより、固相状態力 液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位 を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、温度感受性担体の温度による固相状態、液相状態の変化を示す図で ある。
[図 2]図 2は、固相担体表面に吸着させた温度感受性担体を示す図である。
[図 3]図 3は、ミセルまたはェマルジヨンの状態の温度感受性担体を示す図である。
[図 4]図 4は、相互作用によりえられた複合体の分離方法を示す図である。
[図 5]図 5は、温度感受性ミセル担体を示す図である。 [図 6]図 6は、ペプチド合成を示す図である。
[図 7]図 7は、ペプチド合成を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明に用いる温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態力 液 相状態に可逆的に変化し、固相状態で第 1の物質のアンカー部位を固定し、液相状 態でアンカー部位を固定しな 、性質を有するものである。温度感受性担体としては、 このような性質を有するものであれば特に制限はないが、例えば、炭化水素を挙げる ことができる。この中でも、炭素原子数 10— 30の炭化水素が好ましぐノルマルテトラ デカン、ノルマルへキサデカン、ノルマルォクタデカン、エイコサン、シクロへキサンが より好ましい。そして、これらの炭化水素の炭素鎖を変化させることにより、固相状態 から液相状態に変化する温度を、所望により変化させることができる。また、 2種以上 の炭化水素を混合することにより、固相状態力 液相状態に変化する温度を変化さ せることちでさる。
[0011] なお、これらの炭化水素では、温度を上昇させることにより固相状態力 液相状態 に変化するが、逆に、温度を上昇させることにより液相状態力も固相状態に変化する 物質を用いてもよい。
[0012] なお、本発明にお 、て、液相状態とは、液相であることのほか、温度感受性担体が 軟化した状態若しくは半固体の状態も含まれる。また、本発明において、固相状態と は、固相であることのほか、温度感受性担体が硬化した状態も含まれる。そして、温 度感受性担体が硬化した状態では、アンカー部を固定し、軟化した状態若しくは半 固体の状態では、アンカー部を固定しない性質を示すこととなる。
[0013] 本発明に用いる温度感受性担体の形態としては、図 1に示すように、温度感受性担 体全体が固相状態力も液相状態に可逆的に変化する形態のほか、図 2に示すように 、他の固体担体の表面に温度感受性担体を吸着若しくは結合させた形態でもよい。 この際に用 、る固体担体としては、温度感受性担体を吸着若しくは結合できるもので あれば特に制限はないが、例えば、ォクタデシル基を表面に結合させたシリカゲル（ ODS)やガラスビーズ、白金粉末、等を挙げることができる。また、シクロへキサン等 にあらかじめ溶解させた、シクロへキサンより融点の高いアルカン類を、シクロへキサ ンと混合物の形で冷却、析出させることにより、これらを担体とみなすこともできる。
[0014] また、本発明に用いる温度感受性担体の他の形態としては、図 3に示すように、界 面活性剤に囲まれたミセルまたはェマルジヨンの形態でもよ 、。この際に用いる界面 活性剤としては、ミセルまたはェマルジヨンを形成するものであれば特に制限はな ヽ 力 例えば、ホスファチジルコリンゃリゾホスファチジルコリン等のリン脂質等を挙げる ことができる。これらの、界面活性剤は、適宜 2種以上を混合して用いることもできる。
[0015] 本発明に用いる、第 1の物質としては、温度感受性担体に固定されうるアンカー部 位と、第 2の物質と反応する反応部位若しくは第 2の物質と相互作用する相互作用部 位とを有するものである。アンカー部位としては、温度感受性担体に固定されうるもの であれば特に制限はないが、例えば、長鎖アルキル基、ポリエチレングリコール (PE G)などのポリエーテル鎖、ポリスチレンやポリエチレンなどのポリマー類等を挙げるこ とがでさる。
[0016] また、第 1の物質の反応部位としては、第 2の物質と反応するものであれば特に制 限はないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルフォン酸基、ヒド 口キシル基、チオール基、ハロゲン化アルキル基、不飽和炭化水素基、ニトロ基、酸 無水物、酸ハロゲン化物イソシァネート基、イソチオシァネート基等を挙げることがで きる。
[0017] さらに、第 1の物質の相互作用部位としては、第 2の物質と相互作用するものであれ ば特に制限はないが、例えば、アビジン、ピオチン、抗原、抗体、生理活性物質、ぺ プチド、オリゴ糖、糖ペプチド、核酸、ペプチドやタンパク質のェピトープ等を挙げるこ とがでさる。
[0018] 本発明に用いる、第 1の物質は上記アンカー部位と、反応部位若しくは相互作用部 位とを結合させること〖こより製造することができる。また、必要に応じ、アンカー部位と 反応部位若しくは相互作用部位との間に、リンカ一部位を設けてもよい。リンカ一部 位は、アンカー部位と反応部位若しくは相互作用部位との間に、適切な距離を持た せ、第 2の物質と反応若しくは相互作用しやすくする働きを有する。リンカ一部位とし ては、特に制限はないが、例えば、長鎖アルキル基、ポリエチレングリコール (PEG) などのポリエーテル鎖、ポリチォエーテル鎖等を挙げることができる。 [0019] なお、これら第 1の物質を製造する方法としては特に制限はなぐ通常の化学合成 等により得ることができる。
