JP2002249523A

JP2002249523A - 蛋白質精製用担体、その製造方法及びそれを用いた蛋白質の精製方法

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Publication number: JP2002249523A
Application number: JP2001050144A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Hoshino; 一宏星野; Kazuaki Komoto; 和明幸本; Yutaka Tokiwa; 豊常盤; Masaru Kitagawa; 優北川; Takao Raku; 隆生楽
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd; Konan Kako KK
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd; Konan Kako KK
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2002-09-06
Anticipated expiration: 2021-02-26
Also published as: JP4605919B2

Abstract

(57)【要約】【課題】糖質間の結合の中でアノメリック水酸基以外
の水酸基が結合に関係している糖質や遊離のアノメリッ
ク水酸基を認識する物質と親和性があり、アノメリック
水酸基以外の水酸基を介して、ポリマー鎖に結合した構
造の糖リガンドを有した、より低温に曇点を有する温度
感受性ポリマー及びその製造方法とそれを利用した蛋白
質の精製方法を提供する【解決手段】下記一般式（１）（式中、R₁はメチ
レン基又はアルキレン基、Sは糖化合物からアノメリッ
ク水酸基以外の１個の水酸基が除かれた糖残基を示す）
で表される構造単位および下記一般式（２）で表される
構造単位からなる共重合体。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な温度刺激応答
性高分子化合物とその製造方法及びそれを利用したアフ
ィニティ沈殿によるタンパク精製に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質の精製にはそのリガンドを担体に
結合したアフィニティカラムクロマトグラフィーが広く
利用されている。しかし、その精製工程においては長時
間を要し、また大量の溶出液を必要とする。近年、生理
活性物質を機能性高分子で修飾したハイブリッド技術が
めざましく進展してきている。これにより、生理活性物
質の機能変換、新機能の付加が可能となった。そのひと
つとして可溶不溶可逆性高分子を利用したアフィニティ
沈殿法による有用物質の精製が挙げられる（J. Fermen
t. Bioeng., 68, 32-36, 1989、Biomaterial, 11, 625-
639, 1990, Biomaterial, 11, 631-634, 1990 Bioconju
gate Chem., 4, 509-514,1993、Biotechnol.Bioeng., 4
0,1381-1387, 1992）。これまでの研究からPoly N-acry
loyl piperidine (pAP)にマルトースを導入したpAP-Mal
tose（マルトースのアノメリック位に重合性基が結合し
たもの）は、レクチンやα-グルコシダーゼに対して強
い親和性を示し、アフィニティ沈殿により高度にタンパ
クを精製することが明らかになっている（K.Hoshino et
al., Biotechnol. Bioeng., 60, 568-579,1998）。

【０００３】しかしながら、上記高分子では、アノメリ
ック水酸基を介して糖質がポリマー鎖に結合した構造を
有しているため、各種グリコシダーゼを特異的に認識す
ることができなかった。

【０００４】このように、糖をリガントとするアフィニ
ティ吸着体の調整方法は、主に糖のアノマー位を化学修
飾した重合性糖質誘導体との共重合体を合成する方法が
とられている。そのためそれらの吸着体を用いたアフィ
ニティ沈殿法は、糖のアノマー位のグリコシル結合を特
異的に認識するレクチン類および糖加水分解酵素などに
対して有効である。しかし、糖のアノマー位以外の水酸
基が関係する糖質間の結合を認識するレクチン類および
糖加水分解酵素などの精製には、これまでの重合性糖質
誘導体では不可能であった。また、N-イソプロピルアク
リルアミドと重合性糖エステルとの共重合体からなる温
度感受性ポリマーも報告されているが（特開2000-21222
8）、沈殿が生じてくる温度が30℃以上と高く不安定な
タンパクの精製には適していない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、糖質間の結合の中でアノメリック水酸基以外の水酸
基が結合に関係している糖質を認識する物質と親和性が
あり（例えば、グリコシド結合の非還元末端側の糖質を
認識する物質と親和性があり）、アノメリック水酸基以
外の水酸基を介して、ポリマー鎖に結合した構造の糖リ
ガンドを有した、より低温に曇点を有する温度感受性ポ
リマー及びその製造方法とそれを利用した蛋白質の精製
方法を提供することにある。

