TWI854284B - 用於液相合成之化合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明包含式1之親水性連接子化合物：
Description
本發明係關於用於液相合成之化合物及方法。
多肽及胺基酸序列之化學合成係藉由迭代製程實現，其中胺基酸依序彼此偶聯。該製程涉及對生長肽鏈之C末端或N末端進行去保護、將經保護之胺基酸與其偶聯且接著對新偶聯之胺基酸進行去保護的重複製程，其為序列中之下一次偶聯做好準備。多次重複進行胺基酸偶聯及去保護步驟之此迭代製程放大在化學合成中之主要挑戰，亦即自其他反應組分(溶劑、未反應之起始材料及試劑以及非所需反應副產物)分離所需合成產物。
固相肽合成(「SPPS」)為最常用於合成多肽及胺基酸序列之方法及系統。SPPS涉及將活化胺基酸偶聯至固體載體。此固體載體通常為官能化聚合物樹脂珠粒(諸如帶有NH
2基團)。使下一胺基酸(其NH
2末端通常經由Fmoc、BOC或其他保護基保護)與樹脂反應，使得樹脂上之官能化基團與末端胺基酸之活化COOH基團反應且結合至該活化COOH基團。以此方式，末端胺基酸共價連接至樹脂。
接著，在下一步驟中，對末端胺基酸之NH
2末端去保護，從而曝露其NH
2基團以用於下一反應。因此，引入一種新胺基酸。此新胺基酸之NH
2末端經由保護基(諸如Fmoc、BOC或另一保護基)保護。因此，當添加此新胺基酸時，來自新胺基酸之活化酯與末端胺基酸之新去保護之NH
2基團反應，從而將此兩個胺基酸偶聯在一起。一旦此新胺基酸被偶聯，其同樣具有受保護之NH
2基團，該基團可隨後去保護且與下一胺基酸反應。藉由多次進行此重複性迭代製程，可構築整個胺基酸序列。一旦構築完整序列，該序列可自樹脂解偶聯(裂解)且去保護，從而產生胺基酸序列。應注意，經由此製程添加之各種胺基酸(R
1、R
2等)的側鏈可經由諸如BOC、三級丁基或三苯甲基等基團正交保護，以防止此類側鏈在胺基酸合成製程期間發生反應。熟習此項技術者將瞭解可如何在合成製程期間構築、保護及隨後去保護此類側鏈或其他基團。
在SPPS製程之各步驟中，生長多肽保持連接至固體載體，其藉由相分離保持與其他反應組分分離。固體載體藉由使得在連接至固體載體時能夠藉由過濾分離所需產物來促進分離。SPPS在商業上使用且仍為肽合成之標準。然而，其缺點在於昂貴、費時且由於需要大量樹脂洗滌而產生大量製程廢物。添加之各胺基酸均必須去保護且偶聯，其係困難的且通常導致使用大量溶劑。在各反應之後通常需要多次溶劑洗滌以自樹脂移除殘餘試劑。製造設施中之循環時間可為每天大約一個胺基酸偶聯及去保護循環。更糟糕的是，此等溶劑中之許多對環境不友好。此外，SPPS中之相分離在獲得高產物純度方面存在困難。因為生長多肽與其他反應組分不在同一相中，所以反應動力學比在液相中更慢，且在最大限度地轉化為所需產物的同時使諸如聚集之非所需副反應降至最低可具有挑戰性。非均相反應混合物之反應監測及最佳化可為困難的，尤其在使用需要分析物溶解於均相液流中之分析方法，諸如高效液相層析(「HPLC」)時。
相比於SPPS，液相肽合成(「LPPS」)係指在均相反應條件下製備多肽之方法。此可包括涉及可溶性聚合物載體部分之合成方法，在該等聚合物載體部分上可以與SPPS中所用類似之迭代去保護及偶聯製程製備多肽。藉由允許在均相溶液相中發生去保護及偶聯反應，LPPS可克服SPPS中涉及之一些困難。一般而言，LPPS可在材料方面比SPPS更高效，因為其需要較少溶劑、起始材料及試劑。此外，相比於在相界處發生之反應，液相反應動力學可更快。此可促進反應最佳化工作，例如允許去保護步驟在更短時間內或在更溫和反應條件下發生，以使生長多肽中胺基酸殘基之外消旋作用降至最低。LPPS亦允許直接進行反應監測，例如藉由HPLC結合質譜(「LCMS」)，其中與類似SPPS製程相比，連接至可溶性聚合物載體之產物可更簡單地偵測及定量。
儘管LPPS相比於SPPS具有優勢，但成功實施LPPS策略可具有挑戰性。分離所需產物及將其與其他反應組分及非所需副產物有效分離仍存在問題。為此，已使用多種策略以使得多肽產物能夠自液相反應混合物分離。已開發出作為標籤輔助LPPS載體之疏水性可溶性連接子系統(參見例如Takahashi, D.等人; (2017)