[0020] 本発明に用いる第 2の物質としては、第 1の物質の反応部位と反応するものであれ ば特に制限はないが、例えば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、スルフォン 酸基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲンィヒアルキル基、不飽和炭化水素基、 -ト 口基、酸無水物、酸ハロゲンィ匕物イソシァネート基、イソチオシァネート基等を有する ものをあげることができる。または、第 2の物質としては、第 1の物質の相互作用部位 と相互作用するものであれば特に制限はないが、例えば、ピオチン、アビジン、抗原 、抗体、生理活性物質、ペプチド、オリゴ糖、糖ペプチド、核酸、ペプチドやタンパク 質のェピトープ等を挙げることができる。
[0021] 例えば、ペプチド合成を行う場合には、第 1の物質の反応部位としてはァミノ基を、 第 2の物質としては、アミノ基を t BOCで保護し、カルボキシル基をジイソプロピル力 ルビジイミド (DIPCD)等で活性ィ匕したアミノ酸を挙げることができる。
[0022] 次に、本発明の第 1の態様について説明する。
[0023] 本発明の第 1の態様は、第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した反応物 を分離する方法であって、（a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合す る工程、（b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変 化させて、第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（c)温 度感受性担体に固定された第 1の物質の反応部位に第 2の物質を反応させて反応 物を得る工程、（d)反応系から不純物を除去する工程、（e)反応系の温度を変化さ せることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を 温度感受性担体力も放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、温度感受性担 体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と反応する反応部位とを有し、温度感 受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態力 液相状態に可逆的に変化し 、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法 である。
[0024] 上記 (a)工程では、第 1の物質と温度感受性担体が均一に溶解または分散すること となる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第 1の物質と温度感受性担体を溶解また は分散させてもよい。次に、（b)工程において、温度を変化させることにより温度感受 性担体を固相状態に変化させ、このときに第 1の物質のアンカー部位が温度感受性 担体に固定されることとなる。そして、（c)工程において、第 1の物質の反応部位と第 2の物質とが反応し、アンカー部位を固定された反応物が得られることとなる。この際 に、反応促進剤や、反応活性化剤等を用いてもよい。さら〖こ、（d)工程において、未 反応の第 2の物質、反応促進剤、反応活性化剤等の不純物を除去することとなる。除 去の方法としては、反応系を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。こ の際、反応物のアンカー部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純 物と反応物とを分離することが可能となる。また、温度感受性固体のサイズが小さい 場合には、溶媒または溶媒に溶解した不純物との分離のために、温度感受性固体と 溶媒との比重の差を利用した遠心分離による分離、あるいは温度感受性固体表面に 特定の物質に対し親和性の高 、物質を予め結合または捕捉させ、この親和性部分と 相互作用する別の固体表面、あるいは高分子との相互作用を用いて、特定の固体 表面に対し、サイズの小さな温度感受性固体粒子を固定してもよい。この場合は、溶 液と温度感受性固体粒子との比重差がない場合でも、容易に分離が可能となる。そ して、（e)工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより反応物が温度 感受性担体力 放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなしに反応物 を放出することができることとなる。この放出された反応物を回収することにより、目的 物を得ることができる。
[0025] なお、例えば、ペプチド合成の場合は、（d)工程の後、さらに伸張するアミノ酸を第 2の物質として用いて (c)工程および (d)工程を繰り返し行うことにより、所望のァミノ 酸長のペプチドを合成することができる。
[0026] 次に、本発明の第 2の態様について説明する。
[0027] 本発明の第 2の態様は、第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した反応物 を分離する方法であって、（a)第 1の物質と第 2の物質とを反応させて反応物を得る 工程、（b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（c)反応系の温 度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカ 一部位を温度感受性担体に固定させる工程、（d)反応系から不純物を除去する工程 、（e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて 、反応物のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と反応する 反応部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを反応させることにより、反応物にアン カー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態か ら液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアン カー部位を固定しない、方法である。