【０００６】

【問題を解決するための手段】本発明者は、上記の目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ジカルボン酸ビニ
ルエステルに糖が結合した重合性の糖エステルとアクリ
ロイルピペリジンとを共重合させることにより、10℃辺
りに曇点を持つ共重合体を合成することに成功して、本
発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の発明を
提供するものである。

【０００７】項１．下記一般式（１）

【０００８】

【化４】

【０００９】（式中、R₁はメチレン基又はアルキレン
基、Sは糖化合物からアノメリック水酸基以外の１個の
水酸基が除かれた糖残基を示す）で表される構造単位お
よび下記一般式（２）

【００１０】

【化５】

【００１１】で表される構造単位からなる共重合体。

【００１２】項２．一般式（１）で表される構造単
位を０．０１〜９９．９９モル％、及び一般式（２）で
表される構造単位を９９．９９〜０．０１モル％含有す
る項１に記載の共重合体。

【００１３】項３．一般式（１）中の糖化合物が、
単糖類、オリゴ糖類、多糖類及びその部分加水分解物並
びにそれらの誘導体から選択される化合物である、項１
又は２に記載の共重合体。

【００１４】項４．下記一般式（３）の化合物

【００１５】

【化６】

【００１６】（式中、R₁はメチレン基又はアルキレン
基、Sは糖化合物からアノメリック水酸基以外の１個の
水酸基が除かれた糖残基を示す。）で表される重合性糖
エステルとアクリロイルピペリジンを、重合開始剤存在
下にラジカル重合させる、請求項１〜３のいずれかに記
載の共重合体の製造方法。

【００１７】項５．モノマー総量１００モル％に基
づいて、一般式（３）の化合物０．１〜９９．９モル
％、アクリロイルピペリジン９９．９〜０．１モル％か
らなるモノマー混合物を、重合開始剤存在下にラジカル
重合させる、項４に記載の製造方法。

【００１８】項6．項１〜３のいずれかに記載の共
重合体を用いて、蛋白質を精製する方法。

【００１９】項７．請求項６に記載の精製方法であ
って、 i)蛋白質を含む試料と項１〜３のいずれかに記載の共重
合体を１〜５℃程度の条件下混合し、 ii)混合物の温度を７〜１５℃程度に上昇させ、沈殿物
と溶液とに分離し、 iii)得られた沈殿物に、１〜５℃程度の条件下、脱離剤
を加えて蛋白質を解離させることを含む方法。

【００２０】

【発明の実施の形態】一般式（３）の化合物本発明の共重合体の合成に用いる重合性の糖エステル
は、前記一般式（３）で表される。R₁としては特に制限
はないが、通常、エチレン基又は炭素数２〜１８の直鎖
又は分岐状のアルキレン基、好ましくは炭素数２〜８の
直鎖または分岐アルキレン、例えば、エチレン、トリメ
チレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレ
ン、オクタメチレン基などが挙げられる。好ましくは、
テトラメチレンである。

【００２１】また、糖残基Ｓを与える糖化合物も特に制
限はないが、単糖類、オリゴ糖類、多糖類及びその部分
加水分解物ならびにそれらの誘導体（例えば、アミノ
糖、配糖体、核酸、糖アルコール、ウロン酸、アルコル
ビン酸等）が例示できる。

【００２２】例えば、単糖類としては、グルコース、フ
ルクトース、マンノース、ガラクトース等のヘキソー
ス、アラビノース、キシロース、リボース等のペントー
スが例示できる。

【００２３】オリゴ糖類としては、スークロース、マル
トース、セロビオース、ラクトース、トレハロース等の
二糖類、ラフィノース、マルトトリオース等の三糖類、
マルトテトラオース、マルトペンタオース、サイクロデ
キストリン等が例示できる。

【００２４】多糖類およびその部分加水分解物として
は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キ
トサン、マンナン、プルラン、カードラン、キシラン、
ガラクトマンナン、グルコマンナン、デキストラン、ヒ
アルロン酸等の多糖およびそれらの部分加水分解物（例
えば、デキストリン）などが挙げられる。

