JP2005227190A - 化学物質の分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 第1の物質と第2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、(a)第1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(c)温度感受性担体に固定された第1の物質の反応部位に第2の物質を反応させて反応物を得る工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含む方法を用いる。
【選択図】 図4
Description
(b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と反応する反応部位とを有し、第1の物質と第2の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第1の態様は、第1の物質と第2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、(a)第1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(c)温度感受性担体に固定された第1の物質の反応部位に第2の物質を反応させて反応物を得る工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と反応する反応部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第2の態様は、第1の物質と第2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、(a)第1の物質と第2の物質とを反応させて反応物を得る工程、
(b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と反応する反応部位とを有し、第1の物質と第2の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第3の態様は、第1の物質と第2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、(a)第1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(c)温度感受性担体に固定された第1の物質の相互作用部位に第2の物質を相互作用させて複合体を得る工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と相互作用しうる相互作用部位とを有し、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
本発明の第4の態様は、第1の物質と第2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、(a)第1の物質と第2の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、(b)複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、(d)反応系から不純物を除去する工程、(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、を含み、ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と相互作用する相互作用部位とを有し、第1の物質と第2の物質とを相互作用させることにより、複合体にアンカー部位が導入され、温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、方法である。
ビオチン(0.11g)、N,N‘―ジスクシイミジルカーボネート(0.12g)およびトリエチルアミン(0.24g)をDMF15ミリリットルに溶解し、室温にて6時間攪拌した。次に、この溶液に8−アミノ−3,6−ジオキサオクタンアミンコレステリルカーバメート(0.26g)を添加し、反応溶液を16時間攪拌した。溶媒を、ロータリーエバポレータにより減圧、留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、リガンド付きアンカー分子である、{3−[2−(2−{2−[5−(2−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−ペンタノイルアミノ]−エトキシ}−エトキシ)−エトキシ]−エチル}−カルバミックアシッド13−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10−メチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルエステルを収率60%で得た。
水2ミリリットルに、ホスファチジルコリン7.5ミリグラム、リゾホスファチジルコリン5.0ミリグラム、アンカー付きプローブ分子である、{3−[2−(2−{2−[5−(2−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−ペンタノイルアミノ]−エトキシ}−エトキシ)−エトキシ]−エチル}−カルバミックアシッド13−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10−メチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルエステル35.0ミリグラム、ノルマルヘキサデカン30ミリグラムを溶解させ30℃の湯浴中にて二重円筒ミキサー(IKA(登録商標)−WERKE)で20000rpmにて、3分間撹拌した。その後氷浴で10分冷却した(図5参照)。