[0028] 上記 (a)工程では、第 1の物質と第 2の物質を反応させて反応物を得ることとなる。
この際に、反応促進剤や、反応活性化剤等を用いてもよい。この反応は、溶媒中の 均一系で行うことが可能であり、従来の固相合成法に比べ、効率的な反応が可能と なる。次に (b)工程において、反応物と温度感受性担体が均一に溶解または分散す ることとなる。そして、（c)工程において、温度を変化させることにより温度感受性担体 を固相状態に変化させ、このときに反応物のアンカー部位が温度感受性担体に固定 されることとなる。さらに、（d)工程において、未反応の第 2の物質、反応促進剤、反 応活性化剤等の不純物を除去することとなる。除去の方法としては、反応系を溶媒で 洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、反応物のアンカー部位が温度 感受性担体に固定されているため、容易に不純物と反応物とを分離することが可能 となる。そして、（e)工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これにより反応 物が温度感受性担体力 放出されることとなる。この際に、化学反応等を行うことなし に反応物を放出することができることとなる。この放出された反応物を回収することに より、目的物を得ることができる。
[0029] なお、例えば、ペプチド合成の場合は、（e)工程の後、さらに伸張するアミノ酸を第 2の物質として用いて (a)工程一 (e)工程を繰り返し行うことにより、所望のアミノ酸長 のペプチドを合成することができる。図 7に、ペプチド合成の概念図を示す。図 7 (i) において、例えば 0°Cにおいて DMF中に分散された固相（ODS)表面にシクロへキ サンが保持され固化する。このとき、アンカー分子に結合した C末端アミノ酸は、固相 担体表面に固化したシクロへキサンとともに保持される。そして、図 7 (ii)において、 例えば 50°Cに加温することにより、固相表面のシクロへキサンは DMFに完全に溶解 する。それに伴い、アンカー分子に結合した C末端アミノ酸も DMF相に溶解する。こ のとき、アミノ酸伸張試薬と均一溶液中で反応が起こる。そして、図 7 (iii)において、 撹拌しながら再び 0°Cまで冷却すると、 DMF中に溶解して 、たアンカー分子および シクロへキサンは、 ODS表面において、シクロへキサンの固化によって強く保持され る。この状態で、過剰のアミノ酸伸張試薬を DMFをもちいて洗浄、除去することがで さることとなる。
[0030] 次に、本発明の第 3の態様について説明する。
[0031] 本発明の第 3の態様は、第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複 合体を分離する方法であって、（a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混 合する工程、（b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態 に変化させて、第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（c )温度感受性担体に固定された第 1の物質の相互作用部位に第 2の物質を相互作 用させて複合体を得る工程、（d)反応系から不純物を除去する工程、（e)反応系の 温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のァ ンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含み、ここで、第 1の物質は、 温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と相互作用しうる相互作 用部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態力 液 相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー 部位を固定しない、方法である。
[0032] 上記 (a)工程では、第 1の物質と温度感受性担体が均一に溶解または分散すること となる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第 1の物質と温度感受性担体を溶解また は分散させてもよい。次に、（b)工程において、温度を変化させることにより温度感受 性担体を固相状態に変化させ、このときに第 1の物質のアンカー部位が温度感受性 担体に固定されることとなる。そして、（c)工程において、第 1の物質の相互作用部位 と第 2の物質とが相互作用し、アンカー部位を固定された複合体が得られることとなる 。この際に、第 1の物質と相互作用しない他の物質は、複合体を形成することはなぐ 溶媒に溶解または分散したままとなる。さらに、（d)工程において、第 1の物質と相互 作用しない他の物質等の不純物を除去することとなる。除去の方法としては、反応系 を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、複合体は、アンカー 部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と複合体とを分離する ことが可能となる。そして、（e)工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これ により複合体が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を 行うことなしに複合体を放出することができることとなる。この放出された複合体を回 収することにより、目的物を得ることができる（図 4参照)。