Angewandte Chemie International Edition129:7911-7915及美國專利申請公開案第US 2018/0215782號)。使用此等連接子系統，肽可在連接子上延長，且接著藉由沈澱或藉由萃取水處理移除副產物。然而，已發現存在一些關鍵限制，諸如肽之長度，其中隨著肽鏈延長，溶解度問題成為主要問題。另外，可能存在純度挑戰，因為水洗在移除試劑及副產物方面的功效有限。此等組分可干擾下游合成步驟且導致不利的添加及缺失。此外，有機層中之高殘餘水可對肽偶聯具有負面影響，其可能需要添加脫水步驟。
相對於疏水性連接子系統，親水性連接子系統可提供關鍵優勢。在此等系統中，連接子具有親水性「標籤」，其能夠藉由使用更環境友好的有機溶劑進行簡單萃取來移除反應副產物。已報導聚乙二醇(PEG)為用於液相肽合成之親水性載體(參見例如Fischer, P.M.; Zheleva, D.I. (2002)
Journal of Peptide Science8:529-542)。然而，此等應用中所用之PEG衍生物通常為多分散的且缺乏固定分子量。可變PEG鏈長可在高分子量PEG共軛產物之分析及純化中產生複雜化。因此，為LPPS尋找具有固定分子量之新穎親水性連接子系統將為一種改良，其將解決此等缺陷，尤其在肽之商業製造中。若此類系統可使液相肽合成方法能夠用於長肽(15聚體及以上)，則將為進一步改良。實際上，本發明實施例將特定提供用於標籤輔助LPPS之親水性連接子系統及其用於商業規模之肽合成的方法。本文描述此類方法及系統。
本發明實施例提供固定分子量之化合物，其可用作用於液相有機合成，諸如LPPS之親水性連接子構築體。本發明化合物具有連接至連接子之重複異雙官能PEG樣單元，在其上可經由偶聯(例如胺基酸偶聯)及去保護步驟建構多肽或其他分子。特定言之，本發明之化合物可用於經由重複合成步驟，例如胺基酸偶聯及去保護步驟建構多肽或其他分子。
本發明之一實施例包含式1之親水性連接子化合物：
其中「m」為0至20，「n」為1至50，且「Z」為連接子基團。「Z」為官能基，其可與視情況經保護之化合物，諸如胺基酸形成共價鍵，該胺基酸轉而可在一或多種視情況經保護之化合物，諸如胺基酸或肽上經歷迭代去保護及偶聯步驟，且接著，諸如多肽產物之所得產物能夠經由化學轉化自「Z」基團釋放。
本發明之另一實施例包含式1化合物，其中「m」為0、1、2或3且「n」為1至50。本發明之另一實施例包含式1化合物，其中「m」為0、1、2或3且「n」為1至10。本發明之另一實施例包含式1化合物，其中「m」為1且「n」為2至10。
本發明之另一實施例包含式1化合物，其中「Z」係選自：
；且「m」及「n」如上文所定義。
本發明之親水性連接子可用於肽及其他化合物之合成，其中諸如胺基酸或肽片段之化合物之活化酯首先偶聯至式1之連接子的游離醇-OH或胺-NH
2。其後，例如肽之化合物藉由在中間去保護後連續偶聯諸如胺基酸或肽片段之個別分子組分的活化酯來生長。例如肽之成品化合物在酸性條件下自連接子裂解。
本專利申請案根據35 U.S.C. §119(e)主張2021年8月23日申請之美國臨時申請案第63/260,496號之權益，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
本申請案係與ST.26 XML格式之序列表一起提交。該序列表以2022年8月22日創建之名為「X22492 Sequence Listing」之檔案形式提供且大小為92千位元組。ST.26 XML格式之序列表資訊以全文引用之方式併入本文中。
本發明實施例提供親水性連接子化合物，其用於具有固定分子量之液相合成系統，諸如LPPS系統。當用於LPPS時，所揭示化合物能夠實現長肽(15聚體及以上)之液相肽合成方法。實際上，本發明實施例將特定提供用於諸如LPPS之液相合成之親水性連接子系統及其用於商業規模之分子或肽合成的方法。
如上文所指出，本發明親水性連接子化合物可為上文所概述之式1化合物。特定較佳實例包括：
式1a化合物：
，