【００２５】アミノ糖としては、グルコサミン、ガラク
トサミンやノイラミン酸等のシアル酸等が、配糖体とし
ては、アルブチン、サリシン、ポプリン等が、核酸とし
ては、アデノシン、ウリジン、チミジン、グアノシン、
シチジン、２’− デオキシシチジン、２’−デオキシ
アデノシン、２’−デオキシグアノシン等が例示でき
る。

【００２６】好ましくは、単糖類や二糖類である。より
好ましくは、グルコース、マンノース、ガラクトース、
マルトース、トレハロース）である。

【００２７】これら糖化合物は、Ｄ体でもＬ体でもよい
し、両者の混合物でもよい。好ましくは、Ｄ体のもので
ある。

【００２８】「アノメリック水酸基以外の水酸基」とし
ては、上記糖化合物中、アノメリック炭素に結合してい
る水酸基以外の水酸基を意味する。即ち、アノメリック
炭素とは、アルドースの場合には、アルデヒド基中の炭
素（Ｃ−１）をいい、ケトースの場合には、ケトン基中
の炭素（Ｃ−２）をいう。従って、「アノメリック水酸
基以外の水酸基」とは、炭素数６のアルドースの場合に
は、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４及びＣ−６に結合している
水酸基、炭素数６のケトースの場合には、Ｃ−１、Ｃ−
３、Ｃ−４及びＣ−５に結合している水酸基となる。

【００２９】好ましい一般式（３）の化合物としては、
Ｒ₁がテトラメチレンであり、Ｓが糖化合物が単糖類ま
たは二糖類（より好ましくは、グルコース、マンノー
ス、ガラクトース、マルトース、トレハロース）であっ
て、６位或いは６’位の水酸基に重合性基を配するもの
である。

【００３０】本発明で用いられる重合性の糖エステル
（一般式（３）の化合物）は、ジカルボン酸ビニルエス
テルと糖化合物とを化学的にエステル結合させるか、あ
るいは加水分解酵素（もしくは該酵素を産生する微生物
等）を用いて酵素化学的に（もしくは発酵的に）結合さ
せることにより合成することができる。

【００３１】酵素化学的にエステル結合させる場合に
は、酵素としてプロテアーゼやリパーゼ、特に放線菌由
来やバチルス属由来のプロテアーゼやアルカリゲネス属
やブタ膵臓由来のリパーゼが好ましく用いられる。また
は、各種由来のエステラーゼを用いてもよい。

【００３２】化学的にエステル結合させる場合には、例
えば、塩基触媒を用いた方法（J. Org. Chem., 53, 449
(1988)）に記載の方法によって合成し、例えばシリカ
ゲル等のカラムで分離し得ることができる。

【００３３】本発明で用いる重合性アクリル酸において
はアクリロイルピペリジンが挙げられる。

【００３４】本発明の共重合体本発明における一般式（３）の化合物及びアクリロイル
ピペリジンの混合比としては、モノマー総重量１００モ
ル％に基づいて、一般式（３）の化合物が０．１〜９
９．９モル％、アクリロイルピペリジンが９９．９〜
０．１モル％、好ましくは、一般式（３）の化合物が１
〜５０モル％、アクリロイルピペリジンが５０〜９９モ
ル％程度の割合で混合する。このような範囲内であれ
ば、所望の共重合体（即ち、一般式（１）で表される構
造単位が共重合体中に０．０１〜９９．９９モル％、好
ましくは０．１〜２０モル％含有される）が得られる。

【００３５】本発明の共重合体は、例えば下記の方法に
より製造することができる。即ち、上記の糖エステル
（一般式（３）の化合物）およびアクリロイルピペリジ
ンを混合し、該混合物をラジカル重合開始剤の存在下、
加熱等により重合反応を開始させることによって合成で
きる。好ましくは、糖エステル（一般式（３）の化合
物）およびアクリロイルピペリジンを溶媒中に溶解し、
該混合物をラジカル重合開始剤の存在下、加熱等により
重合反応を開始させることによって合成するのがよい。