[0033] 次に、本発明の第 4の態様について説明する。
[0034] 本発明の第 4の態様は、第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複 合体を分離する方法であって、（a)第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させて複合 体を得る工程、（b)複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、（c)反 応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合 体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、（d)反応系から不純物を除 去する工程、（e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態 に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、を含 み、ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物 質と相互作用する相互作用部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させ ることにより、複合体にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化さ せることにより、固相状態力 液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位 を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
[0035] 上記 (a)工程では、第 1の物質と第 2の物質を相互作用させて複合体を得ることとな る。この際に、第 1の物質と相互作用しない他の物質は、複合体を形成することはな い。次に (b)工程において、複合体と温度感受性担体が均一に溶解または分散する こととなる。この場合、水等の溶媒を適宜用いて第 1の物質と温度感受性担体を溶解 または分散させてもよい。そして、（c)工程において、温度を変化させることにより温 度感受性担体を固相状態に変化させ、このときに複合体のアンカー部位が温度感受 性担体に固定されることとなる。さらに、（d)工程において、第 1の物質と相互作用し ていない他の物質等の不純物を除去できることとなる。除去の方法としては、反応系 を溶媒で洗浄し、濾過すること等を挙げることができる。この際、複合体は、アンカー 部位が温度感受性担体に固定されているため、容易に不純物と複合体とを分離する ことが可能となる。そして、（e)工程において、温度感受性担体を液相状態とし、これ により複合体が温度感受性担体から放出されることとなる。この際に、化学反応等を 行うことなしに複合体を放出することができることとなる。この放出された複合体を回 収することにより、 目的物を得ることができる。
実施例 1
[0036] <アンカー付リガンド分子の合成 >
ピオチン（0. l lg)、N, Ν '—ジスクシィミジルカーボネート（0. 12g)およびトリェチ ルァミン (0. 24g)を DMF15ミリリットルに溶解し、室温にて 6時間攪拌した。次に、こ の溶液に 8 アミノー 3, 6—ジォキサオクタンアミンコレステリルカーバメート（0. 26g) を添加し、反応溶液を 16時間攪拌した。溶媒を、ロータリーエバポレータにより減圧、 留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離'精製し、リガンド付きアンカー 分子である、 { 3— [2— (2— { 2— [5—（2 ォキソ一へキサヒドローチエノ [3, 4— d]イミダゾ 一ルー 4 ィル)—ペンタノィルァミノ] エトキシ }—エトキシ) エトキシ] ェチル } カル ノ ミックアシッド 13— (1, 5—ジメチル—へキシル )—10—メチル—2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17—テトラデカヒドロ一 1H—シクロペンタ [a]フエナントレ ンー 3—ィルエステルを収率 60%で得た。
[0037] <温度感受性ミセル担体の調製 >
水 2ミリリットルに、ホスファチジルコリン 7. 5ミリグラム、リゾホスファチジルコリン 5. 0 ミリグラム、アンカー付きプローブ分子である、 {3— [2— (2— {2— [5— (2—才キソ一へキ サヒドローチエノ [3, 4— d]イミダゾールー 4 ィル) ペンタノィルァミノ] エトキシ }ーェ トキシ)—エトキシ] ェチル }一力ルバミックアシッド 13— ( 1 , 5 ジメチルーへキシル) - 10—メチル—2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17—テトラデカヒドロ —1H—シクロペンタ [a]フエナントレン 3—ィルエステル 35. 0ミリグラム、ノルマルへキ サデカン 30ミリグラムを溶解させ 30°Cの湯浴中にて二重円筒ミキサー (IKA (登録商 標) WERKE)で 20000rpmにて、 3分間撹拌した。その後氷浴で 10分冷却した（ 図 5参照)。