式1b化合物：
，
式1c化合物：
，
式1d化合物：
，
式1e化合物：
，
式1f化合物：
，
式1g化合物：
，
式1h化合物：
，
式1i化合物：
，
式1j化合物：
，
式1k化合物：
，
式1l化合物：
，
式1m化合物：
，
式1n化合物：
，
及式1o化合物：
。
使用本文所述之親水性連接子化合物之液相合成可用於組裝經由醯胺鍵，亦即經由一個分子上之羰基與另一分子之胺基的縮合連接之化合物。肽合成為本文所述之親水性連接子分子及方法之明確用途，因為肽鍵由一個胺基酸之羧基與另一胺基酸之胺基的縮合反應產生。因此，含有醯胺鍵之化合物可經由偶聯及去保護反應的迭代組裝，以組裝分子，該分子在完成後必須自合成期間所用之載體釋放。特定言之，具有藉由有可用羧酸基之Fmoc基團保護的胺基之分子可偶聯至如本文所述之親水性連接子分子上。接著可藉由移除Fmoc基團使所得分子去保護，且所得分子之未保護胺基可與具有可用胺基之另一分子上的可用羧酸基偶聯。實例21-24顯示使用本文所述之親水性連接子分子之非肽分子的液相合成。
藉由SPPS及LPPS兩者之肽製備經由偶聯及去保護反應的迭代進行，以延長肽，該肽在完成後必須自合成期間所用之載體釋放。另外，合成中所用之胺基酸或肽片段起始材料通常具有側鏈保護基，其有助於確保偶聯步驟期間之選擇性。側鏈保護基經選擇以使其在肽延長製程中之去保護步驟期間使用之條件下穩定。例如，FMOC基團可用於保護胺基酸起始材料中之胺基且易於用二級胺鹼移除。相比之下，BOC及三苯甲基(triphenylmethyl/trityl)保護基在通常用於在肽延長期間移除FMOC基團之鹼性條件下穩定，且在完成後可用強有機酸移除。一些肽合成連接子可在用於胺基酸側鏈去保護之相同條件下裂解。此稱為「硬」裂解方法，完成肽延長後，該肽同時去保護及自樹脂裂解。複雜的合成策略可藉由謹慎選擇在與側鏈去保護之條件正交的條件下允許裂解發生的連接子化學方法來實現。此稱為「軟」裂解方法，肽自樹脂裂解，一些或所有側鏈保護基仍然完整。
本發明之親水性連接子可用於利用「硬」及「軟」裂解方法之合成製程中 使用「軟」裂解合成策略可例如使合成之肽能夠用作基於混合片段合成更複雜肽中的起始材料。另外，混合SPPS/LPPS製程可作為使用本文所述之親水性連接子之收斂肽合成策略的一部分實施。肽片段可使用SPPS建構、自其固體載體裂解、分離且視情況純化，且接著藉由使用LPPS將其偶聯至與親水性連接子連接之肽上來組裝。相比於完全SPPS之製程，此收斂混合SPPS/LPPS策略在擴大規模時可更實用且更高效。
基於片段之收斂肽合成策略亦可藉由使用本文所述之親水性連接子之LPPS實施。在此情況下，肽片段係使用LPPS建構、自親水性連接子載體裂解、分離且視情況純化，且接著藉由使用LPPS將其偶聯至與親水性連接子連接之肽上來組裝。
本發明之親水性連接子化合物亦可用作促進膜增強肽合成(MEPS)之連接子系統的一部分。圍繞MEPS建構之合成策略採用生長肽自其他反應組分之基於膜的分離(或透濾)。LPPS策略中MEPS之實務實施係藉由使用允許此分離在執行反應之相同有機溶劑中進行的系統來促進，例如使用有機溶劑奈米過濾(OSN)。此類基於膜之分離技術藉由生長肽與其他反應組分之間的大小差異達成分離。為此，「nanostar」樞紐結構可用作增加生長肽之分子大小的LPPS載體，但其本身緊湊且易於合成(參見例如Yeo, J.等人; (2021)
Angewandte Chemie International Edition60:7786-7795)。芳族樞紐結構可充當肽合成連接子可連接之中心連接點。此等樞紐結構亦可充當適用於例如藉由UHPLC-MS (超高效液相層析-質譜分析)進行反應監測之額外UV發色團。Nanostar樞紐增加生長合成肽與其他反應組分之間之質量差，從而提高透濾效率。
本發明之親水性連接子化合物可用作基於MEPS之策略的一部分。特定言之，本發明之親水性連接子化合物可經連接以形成nanostar樞紐。流程1顯示先前所揭示之nanostar結構之合成，該等結構具有將Rink型或Wang型連接子連接至中心苯環之聚乙二醇鏈(Yeo, 2021)。
流程1.