【００３６】溶媒としては、重合反応に関与せず、原料
モノマーが溶解可能であれば、特に限定されないが、Ｄ
ＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジンやメタノール、エタノール、
t-ブチルアルコール等のアルコール類、水等が例示で
き、好ましくは、t-ブチルアルコールである。溶媒と該
モノマー混合物との混合比は、得られる共重合体の要求
物性に基づいて任意の範囲で混合できるが、通常は、モ
ノマー混合物１重量部に対して、溶媒を１〜１００重量
部の範囲で混合するのがよい。この範囲を越えると分子
量が低下するのおそれがある。

【００３７】ラジカル重合開始剤としては、特に限定さ
れないが、アゾイソブチルニトリル（Azoisobutylnitri
le (AIBN)）、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩（Azobi
s(2-amidinopropane)・2HCl）等のアゾ化合物や、フェ
ントン試薬等が例示でき、好ましくは、アゾ化合物、特
にAIBNである。ラジカル重合開始剤の使用量としては、
得られる共重合体の要求物性に応じて任意の範囲で用い
られるが、通常はモノマー総量１００モル％の０．１〜
２モル％程度である。

【００３８】重合は、例えば、上記各モノマー及び溶媒
を均一に混合したモノマー溶液に、ラジカル重合開始剤
を添加、混合し、50〜80℃で1時間以上行わせる。望ま
しくは、65℃程度で２〜２４時間程度反応させることに
より合成される。モノマー溶液は、高分子量のポリマー
を得るために脱気することが好ましく、また、ラジカル
重合開示剤を加えた後も同様である。重合反応中、攪拌
することが好ましい。

【００３９】反応終了後、溶媒を除去し、残渣を蒸留水
等に溶解させる。得られた共重合体は、温度応答性があ
るので、７〜１５℃程度の条件にすることによって、沈
殿物として回収することができる。

【００４０】更に必要に応じて、例えば有機溶剤で洗浄
や、透析等によって精製してもよい。

【００４１】本発明の共重合体は、前記一般式（１）で
表される構造単位および前記一般式（２）で表される構
造単位からなり、構造単位（１）を０．０１〜９９．９
９モル％、好ましくは０．１〜２０モル％で含有する
（即ち、構造単位（２）を０．０１〜９９．９９モル
％、好ましくは８０〜９９．９モル％）。低温で沈殿を
生じる温度刺激応答性ポリマーを得るためには、構造単
位（２）を有する共重合体を８０〜９９．９モル％含む
（即ち、構造単位（１）を０．１〜２０モル％）ことが
望ましい。

【００４２】本発明の共重合体の分子量には特に制限は
ないが、好ましくは数平均分子量で３０００〜６０００
００、好ましくは、１００００〜１０００００である。
分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさの
ものを選択することができる。また、重合性糖エステル
の組成比率を多くすることによって、タンパクの吸着量
を増やすことができる。

【００４３】本発明の共重合体は、ランダム構造を有し
ていてもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上
記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法
であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製
法を参照し、常法に従い、製造することができる。

【００４４】本発明の共重合体は、糖分岐構造を有する
温度刺激応答性ポリマーであるため、温度刺激応答性の
機能性材料として使用することができる。即ち、本発明
の共重合体は、５℃程度以下では、水溶液として存在す
るが、７℃程度以上になると沈殿する特性を有してい
る。従って、本発明の温度刺激応答性ポリマーは、物質
精製材料、ドラックデリバリーシステム制御材料等とし
て用いることができ、各用途に応じて適宜、通常用いら
れる他の成分を含有させてもよい。

【００４５】本発明の共重合体を用いた蛋白質の精製方
法本発明の共重合体を用いて、蛋白質、例えば、熱に不安
定な蛋白質を精製することができる。具体的には、糖類
に親和性のあるタンパク質、具体的には、アノメリック
水酸基以外の水酸基が糖質間の結合に関与している糖質
（例えば、１，６グリコシド結合を有する非還元末端側
の糖質）に親和性のあるタンパク質や遊離のアノメリッ
ク水酸基に親和性のある蛋白質、例えば、グリコシダー
ゼ（例えば、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、イソア
ミラーゼ等の１，６−グルコシダーゼ）や糖輸送タンパ
ク（例えば、グルコース輸送担体）、レクチン等が本発
明の共重合体に用いて精製できる。