[0038] <電気泳動による Avidinの検出 > 得られたミセル溶液 20マイクロリットルに、 6ミリグラム Zミリリットルのアビジン（Imm unoPure (登録商標） Avidin； PIERCE)水溶液を 20マイクロリットルをカ卩ぇ 1分間ホ モミキサー (IKA (登録商標) -WERKE)で撹拌した。その後サンプルを常時冷やし ながら緩衝液（トリス塩酸緩衝液 + EDTA)をカ卩えて洗浄し、マイクロコン YM— 100 ( Microcon (登録商標）遠心式フィルター、 M. W. 10万； MILLIPORE)を利用して 濃縮を 5回繰り返した。反応液を 40°Cの湯浴中で攪拌しながら、 1時間加熱した。そ の後、遠心分離 (チビタン II卓上遠心機； MILLIPORE)によってミセルを取り除い て下相の水溶液をサンプリングし、以下の条件で電気泳動を行った。
電気泳動槽： XV PANTERA SYSTEM ERICA
電気泳動用ゲル： XV PANTERA GEL
染色液： Bio— Safe™Coomassie； Commasie (登録商標） G250Stain (BIO— RAD バッファー： 0. 0625MTrisHCl (pH6. 8)、 5%2 メルカプトエタノール、 0. 005% BPB、 20%グリセロール、 2%SDS
[0039] サンプル 4マイクロリットルをサンプルバッファー 4マイクロリットルで希釈した後、 90 °Cで 15分間加熱して変性させた。電気泳動用ゲルをミリ Q水で洗浄し、 6マイクロリツ トルずつサンプルをレーンに流し、 17分間電流（200V)を流した。終了後ゲルをミリ Q水で 3回洗浄し、染色液に一時間浸した。さらに、脱色のためミリ Q水に一晚浸漬し た。本操作によりリガンドアンカー分子と相互作用することによって、ミセル表面に捕 捉されたアビジン分子を分離、検出した。
実施例 2
[0040] く温度感受性均一溶液反応湘互作用）'固相表面捕捉システムの構築（1) >
シクロへキサン 1ミリリットル、 DMF (ジメチルホルムアミド） 9ミリリットルを 25°Cで混合 した溶液に、 ODS (ォクタデシル基を表面に結合したシリカゲル） 2. 0グラムを分散さ せた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分離により 上層の主成分となっていたシクロへキサンは ODS表面に保持された。次にこの溶液 を 0°Cに冷却すると、 ODS表面のシクロへキサンは凝固し、表面保持状態で固化し た。次に、この分散液を 50°Cに加温すると、シクロへキサンは融解するとともに、 DM Fと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが可能で めつに。
<シクロへキサン' DMF · ODS系を用いたペプチド結合形成 >
DMFを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応 (相互作用） ·固相表面捕 捉システムを 50°Cに加温した後、 2-ァミノ- 3-メチル -ブチリックアシッド 3, 4, 5—トリ スーォクタデシロキシ一べンジルエステル 0. 1ミリモルを溶解した。ここに Fmoc— Gly — OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD) 0.5ミリモルを含む D MF溶液 20ミリリットルを添加し 90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しなが ら 0°Cまで冷却した。冷却後、吸引ろ過法により DMF溶液を除去し、固形物（シクロ へキサン 'ODS)を 5°C以下に冷却した DMF20ミリリットルで 3回洗浄した。次に、固 形物（シクロへキサン 'ODS)を 40°Cに加温、真空ポンプを用いてシクロへキサンを 減圧留去した。最後に ODSをァセトニトリルを用いて洗浄した。ァセトニトリル溶液か ら、 2— [2— (9H フルオレン 9 ィルメトキシカルボ-ルァミノ）—ァセチルァミノ]— 3— メチルーブチリックアシッド 3, 4, 5—トリスーォクタデシルォキシベンジルエステルを収 率 97%で得た。
— NMR (400MHz) d: 7.77 (2H, d, J = 7.3Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.3Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.3Hz), 7.31 (2H, dt, J = 0.7, 7.3Hz), 6.52 (2H, s), 6 .38(1H, d, J = 8.4Hz), 5.44—5.37(1H, br), 5. 10(1H, d, J=12.1Hz), 5.02(1H, d, J=12.1Hz), 4.62 (2H, dd, J = 8.4, 4.8Hz), 4.42 (2H, d, J =7.0Hz), 4.24 (1H, t, J = 7.0Hz), 3.96—3.92 (8H, m), 2.21—2. 16(1
H, m), 1.81—1.76 (4H, m), 1.75—1.70 (2H, m), 1.48—1.43 (6H, m),
I.37—1.21(84H, br), 0.91 (3H, d, J = 7.0Hz), 0.88 (9H, t, J = 7.0Hz) , 0.86 (3H, d, J = 7.0Hz) ;13C—NMR (150MHz) d: 171.5, 168.7, 156.5, 153.1, 143.6, 141.2, 138.3, 130.0, 127.7, 127.0, 125.0, 120.0, 1 07.0, 73.4, 69.2, 67.5, 67.4, 57. 1, 47.1, 32.0, 31.4, 30.4, 29.8
, 29.7, 29.5, 29.4, 26. 1, 22.8, 19.0, 17.7, 14.2 ; MALDITOF-MS ( pos)calcd for C H NO [M+Na]+ 1314, found 1314.