得られたミセル溶液20マイクロリットルに、6ミリグラム/ミリリットルのアビジン(ImmunoPure(登録商標)Avidin;PIERCE)水溶液を20マイクロリットルを加え1分間ホモミキサー(IKA(登録商標)−WERKE)で撹拌した。その後サンプルを常時冷やしながら緩衝液(トリス塩酸緩衝液+EDTA)を加えて洗浄し、マイクロコンYM−100(Microcon(登録商標)遠心式フィルター、M.W.10万;MILLIPORE)を利用して濃縮を5回繰り返した。反応液を40℃の湯浴中で攪拌しながら、1時間加熱した。その後、遠心分離(チビタン−II卓上遠心機;MILLIPORE)によってミセルを取り除いて下相の水溶液をサンプリングし、以下の条件で電気泳動を行った。
電気泳動槽:XV PANTERA SYSTEM ERICA
電気泳動用ゲル:XV PANTERA GEL
染色液:Bio−SafeTMCoomassie;Commasie(登録商標)G250Stain(BIO−RADTM)
バッファー:0.0625MTrisHCl(pH6.8)、5%2−メルカプトエタノール、0.005%BPB、20%グリセロール、2%SDS
シクロヘキサン1ミリリットル、DMF(ジメチルホルムアミド)9ミリリットルを25℃で混合した溶液に、ODS(オクタデシル基を表面に結合したシリカゲル)2.0グラムを分散させた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分離により上層の主成分となっていたシクロヘキサンはODS表面に保持された。次にこの溶液を0℃に冷却すると、ODS表面のシクロヘキサンは凝固し、表面保持状態で固化した。次に、この分散液を50℃に加温すると、シクロヘキサンは融解するとともに、DMFと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが可能であった。
DMFを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応(相互作用)・固相表面捕捉システムを50℃に加温した後、2−アミノ−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシロキシ−ベンジルエステル 0.1ミリモルを溶解した。ここにFmoc−Gly−OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCD) 0.5ミリモルを含むDMF溶液20ミリリットルを添加し90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら0℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりDMF溶液を除去し、固形物(シクロヘキサン・ODS)を5℃以下に冷却したDMF20ミリリットルで3回洗浄した。次に、固形物(シクロヘキサン・ODS)を40℃に加温、真空ポンプを用いてシクロヘキサンを減圧留去した。最後にODSをアセトニトリルを用いて洗浄した。アセトニトリル溶液から、2−[2−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−アセチルアミノ]−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシルオキシベンジルエステルを収率97%で得た。
1H−NMR(400MHz)d:7.77(2H,d,J=7.3Hz),7.59(2H,d,J=7.3Hz),7.40(2H,t,J=7.3Hz),7.31(2H,dt,J=0.7,7.3Hz),6.52(2H,s),6.38(1H,d,J=8.4Hz),5.44−5.37(1H,br),5.10(1H,d,J=12.1Hz),5.02(1H,d,J=12.1Hz),4.62(2H,dd,J=8.4,4.8Hz),4.42(2H,d,J=7.0Hz),4.24(1H,t,J=7.0Hz),3.96−3.92(8H,m),2.21−2.16(1H,m),1.81−1.76(4H,m),1.75−1.70(2H,m),1.48−1.43(6H,m),1.37−1.21(84H,br),0.91(3H,d,J=7.0Hz),0.88(9H,t,J=7.0Hz),0.86(3H,d,J=7.0Hz);13C−NMR(150MHz)d:171.5,168.7,156.5,153.1,143.6,141.2,138.3,130.0,127.7,127.0,125.0,120.0,107.0,73.4,69.2,67.5,67.4,57.1,47.1,32.0,31.4,30.4,29.8,29.7,29.5,29.4,26.1,22.8,19.0,17.7,14.2;MALDITOF−MS(pos)calcd for C83H138N2O8 [M+Na]+ 1314, found 1314.
シクロヘキサン1ミリリットル、NMP(N−メチル−2−ピロリドン) 7ミリリットルを20℃で混合した溶液に、ODS(オクタデシル基を表面に結合したシリカゲル) 2.0グラムを分散させた。同温度でボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、二相に分離により上層の主成分となっていたシクロヘキサンはODS表面に保持された。次にこの溶液を−10℃に冷却すると、ODS表面のシクロヘキサンは凝固し、表面保持状態で固化した。次に、この分散液を20℃に加温すると、シクロヘキサンは融解するとともに、NMPと均一に溶解した。この現象は、温度変化によって可逆的に繰り返すことが可能であった。
NMPを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応(相互作用)・固相表面捕捉システムを20℃に加温した後、2−アミノ−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル 0.1ミリモルを溶解した。ここにFmoc−Gly−OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCD) 0.5ミリモルを含むNMP溶液10ミリリットルを添加し90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−10℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりNMP溶液を除去し、固形物(シクロヘキサン・ODS)を5℃以下に冷却したNMP20ミリリットルで3回洗浄した。次に、固形物(シクロヘキサン・ODS)を20℃に加温、真空ポンプを用いてシクロヘキサンを減圧留去した。最後にODSをアセトニトリルを用いて洗浄した。アセトニトリル溶液から、2−[2−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−アセチルアミノ]−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシルオキシ−ベンジルエステルを収率99%で得た(図6参照)。