類似於流程1中之nanostar結構2，本文所述之式1之化合物亦可連接至nanostar樞紐，以得到例如式2化合物：
其中「Z」為
；
「m」為0、1、2或3；「n」為1至10；且「p」為2或3。特定言之，可製備式2之nanostar化合物，其中「Z」為
；
「m」為1；「n」為2、4、6、8或10；且「p」為2或3。
本發明亦涵蓋「分支鏈」親水性連接子化合物，其中該連接子具有兩個或更多個與肽連接基團連接之親水性官能基。分支鏈親水性連接子系統可包含式3化合物：
其中「Z」代表可與視情況經保護之胺基酸形成共價鍵之官能基，該胺基酸轉而可在一或多個視情況經保護之胺基酸或肽上經歷迭代去保護及偶聯步驟，且接著，所得多肽產物能夠經由化學轉化自「Z」基團釋放；「m」為0、1、2或3；「n」為1至10；且「p」為2或3。特定言之，可製備式3a、3b及3c之分支鏈化合物：
其中「k」為1，「m」為1，「q」為1；且「l」、「n」及「t」各獨立地為2、4、6、8或10。
近年來已在實現流動化學製程之大規模實施之技術中取得顯著進展。在流動化學中，試劑及反應物共同泵送至持續流動之混合物中，通常經由管或管道。相比於傳統分批製程，可藉由在化學製造製程中實施流動化學策略來實現顯著優勢。流動化學策略有助於控制諸如壓力、溫度及反應時間之反應參數。例如藉由使反應混合物穿過管，使混合物曝露於管之高表面積，其增加進出反應之熱通量，從而實現快速加熱或冷卻。流動反應器可經加壓，允許在大氣壓下加熱之高於沸點且提高反應速率。由於混合及熱傳遞速率，傳統分批製程可在擴大規模時變得複雜，而流動化學製程可更易於維持對此等參數之高度控制。另外，藉由在流動流中進行反應，在製程過程期間的任何時間僅產生少量高能中間物，從而降低與其相關之安全風險。
已將流動化學原理應用於SPPS及諸如LPPS之液相合成系統兩者。在SPPS中，已在大規模及小規模兩者上研究填充床流動系統，且此類系統高度適合自動化。在LPPS中，固定試劑及微反應器已用於小規模製造肽片段(參見例如Baxendale, I.R.等人; (2006)
Chemical Communications4835-4837；及Fuse, S.等人; (2014)
Angewandte Chemie International Edition53:851-855)，且連續攪拌槽反應器(CSTR)技術已應用於二肽及三肽產品之大規模製備(參見例如Jolley, K.E.等人; (2017)
Organic Process Research and Development21:1557-1565)。
本發明之親水性連接子化合物特別適用於實現諸如LPPS之流動化學液相製程。在溶液中偶聯至親水性連接子之生長分子，例如肽上之偶聯及去保護反應之快速反應動力學係流動化學製程實施之有利特徵。在溶液相流動化學中仍存在將所需反應產物與非所需副產物及未反應之起始材料分離的問題。使用本文所揭示之親水性連接子化合物製備諸如肽之分子發生在溶液中，然而，所需產物之分離發生在相分離時，從而允許使用連續液-液分離(例如使用混合沈降器或連續流離心機)。
大量毒性溶劑，諸如二甲基甲醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮、二甲基乙醯胺及二氯甲烷用於習知固相肽合成中，例如在洗滌、偶聯及去保護步驟中，此對工業衛生及環境保護提出挑戰。出於此原因，對開發用於肽合成之更環境友好(亦即，「更綠色」)的替代溶劑非常感興趣。本文所述之方法可利用此類更綠色溶劑。更綠色洗滌溶劑之實例包括乙酸乙酯、乙酸異丙酯、MTBE (甲基三級丁基醚)及CPME (環戊基甲基醚)。本文所述之偶聯反應亦可在諸如DMSO之更綠色溶劑中進行。
如本文所用，術語「胺基酸」係指包含羧酸(-CO
2H)及胺(-NH
2)官能基之有機化合物。胺基酸可為蛋白型(亦即，在轉譯期間以生物合成方式併入蛋白質中)，諸如甘胺酸、L-丙胺酸及L-苯丙胺酸；或非蛋白型，諸如3-胺基異丁酸及8-胺基-3,6-二氧雜辛酸。