83 138 2 8
実施例 3 [0042] <温度感受性均一溶液反応 (相互作用） ·固相表面捕捉システムの構築 (2) > シクロへキサン 1ミリリットル、 NMP (N—メチルー 2 ピロリドン） 7ミリリットルを 20°C で混合した溶液に、 ODS (ォクタデシル基を表面に結合したシリカゲル） 2. 0グラム を分散させた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分 離により上層の主成分となっていたシクロへキサンは ODS表面に保持された。次にこ の溶液を 10°Cに冷却すると、 ODS表面のシクロへキサンは凝固し、表面保持状態 で固化した。次に、この分散液を 20°Cに加温すると、シクロへキサンは融解するととも に、 NMPと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが 可能であった。
[0043] <シクロへキサン' NMP · ODS系を用 、たペプチド結合形成 >
NMPを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応 (相互作用） ·固相表面捕 捉システムを 20°Cに加温した後、 2-ァミノ- 3-メチル -ブチリックアシッド 3, 4, 5—トリ スーォクタデシロキシベンジルエステル 0. 1ミリモルを溶解した。ここに Fmoc— Gly— OBt 0. 3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD) 0. 5ミリモルを含む NM P溶液 10ミリリットルを添加し 90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら— 10°Cまで冷却した。冷却後、吸引ろ過法により NMP溶液を除去し、固形物（シクロ へキサン 'ODS)を 5°C以下に冷却した NMP20ミリリットルで 3回洗浄した。次に、固 形物（シクロへキサン 'ODS)を 20°Cに加温、真空ポンプを用いてシクロへキサンを 減圧留去した。最後に ODSをァセトニトリルを用いて洗浄した。ァセトニトリル溶液か ら、 2— [2— (9H フルオレン 9 ィルメトキシカルボ-ルァミノ）—ァセチルァミノ]— 3— メチルーブチリックアシッド 3, 4, 5—トリスーォクタデシルォキシ一べンジルエステルを 収率 99%で得た（図 6参照)。
実施例 4
[0044] <シクロへキサン' DMF · ODS系を用 、たペプチド結合逐次連続形成反応 >
DMFを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応 (相互作用） ·固相表面捕 捉システムを 50°Cに加温した後、 2—ァミノ- 3—メチル -ブチリックアシッド 3, 4, 5—トリ スーォクタデシロキシ一べンジルエステル 0. 1ミリモルを溶解した。ここに Fmoc— Gly -OBt 0. 3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD) 0. 5ミリモルを含む DM F溶液 20ミリリットルを添加し 90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら 0 °Cまで冷却した。冷却後、吸引ろ過法により DMF溶液を除去し、固形物（シクロへキ サン 'ODS)を DMF20ミリリットルで 3回洗浄した。次に、固形物（シクロへキサン ·0 DS)を 20°Cに加温した後、 10%DBUZDMF溶液を 10ミリリットル添カ卩した。同温 度にて 2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を 0°Cに冷却する。冷却固化が完了し た後、再びろ過、 DMFによる洗浄をおこなった。 DBU処理操作により N末端アミノ基 に結合した Fmoc基ははずれ、ァミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、 ペプチド結合を逐次形成することができた
'H-NMR (600MHz) d: 7. 74 (lHd, J = 9. 2Hz) , 6. 53 (2H, s) , 5. 11 (1H, d , J= 12. 1Hz) , 5. 02 (1H, d, J= 12. 1Hz) , 4. 61 (1H, dd, J = 9. 2, 5. 1Hz) , 3. 95 (4H, t, J = 6. 6Hz) , 3. 94 (2H, t, J = 6. 6Hz) , 3. 39 (2H, s) , 2. 24— 2. 18 (1H, m) , 1. 81—1. 76 (4H, m) , 1. 75—1. 71 (2H, m) , 1. 49—1. 44 (6 H, m) , 1. 37-1. 20 (84H, br) , 0. 93 (3H, d, J = 7. 0Hz) , 0. 90—0. 86 (12 H, m) ; 13C-NMR(150MHz) d:172. 6, 171. 8, 153. 1, 130. 3, 125. 5, 106 . 9, 73. 4, 69. 2, 67. 2, 56. 6, 44. 8, 32. 0, 31. 3, 30. 4, 30. 3, 29. 8, 2 9. 7, 29. 5, 29. 4, 26. 2, 22. 8, 19. 1, 17. 8, 14. 2 ;MALDI TOF-MS (p os) calcd for C H N O [M+Na]+ 1091, found 1091.