DMFを用いて作成した上記温度感受性均一溶液反応(相互作用)・固相表面捕捉システムを50℃に加温した後、2−アミノ−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシロキシ−ベンジルエステル 0.1ミリモルを溶解した。ここにFmoc−Gly−OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCD)0.5ミリモルを含むDMF溶液20ミリリットルを添加し90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら0℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりDMF溶液を除去し、固形物(シクロヘキサン・ODS)をDMF20ミリリットルで3回洗浄した。次に、固形物(シクロヘキサン・ODS)を20℃に加温した後、10%DBU/DMF溶液を10ミリリットル添加した。同温度にて2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を0℃に冷却する。冷却固化が完了した後、再びろ過、DMFによる洗浄をおこなった。DBU処理操作によりN末端アミノ基に結合したFmoc基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
1H−NMR(600MHz)d: 7.74(1Hd,J=9.2Hz),6.53(2H,s),5.11(1H,d,J=12.1Hz),5.02(1H,d,J=12.1Hz),4.61(1H,dd,J=9.2,5.1Hz),3.95(4H,t,J=6.6Hz),3.94(2H,t,J=6.6Hz),3.39(2H,s),2.24−2.18(1H,m),1.81−1.76(4H,m),1.75−1.71(2H,m),1.49−1.44(6H,m),1.37−1.20(84H,br),0.93(3H,d,J=7.0Hz),0.90−0.86(12H,m);13C−NMR(150MHz)d:172.6,171.8,153.1,130.3,125.5,106.9,73.4,69.2,67.2,56.6,44.8,32.0,31.3,30.4,30.3,29.8,29.7,29.5,29.4,26.2,22.8,19.1,17.8,14.2;MALDI TOF−MS(pos) calcd for C68H128N2O6 [M+Na]+ 1091, found 1091.
NMPを用いて作成した該温度感受性均一溶液反応(相互作用)・固相表面捕捉システムを20℃に加温した後、2−アミノ−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル 0.1ミリモルを溶解した。ここにFmoc−Gly−OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCD)0.5ミリモルを含むNMP溶液10ミリリットルを添加し90分間攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−10℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりDMF溶液を除去し、固形物(シクロヘキサン・ODS)を5℃以下に冷却したNMP20ミリリットルで3回洗浄した。次に、固形物(シクロヘキサン・ODS)を20℃に加温した後、10%DBU/NMP溶液を10ミリリットル添加した。同温度にて2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を−10℃に冷却する。冷却固化が完了した後、再びろ過、NMPによる洗浄をおこなった。DBU処理操作によりN末端アミノ基に結合したFmoc基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
2−アミノ−3−メチル−ブチリックアシッド3,4,5−トリス−オクタデシロキシベンジルエステル 0.1ミリモル、エイコサン100ミリグラムをDMF9ミリリットル、シクロヘキサン1ミリリットル溶解した。ここにFmoc−Gly−OBt 0.3ミリモル、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCD)0.5ミリモルを含むDMF溶液5ミリリットルを添加し90分間25℃にて攪拌した。次に本反応システムを攪拌しながら−10℃まで冷却した。このとき、白色固形粒子が析出した。吸引ろ過法によりDMF溶液を除去し、固形物(シクロヘキサン・エイコサン)を0℃以下に冷却したDMF20ミリリットルで3回洗浄した。次に、固形物(シクロヘキサン・エイコサン)を20℃に加温した後、10%DBU/DMF溶液を10ミリリットル添加した。同温度にて2分間攪拌した後、攪拌しながら反応液を−10℃に冷却した。冷却固化が完了した後、再びろ過、0℃以下に冷却したDMFによる洗浄をおこなった。DBU処理操作によりN末端アミノ基に結合したFmoc基ははずれ、アミノ基に変換された。同操作を繰り返すことにより、ペプチド結合を逐次形成することができた。
50℃においてアニリン0.05ミリモルが溶解したDMF溶液10ミリリットルに、3,4,5−トリス−オクタデシロキシベズアルデヒド 0.1ミリモルおよびシクロヘキサン3ミリリットルを溶解した。16時間攪拌し、ODS2.0グラムを添加後、攪拌しながら−10℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりDMF溶液と固形物(シクロヘキサン・ODS)を分離した。固形部分は冷却時に0℃以下に冷却した10ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に98%の反応収率で捕捉された。