【００４６】具体的には、 i)蛋白質を含む試料と本発明の共重合体を１〜５℃程度
の条件下混合し、 ii)混合物の温度を７〜１５℃程度に上昇させ、沈殿物
と溶液とに分離し、 iii) 得られた沈殿物に、１〜５℃程度の条件下、脱離
剤を加えて蛋白質を解離させる。

【００４７】i)蛋白質を含む試料と本発明の共重合体
を、水溶液に溶解させる。水溶液としては、蛋白質を含
む試料を溶解できるものであれば特に限定されず、例え
ば、酢酸やリン酸等のバッファーが例示できる。

【００４８】蛋白質を含む試料と本発明の共重合体の配
合比については、共重合体中の糖化合物の含有量に依存
するが、例えば、蛋白質１ｇ当たり、共重合体を１０〜
５００ｇ、好ましくは５０〜２００ｇの割合で混合す
る。

【００４９】蛋白質を含む試料と本発明の共重合体を混
合し、共重合体が水中に溶解する温度である１〜５℃程
度の条件下静置させることによって所望の蛋白質を本発
明の共重合体に結合させる。好ましくは、攪拌した方が
よい。

【００５０】ii)次に、共重合体が不溶になる７〜１５
℃程度に水溶液の温度を上げることによって、蛋白質が
結合している共重合体は不溶化させる。不溶化した共重
合体を例えば、遠心分離によって、沈殿物を回収する。

【００５１】iii)得られた沈殿物に、例えば、蒸留水、
緩衝液（例えば、酢酸バッファー（ｐＨ5.5）など）を
添加し、共重合体が溶解できる温度、即ち、１〜５℃程
度に温度を下げ、脱離剤を加えて共重合体から所望の蛋
白質を解離させる。解離剤としては、各種糖化合物、塩
が例示できる。

【００５２】糖化合物としては、単糖類、オリゴ糖類、
多糖類およびその部分加水分解物並びにそれらの誘導体
（例えば、アミノ糖、配糖体、核酸、糖アルコールやウ
ロン酸、アルコルビン酸等）が例示できる。これらの具
体例としては、上記の通りである。好ましくは、グルコ
ース、マルトトリオース、プルラン等が挙げられる。

【００５３】糖化合物の濃度としては、特に限定されな
いが、０．０１〜１０％、好ましくは、０．０５〜６％
程度になるような濃度がよい。

【００５４】塩としては、NaCl、KCl等が例示できる
が、NaClが好ましい。使用する濃度としては、０．１〜
２M、好ましくは、０．５〜１．５M程度である。

【００５５】沈殿物に対するこれら解離剤の量は適宜設
定される。

【００５６】解離は、攪拌する方がよい。

【００５７】また、解離した蛋白質は、上清を集めるこ
とによって得ることができる。また、所望によりＨＰＬ
Ｃ等によって精製してもよい。

【００５８】上記精製方法は、バッチ法によっておこな
うのが好ましい。

【００５９】

【実施例】以下、この発明の実施例を示し、さらに詳し
くこの新規温度刺激応答性高分子とその製造方法及びそ
れを利用したアフィニティ沈殿によるタンパク精製につ
いて説明するが、これらは単なる例示であって、本発明
の制限をなんら限定するものではない。

【００６０】参考例１ 6-O-vinyladipoyl-D-glucoseの
合成グルコース３６ｇ、アジピン酸ジビニル３０５ｇを含む
ＤＭＦ溶液１ｌに、ビオブラーゼ２４０ｇを添加し、３
５℃、１３０rpmにて２週間攪拌した。酵素反応液を濾
過して酵素粉末を除去した後、反応液を減圧濃縮しＤＭ
Ｆを除去した。シリカゲル１００ｇを充填したカラムに
得られた濃縮液を添加し、クロロホルム：メタノール＝
８：１で溶出し、生成物を集めアセトンから標記６−Ｏ
−ビニルアジポイル−Ｄ−グルコースの結晶を得た。無
色粉末結晶４５ｇ（収率６８％）。