如本文所用，術語「親水性連接子」係指化學部分，諸如多肽之分子可在其上經由偶聯(例如胺基酸偶聯)及去保護步驟進行建構，且其具有一或多個對水具有高親和力之官能基。
如本文所用，術語「流動化學」係指在連續流動的流中進行化學反應。
如本文所用，術語「nanostar」係指用以合成生物聚合物(例如多肽)之連接子構築概念，其中核心有機化學結構充當兩個或更多個連接子之中心連接點(或「樞紐」，生物聚合鏈可在該兩個或更多個連接子上建構。已描述用於構築多肽之Nanostar結構(參見例如Yeo, J.等人; (2021)
Angewandte Chemie International Edition60:7786-7795)。
如本文所用，術語「肽」或「多肽」係指胺基酸之聚合鏈。此等胺基酸可為天然或合成胺基酸，包括經修飾之胺基酸。如本文所用，術語「多肽」及「肽」可互換使用。
本文所使用之某些縮寫定義如下：「AEEA」係指2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙醯基；「Aib」係指2-胺基異丁酸；「Boc」係指三級丁氧基羰基；「CAD」係指電霧式偵測器；「DCM」係指二氯甲烷；「DEPBT」係指3-(二乙氧基磷醯氧基)-1,2,3-苯并三𠯤-4(3H)-酮；「DIC」係指二異丙基碳化二亞胺；「DIEA」係指二異丙基乙胺；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DVB」係指二乙烯苯；「EDC」係指1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺；「ESMS」係指電噴物質譜；「Fmoc」係指茀基甲氧基羰基；「Fmoc-Suberol」係指5-Fmoc-胺基-2-羧基甲氧基-10,11-二氫-5H-二苯并[a,d]環庚烯；「HMPA」係指4-(羥基甲基)苯氧基乙酸；「HMPB」係指4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸；「LCMS」係指液相層析-質譜；「LPPS」係指液相肽合成；「MTBE」係指甲基三級丁基醚；「oxyma」係指乙基氰基羥亞胺基乙酸酯；「PEG」係指聚乙二醇；「PyBop」係指(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻六氟磷酸鹽；「PyOxim」係指[(E)-(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基伸乙基)胺基]氧基-三吡咯啶-1-基鏻;六氟磷酸鹽；「SPPS」係指固相肽合成；「
tBu」係指三級丁基；「TFA」係指三氟乙酸；「Trt」係指三苯甲基；且「UPLC」係指超高效液相層析。
流程2.
流程2顯示親水性連接子化合物
8之製備，其中「
X」表示帶有化學不穩定之-OH或-NH
2之官能基，其可(分別)與視情況經保護之胺基酸形成酯或醯胺鍵，該胺基酸轉而可在一或多種視情況經保護之胺基酸或肽上經歷迭代去保護及偶聯步驟，且接著，所得多肽產物能夠經由化學轉化自「
X」基團釋放。
在流程1中藉由使用Fmoc保護基策略之固相合成製備化合物
8。此合成可部分或全部在自動肽合成儀上進行。在步驟1中，Fmoc-Sieber醯胺樹脂(
1)用哌啶去保護，且接著在步驟2中使用醯胺偶聯條件(例如Oxyma及DIC)與Fmoc保護之中間物
2偶聯，得到中間物
3。步驟3 (使用哌啶去保護)及步驟4 (使用例如PyOxim及有機鹼之醯胺偶聯條件與Fmoc保護之中間物
2進行醯胺偶聯)之迭代循環得到中間物
4，循環重複「n」減去一次以獲得偶聯在一起的「n」個單體單元。在步驟5中，中間物
4用哌啶去保護，且接著在步驟6中與中間物
5或
6進行醯胺偶聯(例如用PyOxim及有機鹼)，得到中間物
7。若中間物
7帶有Fmoc保護之氮，則其在步驟7中使用哌啶去保護。最終，親水性連接子化合物
8在酸性條件(例如使用TFA)下自Sieber樹脂裂解。
流程3.