50℃においてアニリン0.05ミリモルが溶解したNMP溶液10ミリリットルに、3,4,5−トリス−オクタデシロキシベズアルデヒド 0.1ミリモルおよびシクロヘキサン3ミリリットルを溶解した。16時間攪拌し、攪拌しながら−10℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりNMP溶液と固形物(シクロヘキサン)を分離した。固形部分は冷却時にNMP10ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に96%の反応収率で捕捉された。
50℃においてアニリン0.05ミリモルが溶解したDMF溶液10ミリリットルに、3,4,5−トリス−オクタデシロキシベズアルデヒド 0.1ミリモル、シクロヘキサン3ミリリットル、エイコサン500ミリグラムを溶解した。16時間攪拌し、攪拌しながら0℃まで冷却した。冷却後、吸引ろ過法によりDMF溶液と固形物(シクロヘキサンおよびエイコサンの混合物)を分離した。固形部分は冷却時にDMF10ミリリットルを用いて洗浄した。本操作によりアニリンはアルデヒドと反応し、固形物中に98%の反応収率で捕捉された。
<温度感受性固相担体の調製>
水2ミリリットルに、アンカー付プローブ分子である、{3−[2−(2−{2−[5−(2−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−ペンタノイルアミノ]−エトキシ}−エトキシ)−エトキシ]−エチル}−カルバミックアシッド13−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10−メチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルエステル35.0ミリグラム、ノルマルヘキサデカン300ミリグラムを溶解させ、30℃の湯浴中にて二重円筒ミキサー(IKA(登録商標)−WERKE)で20000rpmにて、3分間撹拌した。そのまま攪拌をしながら、容器を0℃まで急冷した。これにより、アンカー付プローブ分子のプローブ部分を水相に配向した形で、温度感受性担体を水中に分散、固定化した。
Claims (4)
- 第1の物質と第2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
(a)第1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(c)温度感受性担体に固定された第1の物質の反応部位に第2の物質を反応させて反応物を得る工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
を含み、
ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と反応する反応部位とを有し、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
方法。 - 第1の物質と第2の物質との反応によって生成した反応物を分離する方法であって、
(a)第1の物質と第2の物質とを反応させて反応物を得る工程、
(b)反応物と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、反応物のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
を含み、
ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と反応する反応部位とを有し、第1の物質と第2の物質とを反応させることにより、反応物にアンカー部位が導入され、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
方法。 - 第1の物質と第2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、
(a)第1の物質と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(b)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、第1の物質のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(c)温度感受性担体に固定された第1の物質の相互作用部位に第2の物質を相互作用させて複合体を得る工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
を含み、
ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と相互作用しうる相互作用部位とを有し、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
方法。 - 第1の物質と第2の物質との相互作用によって生成した複合体を分離する方法であって、
(a)第1の物質と第2の物質とを相互作用させて複合体を得る工程、
(b)複合体と液相状態の温度感受性担体とを混合する工程、
(c)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を固相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体に固定させる工程、
(d)反応系から不純物を除去する工程、
(e)反応系の温度を変化させることにより温度感受性担体を液相状態に変化させて、複合体のアンカー部位を温度感受性担体から放出させる工程、
を含み、
ここで、第1の物質は、温度感受性担体に固定されうるアンカー部位と、第2の物質と相互作用する相互作用部位とを有し、第1の物質と第2の物質とを相互作用させることにより、複合体にアンカー部位が導入され、
温度感受性担体は、温度を変化させることにより、固相状態から液相状態に可逆的に変化し、固相状態でアンカー部位を固定し、液相状態でアンカー部位を固定しない、
方法。
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