【００６１】実施例１:グルコースエステル−アクリロ
イルピペリジン共重合体の合成グルコースエステル−アクリロイルピペリジン共重合体
の合成は、以下のようにして行った。セパラブルフラス
コ内でアクリロイルピペリジン（AP）5 g（３６ミリモ
ル）および6-O-vinyladipoyl-D-glucose（VP） 0.122g
（０．３６ミリモル）をtert-ブタノール 250 mlに溶解
させた後、窒素ガスにより脱気し65℃にインキュベート
した。この溶液にAIBN 75 mg（０．４６ミリモル）を添
加し、65℃で12時間重合させた。この反応の後、ロータ
リーエバポレーターを用いてtert-ブタノールを除いた
後、残渣を蒸留水200 mlに溶解した。生成した高分子は
温度応答を示すので、遠心分離操作(6,000 ×g, 10分,
10℃)により沈殿として回収した。また、この高分子は
先の沈殿を透析チューブ(Seamless Cellulose Tubing,
Size 24, Wako)に入れ蒸留水にて24時間以上透析するこ
とにより精製した。さらに、透析チューブ内の高分子溶
液を凍結乾燥し、得られた高分子化合物（共重合体）を
pAP-VG１（ポリマーＣ）とした。

【００６２】上記と同様に、アクリロイルピペリジンと
6-O-vinyladipoyl-D-glucoseの配合比を代えて共重合体
を得た。

【００６３】得られた各共重合体の特性を以下の表１に
示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】実施例２：トレハロースエステル−アクリ
ロイルピペリジン共重合体の合成トレハロースエステル−アクリロイルピペリジン共重合
体の合成は、アクリロイルピペリジン５g（３６ミリモ
ル）と、参考例１と同様にして合成した6-O-vinyladipo
yl-D-trehalose 0.175g（０．３６ミリモル）を用い
て、実施例１と同様の方法で合成した。

【００６６】実施例３：マンノースエステル−アクリロ
イルピペリジン共重合体の合成マンノースエステル−アクリロイルピペリジン共重合体
の合成は、アクリロイルピペリジン５g（３６ミリモ
ル）と、参考例１と同様にして合成した6-O-vinyladipo
yl-D-mannose 0.122 g（０．３６ミリモル）を用い
て、実施例１と同様の方法で合成した。

【００６７】実施例４:マルトースエステル−アクリロ
イルピペリジン共重合体の合成マルトースエステル−アクリロイルピペリジン共重合体
の合成は、アクリロイルピペリジン5g（３６ミリモル）
と、参考例１と同様にして合成した6-O-vinyladipoyl-D
-maltose 0.175g（0.36ミリモル）を用いて、実施例１
と同様の方法で合成した。

【００６８】実施例２〜４で得られた共重合体の特性を
以下に示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】試験例１温度刺激応答性の評価実施例１で得られたポリマーＡについて、温度刺激応答
性（温度に対する溶解性の応答）の評価を行った。即
ち、分光光度計を用いて470 nmにおける吸光度を測定す
ることにより評価した。使用した高分子溶液の濃度は3.
0 mg/mlである。

【００７１】結果を図１に示す。図中のTransmittance
が1の時、その高分子溶液は完全に透明な液体であるが
0の時は完全に白濁していることを示す。従って、本高
分子を含む水溶液は、4.5℃以下で完全に水に可溶状
態、9.0℃以上で完全に不溶化した。また、この温度応
答は完全に可逆的に応答し、pH 2〜10の範囲でその応答
範囲は変化しないことがわかった。

【００７２】実施例５：蛋白質の精製 i) pullulanase（プルラナーゼ）の粗酵素液（終濃度
0.25mg蛋白質/ml）と実施例１で得られたポリマーＡで
あるpAP-VG（終濃度50mg/ml）を酢酸バッファーpH 5.0
に溶かし、4℃で30分間放置した。