流程3顯示使用帶有氮之親水性連接子化合物
9延長胺基酸聚合鏈，該胺基酸聚合鏈可在該氮上建構，且接著在酸性條件下自連接子裂解。在步驟1中，Fmoc保護之胺基酸
10在諸如DMF或DMSO之極性非質子有機溶劑中，使用醯胺偶聯條件(例如PyOxim及有機鹼)與親水性連接子化合物
9偶聯，得到第一偶聯中間物
11。反應完成時，添加諸如MTBE之極性較小的非質子溶劑，使得偶聯中間物
11自反應混合物沈澱。自主體反應混合物分離沈澱物(例如藉由離心及傾析上清液)且視情況藉由用沈澱物不溶於其中之溶劑(例如MTBE)再次處理來洗滌，接著分離沈澱物(例如藉由離心及傾析上清液)。以此方式，中間物
11自反應混合物分離且與大部分反應溶劑、未反應之起始材料及反應廢產物分離。在步驟2中，中間物
11使用哌啶去保護，且進行沈澱/產物分離/視情況選用之洗滌程序，接著在步驟3中，使用醯胺偶聯條件(例如PyOxim及有機鹼)偶聯下一經保護之胺基酸(
12)，接著進行沈澱/產物分離/視情況選用之洗滌程序，得到中間物
13。此時，中間物
13可繼續進行其他化學轉化(例如如流程6中所概述)。若末端氮保護基為-Fmoc且欲繼續進行聚合鏈延長，則使用經保護之胺基酸(例如
14)依序迭代地重複步驟2及3，得到中間物
15。
流程4.
流程4顯示使用帶有氧之親水性連接子化合物
16延長胺基酸聚合鏈，該胺基酸聚合鏈可在該氧上進行建構，且接著在酸性條件下自連接子裂解。此製程之步驟類似於流程3中概述之步驟，不同之處在於步驟1為酯化步驟(使用例如PyBop/有機鹼或DIC/DMAP之試劑進行)。如流程3中所概述的用經保護之胺基酸進行之迭代去保護及偶聯步驟(分別為步驟2及3)得到聚合化合物
17。
流程5.
流程5展示三種用於自藉由氧連接之連接子裂解經延長胺基酸聚合物的路徑。當自此等連接子裂解時，該胺基酸聚合物在其C末端處具有游離羧酸(-CO
2H)。
在第一路徑中，在步驟1b中，化合物
17在酸性條件(例如含2-5% TFA之DCM)下經歷「軟」裂解，自胺基酸聚合物水解連接子，在C末端處得到羧酸基且使N末端保護基(及其他可存在於R
1、R
2、R
3等中之保護基)在化合物
18中保持完整。用諸如吡啶之鹼中和，接著進行水處理，將大部分親水性連接子與
18分離。在N末端之保護基完整的情況下，
18可接著與另一胺偶聯，例如作為基於片段之肽合成策略的一部分。
在第二路徑中，在步驟1a中，在適合條件(在-Fmoc保護之情況下，使用哌啶)下移除N末端保護基以得到
19。在步驟2b中，胺基酸聚合物可在使可存在於R
1、R
2、R
3等中之保護基保持完整之條件(例如使用含2-5% TFA之DCM)下自連接子水解以得到
20，或可使用例如TFA、三異丙基矽烷、1,2-乙二硫醇及水之混合物(85:5:5:5 v/v比率)在「硬」裂解條件下達成酸不穩定保護基之整體去保護。
在第三路徑中，中間物
19在步驟2a中在醯胺偶聯條件(例如DEPBT及有機鹼或
21可使用有機鹼以丁二醯亞胺酯形式反應)下與羧酸
21偶聯以得到
22。在步驟3中，化合物
23使用上文概述之「硬」或「軟」裂解自親水性連接子裂解。
流程6.