68 128 2 6
実施例 5
<シクロへキサン' NMP · ODS系を用!、たペプチド結合逐次連続形成反応 >
NMPを用いて作成した該温度感受性均一溶液反応 (相互作用） ·固相表面捕捉 システムを 20°Cに加温した後、 2—アミノー 3—メチルーブチリックアシッド 3, 4, 5—トリス ーォクタデシロキシベンジルエステル 0. 1ミリモルを溶解した。ここに Fmoc— Gly— O Bt 0. 3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD) O. 5ミリモルを含む NMP 溶液 10ミリリットルを添加し 90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら- 1 0°Cまで冷却した。冷却後、吸引ろ過法により DMF溶液を除去し、固形物（シクロへ キサン 'ODS)を 5°C以下に冷却した NMP20ミリリットルで 3回洗浄した。次に、固形 物（シクロへキサン 'ODS)を 20°Cに加温した後、 10%DBUZNMP溶液を 10ミリリ ットル添加した。同温度にて 2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を- 10°Cに冷却 する。冷却固化が完了した後、再びろ過、 NMPによる洗浄をおこなった。 DBU処理 操作により N末端アミノ基に結合した Fmoc基ははずれ、ァミノ基に変換された。同操 作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
実施例 6
[0046] くシクロへキサン 'DMF'エイコサン (アルカン）を用いたペプチド結合逐次連続形成 反応 >
2—ァミノ一 3—メチルーブチリックアシッド 3, 4, 5—トリスーォクタデシロキシベンジルェ ステル 0. 1ミリモル、エイコサン 100ミリグラムを DMF9ミリリットル、シクロへキサン 1 ミリリットル溶解した。ここに Fmoc— Gly— OBt 0. 3ミリモル、ジイソプロピルカルボジ イミド（DIPCD) O. 5ミリモルを含む DMF溶液 5ミリリットルを添カ卩し 90分間 25°Cにて 攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら 10°Cまで冷却した。このとき、白色固 形粒子が析出した。吸引ろ過法により DMF溶液を除去し、固形物（シクロへキサン · エイコサン)を 0°C以下に冷却した DMF20ミリリットルで 3回洗浄した。次に、固形物（ シクロへキサン ·エイコサン）を 20°Cに加温した後、 10%DBUZDMF溶液を 10ミリリ ットル添加した。同温度にて 2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を- 10°Cに冷却 した。冷却固化が完了した後、再びろ過、 0°C以下に冷却した DMFによる洗浄をお こなった。 DBU処理操作により N末端アミノ基に結合した Fmoc基ははずれ、アミノ基 に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができ た。
実施例 7
[0047] <アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法
(ODS粒子を利用する場合） (1) >
50oCにお ヽてァニリン 0. 05ミリモノレカ溶解した DMF溶液 10ミリリツ卜ノレに、 3, 4, 5 —トリスーォクタデシロキシべズアルデヒド 0. 1ミリモルおよびシクロへキサン 3ミリリット ルを溶解した。 16時間攪拌し、 ODS2. 0グラムを添加後、攪拌しながら 10°Cまで 冷却した。冷却後、吸引ろ過法により DMF溶液と固形物（シクロへキサン 'ODS)を 分離した。固形部分は冷却時に 0°C以下に冷却した 10ミリリットルを用いて洗浄した。 本操作によりァ-リンはアルデヒドと反応し、固形物中に 98%の反応収率で捕捉され た。
実施例 8
[0048] <アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法
(ODS粒子を利用しない場合） (2) >
50oCにお ヽてァニリン 0. 05ミリモノレカ溶解した NMP溶液 10ミリリツ卜ノレに、 3, 4, 5—トリスーォクタデシロキシべズアルデヒド 0. 1ミリモルおよびシクロへキサン 3ミリリツ トルを溶解した。 16時間攪拌し、攪拌しながら 10°Cまで冷却した。冷却後、吸引ろ 過法により NMP溶液と固形物（シクロへキサン)を分離した。固形部分は冷却時に N MP10ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりァ-リンはアルデヒドと反応し、固 形物中に 96%の反応収率で捕捉された。
実施例 9
[0049] <アミノ基を有する物質を均一溶液系から除去するスカベンジャーとしての応用方法
(ODS粒子を利用しない場合） (3) >
50oCにお ヽてァニリン 0. 05ミリモノレカ溶解した DMF溶液 10ミリリツ卜ノレに、 3, 4, 5 —トリスーォクタデシロキシべズアルデヒド 0. 1ミリモル、シクロへキサン 3ミリリットル、 エイコサン 500ミリグラムを溶解した。 16時間攪拌し、攪拌しながら 0°Cまで冷却した。 冷却後、吸引ろ過法により DMF溶液と固形物（シクロへキサンおよびエイコサンの混 合物）を分離した。固形部分は冷却時に DMF10ミリリットルを用いて洗浄した。本操 作によりァ-リンはアルデヒドと反応し、固形物中に 98%の反応収率で捕捉された。
列
[0050] <温度感受性固相担体の調製 >
水 2ミリリットルに、アンカー付プローブ分子である、 {3—[2—（2—{2—[5—（2 ォキソ キサヒドロ—チエノ [3, 4— d]イミダゾールー 4 ィル) ペンタノィルァミノ]—エトキシ }—エトキシ) エトキシ]—ェチル}一力ルバミックアシッド 13— ( 1 , 5—ジメチル キシ ル)— 10—メチル—2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17—テトラデカ ヒドロ一 1H—シクロペンタ [a]フエナントレン 3—ィルエステル 35. 0ミリグラム、ノルマ ルへキサデカン 300ミリグラムを溶解させ、 30°Cの湯浴中にて二重円筒ミキサー（IK A (登録商標) WERKE)で 20000rpmにて、 3分間撹拌した。そのまま攪拌をしな がら、容器を o°cまで急冷した。これにより、アンカー付プローブ分子のプローブ部分 を水相に配向した形で、温度感受性担体を水中に分散、固定ィ匕した。
産業上の利用可能性
本発明により化学物質、生化学物質の連続合成 ·精製 ·分離作業が著しく効率ィ匕 するばかりではなぐ生体物質間の相互作用を利用した物質分離生成法や特定物 質の検出'分析法などきわめて広範な技術分野において革新的な進展が可能となる

Claims

請求の範囲
[1] 第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
(a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、 第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(c)温度感受性担体に固定された第 1の物質の反応部位に第 2の物質を反応させて 反応物を得る工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、 反応物のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、