【００７３】ii)次いで、ポリマーが不溶になる10℃で1
2,000rpm、10分間の遠心分離を行い、沈殿物を回収し
た。

【００７４】iii)沈殿物に0.1M酢酸バッファーを１０ml
添加し、これに脱離剤（グルコース）を0.1Mの濃度とな
るように添加し、4℃、30分間放置後、12,000rpm、10分
間遠心分離を行い、上清を回収した。

【００７５】蛋白質量はHPLCにより測定した。精製した
pullulnaseはSDS-PAGEにより確認した。

【００７６】HPLC Pullulanaseの蛋白質量は、HPLCを用いて定量した。具
体的には、Shodex Asahipak GS-320とGS-710を連結させ
た２連のカラムを使用した。また、キャリーとして水を
使用し、1 ml/min 30℃の条件で紫外可視分光光度計検
出器を用い280 nmの波長を測定することにより定量し
た。標準物質として他のクロマトグラフィー法で精製し
たPullulanaseを標準とした。

【００７７】SDS-PAGEの分析条件 SDS-PAGEはLaemmli 法(U. Laemmli, Nature, 227, 680-
685, 1970)により行った。使用した電気泳導ゲルはATTO
製の5-20%グラジェントゲル(NPG-520L )を使用した。ま
た、蛋白質の標準マーカーとしてProtein Molecular We
ight Markers High-Range (Seikagaku Co.)を、また、
染色は、Silver stain II Kit Wako (Wako Co.)を使用
した。結果を図２に示す。レーン１と４はマーカータン
パク、２は未精製pullulanase、３はアフィニティ沈殿
後の酵素を示している。未精製pullulanaseには多くの
不純なタンパクが含まれているが、精製後はpullulanas
e（分子量118,000)のバンドのみが確認された。

【００７８】また、粗酵素溶液と精製した酵素溶液のPu
llulanaseの活性は、基質としてPullulanを用い、酢酸
緩衝液(0.1 N, pH 6.0)30℃の条件下で粗酵素溶液ある
いは精製pullulanase溶液を添加し30 分間酵素反応を行
うことにより測定した。活性はSomogyi-Nelson法により
生成したMaltotrioseを定量し、その酵素活性1 Uは1分
間に1μmolの還元糖を生成する酵素量とした。結果を表
３に示す。

【００７９】

【表３】

【００８０】表３に示したように１回のアフィニティ沈
殿処理により32倍に精製することができた。

【００８１】試験例３種々の脱離剤の検討脱離剤の検討を行った。即ち、pullulanaseが吸着したp
AP-VG（実施例１のポリマーＡ）からの９種類の脱離剤
の効果を示した。具体的には、プルナラーゼが0.25mg/g
の割合で吸着しているポリマー０．５ｇを、以下の濃度
の脱離剤10mlに添加し、４℃、３０分間放置後、遠心分
離し、上清と沈殿を回収した。脱離したプルナラーゼの
量はＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。

【００８２】Tween80やpH2のGlycine-HClバッファーで
は酵素の脱離は起こらなかったが、糖化合物、特に、グ
ルコース、マルトトリオース、プルランを使用した場
合、効率よく酵素が脱離することが分かった。

【００８３】

【表４】

【００８４】試験例４各ポリマーへの蛋白質の吸着量実施例１で得られたポリマーＡ、Ｂに対するpullulanas
eの吸着量（４℃）を測定した。具体的には、各プルナ
ラーゼ濃度溶液に０．５ｇの各ポリマーを添加、混合
し、結果を図３に示す。その結果、グルコース残基の含
有量に応じて吸着量も変化し、ポリマーＡはＢに比べて
約２倍のpullulanaseを吸着した。さらにPolymerＡにつ
いてLangmuir型等温吸着式から吸着係数を求めたところ
5.20×10^-5 M^-1となりPullulanaseはpAP-VGに対して強く
吸着することが分かった。