流程6顯示兩種用於自藉由氮連接之連接子裂解經延長胺基酸聚合物的路徑。當自此等連接子裂解時，該胺基酸聚合物在其C末端處具有一級醯胺(-CONH
2)。
在第一路徑中，中間物
24上之N端保護基在步驟1a中經移除(若保護基為-Fmoc，則使用哌啶)以得到
25，且接著在酸性條件下達成自親水性連接子裂解，該裂解使用使R
1、R
2、R
3等保護基保持完整之「軟」裂解條件(例如含2-5% TFA之DCM溶液)，或使用「硬」裂解條件(例如85:5:5:5 TFA、三異丙基矽烷、1,2-乙二硫醇及水)移除不穩定R
1、R
2、R
3等保護基，以得到
26。若中間物
24 之N末端保護基為諸如-Boc之酸不穩定保護基，則步驟1a及2b可在「硬」裂解條件下一鍋達成。
在第二路徑中，
25在步驟2a中在醯胺偶聯條件(例如DEPBT及有機鹼或
27可使用有機鹼以丁二醯亞胺酯形式反應)下與羧酸
27偶聯以得到
28。在步驟3中，化合物
29使用上文概述之「硬」或「軟」裂解自親水性連接子裂解。
實例以下實例進一步說明本發明之各種實施例且代表本發明化合物之典型合成。試劑及起始材料容易獲得或可由一般熟習此項技術者容易地合成。應理解，實例係以說明而非限制之方式闡述，且一般熟習此項技術者可作出各種修改。
在AGILENT
®HP1200液相層析系統上進行LCMS。層析條件-管柱：Waters CSH™ C
18150×2.1 mm，1.7 µm；所用梯度為5至95%溶劑B:溶劑A經20至30分鐘運行；流動速率：0.5 mL/分鐘；管柱溫度：40至50℃；溶劑A：含0.2% TFA之水；溶劑B：乙腈。在接合至層析系統之質量選擇性偵測器(Mass Selective Detector)四極質譜儀上進行電噴霧質譜量測(ESMS)。
實例 1製備2-(4-(胺基(2,4-二甲氧基苯基)甲基)苯氧基)-N-(53-胺基-8,17,26,35,44,53-六側氧基-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-十二側氧基-9,18,27,36,45-戊氮雜五十三烷基)乙醯胺[Rink-(AEEA)
6-NH
2]
以Fmoc-Sieber醯胺樹脂(取代度0.8，苯乙烯1% DVB，100-200目)為起始物，在Symphony X Automated Peptide Synthesizer (Protein Technologies Inc.)上使用Fmoc策略藉由固相合成製備標題化合物。
在 Sieber 樹脂上偶聯 AEEA 單元 ： 以0.5 mmol規模分9批(共4.5 mmol)在Fmoc-Sieber醯胺樹脂上進行(AEEA)
6之製備。對於各批次，使用DMF (10 mL)洗滌兩次，每次10分鐘來使樹脂溶脹。接著按以下進行去保護及偶聯循環：將樹脂用DMF洗滌(9 mL經2分鐘)，使用含20%哌啶之DMF去保護(7 mL經5分鐘，接著9 mL經25分鐘)，用DMF洗滌(9 mL經1分鐘，重複6次)，與藉由氮氣鼓泡混合1小時45分鐘之Fmoc-AEEA-OH [含0.375 M Fmoc-AEEA-OH之DMF (4 mL，1.5 mmol，3當量)、Oxyma (0.750 M，2 mL，3當量)、DIC(0.660 M，2.5 mL，3.3當量)]偶聯，且最後將反應容器排乾且用DMF洗滌(9 mL經30秒，重複3次)。重複此去保護及偶聯循環共六次，在Sieber樹脂上得到Fmoc-(AEEA)
6。在最後一次DMF洗滌之後，樹脂用DCM洗滌(10 mL經1分鐘，重複5次)且在氮氣流下乾燥4小時。以此方式製備之各批次在Sieber樹脂上之Fmoc-(AEEA)
6的平均產量為1.156 g。
將 Rink 基團偶聯至 Sieber 樹脂上之 (AEEA)
6 上 ： Sieber樹脂上之一部分Fmoc-(AEEA)
6(1.1 g，0.5 mmol)用DMF溶脹(10 mL經20分鐘，重複3次)，使用含20%哌啶之DMF去保護(10 mL經20分鐘，重複三次)，接著用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)。向反應容器中添加Fmoc-Rink連接子(對-[a-[1-(9H-茀-9-基)-甲氧基甲醯胺基]-2,4-二甲氧基苯甲基]-苯氧基乙酸，0.81 g，1.5 mmol，3.0當量)、PyOxim (0.79 g，1.5 mmol，3.0當量)及DIEA (0.52 mL，0.39 mg，3.0 mmol，6.0當量)於DMF (9 mL)中之溶液，且藉由氮氣鼓泡混合2小時。將反應容器排乾，用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)，接著使用含20%哌啶之DMF去保護(10 mL經20分鐘，重複3次)。樹脂用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)。在最後一次DMF洗滌之後，樹脂用DCM洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)且在氮氣流下乾燥4小時以得到Sieber樹脂上之1.21 g Rink-(AEEA)