を含み、
ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と 反応する反応部位とを有し、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的 に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しな い、方法。
[2] 第 1の物質と第 2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
(a)第 1の物質と第 2の物質とを反応させて反応物を得る工程、
(b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、 反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、 反応物のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、
を含み、
ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と 反応する反応部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを反応させることにより、反応 物にアンカー部位が導入され、 温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的 に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しな い、方法。
[3] 第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であ つて、（a)第 1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、 第 1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(c)温度感受性担体に固定された第 1の物質の相互作用部位に第 2の物質を相互 作用させて複合体を得る工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、 複合体のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、
を含み、
ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と 相互作用しうる相互作用部位とを有し、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的 に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しな い、方法。
[4] 第 1の物質と第 2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であ つて、（a)第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、
(b)複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、 複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、 複合体のアンカー部位を温度感受性担体力 放出させる工程、
を含み、
ここで、第 1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第 2の物質と 相互作用する相互作用部位とを有し、第 1の物質と第 2の物質とを相互作用させるこ とにより、複合体にアンカー部位が導入され、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的 に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しな い、方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5493745B2 (ja) * 2009-11-13 2014-05-14 トッパン・フォームズ株式会社 化学物質の分離キット及び分離方法
JP5494003B2 (ja) * 2010-02-26 2014-05-14 トッパン・フォームズ株式会社 化学物質の分離キット及び分離方法
CN104628129B (zh) * 2015-02-11 2016-08-24 环境保护部南京环境科学研究所 废水好氧处理系统的有机化学品暴露水平预测方法
CN104649413B (zh) * 2015-02-11 2016-06-01 环境保护部南京环境科学研究所 厌氧-缺氧-好氧处理系统的化学品暴露水平预测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001096104A (ja) * 1999-07-29 2001-04-10 Univ Kansai 液中の有機物の除去方法及び除去装置
JP2002249523A (ja) * 2001-02-26 2002-09-06 Toyobo Co Ltd 蛋白質精製用担体、その製造方法及びそれを用いた蛋白質の精製方法
JP2002273217A (ja) * 2001-03-14 2002-09-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 液体炭化水素の固形化材とその使用及び炭化水素の固形化方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH596313A5 (ja) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US6797846B2 (en) * 2001-03-14 2004-09-28 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Fibrous crystal aggregates, preparation method thereof and use thereof
JP4283469B2 (ja) * 2001-12-19 2009-06-24 独立行政法人科学技術振興機構 相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001096104A (ja) * 1999-07-29 2001-04-10 Univ Kansai 液中の有機物の除去方法及び除去装置
JP2002249523A (ja) * 2001-02-26 2002-09-06 Toyobo Co Ltd 蛋白質精製用担体、その製造方法及びそれを用いた蛋白質の精製方法
JP2002273217A (ja) * 2001-03-14 2002-09-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 液体炭化水素の固形化材とその使用及び炭化水素の固形化方法

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