【００８５】

【発明の効果】本研究ではアノメリック水酸基以外の水
酸基、例えば、糖質の6位に重合性置換基を導入した重
合性糖エステルを用いて温度刺激応答性高分子のモノマ
ーであるアクリロイルピペリジンと共重合することによ
り、糖質の6位を認識する蛋白質をアフィニティ沈殿法
により短時間でしかも少量のバッファーで精製すること
が可能となった。

【００８６】本ポリマーは１〜５℃程度で水溶液中に溶
解しており、７〜１５℃程度で沈殿となることから、低
温で処理する必要のある酵素タンパクの精製には適した
方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１で得られたポリマーＡについ
て、温度刺激応答性（温度に対する溶解性の応答）の評
価を示す。横軸に温度、縦軸に透過率を示す。

【図２】図２は、実施例５における精製前とアフィニテ
ィ沈殿後のSDS-PAGEを示した。レーン１と４はマーカー
タンパク、２は未精製pullulanase、３はアフィニティ
沈殿後の酵素を示す。

【図３】図３は、４℃における実施例１で得られたポリ
マーＡ、Ｂに対するpullulanaseの吸着量を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０８Ｆ 220/54 Ｃ０８Ｆ 220/54 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｊ // Ｇ０１Ｎ 30/48 30/48 Ｒ (71)出願人 598121444 常盤豊茨城県土浦市桜ケ丘町46−12 (71)出願人 501078247 星野一宏富山県富山市五福町3190 (72)発明者星野一宏富山県富山市五福町3190 (72)発明者幸本和明富山県富山市五福町3190 (72)発明者常盤豊茨城県つくば市東１丁目１番３経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所内 (72)発明者北川優滋賀県大津市堅田二丁目１番１号株式会社東洋紡総合研究所内 (72)発明者楽隆生大阪府高槻市中川町５−21 甲南化工株式会社内Ｆターム(参考） 4D017 AA09 BA03 CA13 CB01 CB10 DA01 DB02 4G066 AB12A AB26A AD09B AD11B AD15B AD20B CA54 DA07 EA02 FA07 FA37 GA11 4H045 AA20 EA61 GA26 4J100 AG08P AM19Q BA03P BA15P BC53P CA04 FA03 JA16 JA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（１）【化１】（式中、R₁はメチレン基又はアルキレン基、Sは糖化合
物からアノメリック水酸基以外の１個の水酸基が除かれ
た糖残基を示す）で表される構造単位および下記一般式
（２）【化２】で表される構造単位からなる共重合体。
【請求項２】一般式（１）で表される構造単位を
０．０１〜９９．９９モル％、及び一般式（２）で表さ
れる構造単位を９９．９９〜０．０１モル％含有する請
求項１に記載の共重合体。
【請求項３】一般式（１）中の糖化合物が、単糖
類、オリゴ糖類、多糖類及びその部分加水分解物並びに
それらの誘導体から選択される化合物である、請求項１
又は２に記載の共重合体。
【請求項４】下記一般式（３）の化合物【化３】（式中、R₁はメチレン基又はアルキレン基、Sは糖化合
物からアノメリック水酸基以外の１個の水酸基が除かれ
た糖残基を示す。）で表される重合性糖エステルとアク
リロイルピペリジンを、重合開始剤存在下にラジカル重
合させる、請求項１〜３のいずれかに記載の共重合体の
製造方法。
【請求項５】モノマー総量１００モル％に基づい
て、一般式（３）の化合物０．１〜９９．９モル％、ア
クリロイルピペリジン９９．９〜０．１モル％からなる
モノマー混合物を、重合開始剤存在下にラジカル重合さ
せる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項6】請求項１〜３のいずれかに記載の共重
合体を用いて、蛋白質を精製する方法。
【請求項７】請求項６に記載の精製方法であって、 i)蛋白質を含む試料と請求項１〜３のいずれかに記載の
共重合体を１〜５℃程度の条件下混合し、 ii)混合物の温度を７〜１５℃程度に上昇させ、沈殿物
と溶液とに分離し、 iii)得られた沈殿物に、１〜５℃程度の条件下、脱離剤
を加えて蛋白質を解離させることを含む方法。