6。
自 Sieber 樹脂裂解 Rink-(AEEA)
6-NH
2 ： 將Sieber樹脂上之Rink-(AEEA)
6(1.21 g)與含5% TFA之DCM (12 mL)混合30分鐘，過濾，且用額外DCM洗滌。將濾液用DIEA中和且在減壓下濃縮。將所得油狀物溶解於DMSO (2 mL)中且添加MTBE (30 mL)，接著以3000 rpm離心混合物3分鐘。傾析上清液且添加新鮮MTBE (30 mL)，接著再次以3000 rpm離心混合物3分鐘。再次傾析上清液，留下呈油狀沈積物之標題化合物。ESMS
m/z1188.5 (M+H
+)。
實例 2製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[胺基-(2,4-二甲氧基苯基)甲基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[Rink-(AEEA)
8-NH
2]
使用基本上如實例1中所述之程序藉由固相合成製備標題化合物：將8個AEEA單元偶聯至固體載體上，隨後偶聯於Fmoc-Rink連接子上。在將Fmoc-Rink連接子偶聯至Sieber樹脂上之(AEEA)
8上後，用含2% TFA之DCM將Fmoc-Rink-(AEEA)
8-NH
2自樹脂裂解(5體積經20分鐘，重複5次)。用DIEA中和合併之濾液，且蒸發溶液。添加DMF (2體積)，接著添加MTBE以起始相分離。將混合物離心，且移除上清液，留下呈油狀材料之Fmoc-Rink-(AEEA)
8-NH
2。用含30%哌啶之DMF移除最終Fmoc基團，接著添加MTBE以起始相分離。移除上清液以得到呈油狀之標題化合物。ESMS
m/z739.5 (M+2H
+/2)。
實例 3製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[胺基-(2,4-二甲氧基苯基)甲基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[Rink-(AEEA)
10-NH
2]
使用基本上如實例1中所述之程序，將10個AEEA單元偶聯至固體載體上，隨後偶聯於Fmoc-Rink連接子上，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z1768.8 (M+H
+)。
實例 4製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[胺基-(2,4-二甲氧基苯基)甲基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[Rink-(AEEA)
4-NH
2]
使用基本上如實例1中所述之程序，將四個AEEA單元偶聯至固體載體上，隨後偶聯於Fmoc-Rink連接子上，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z897.4 [(M+H
+]。
實例 5製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[胺基-(2,4-二甲氧基苯基)甲基]苯氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[Rink-(AEEA)
2-NH
2]
使用基本上如實例1中所述之程序，將兩個AEEA單元偶聯至固體載體上，隨後偶聯於Fmoc-Rink連接子上，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z607.3 [(M+H
+]。
實例 6製備N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基-2-側氧基-乙氧基)乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙基]-4-[4-(羥甲基)-3-甲氧基-苯氧基]丁醯胺[HMPB-(AEEA)
10-NH
2]
使用基本上如實例1中所述之程序，將10個AEEA單元偶聯至Sieber樹脂上。在最後一個AEEA單元偶聯至樹脂上之後，其用DCM洗滌且在氮氣流下乾燥4小時。基本上如實例1中所述，用含20%哌啶之DMF對一部分樹脂(0.50 mmol)去保護，接著將樹脂懸浮於DCM (11.4 mL)中且添加TFA(0.6 mL)。將懸浮液在25℃下混合30分鐘，接著過濾且用DCM洗滌。將濾液用DIEA中和且在減壓下濃縮。將所得油狀物溶解於DMSO (2 mL)中且接著添加MTBE (30 mL)。將混合物離心，且移除上清液，在離心管中留下呈油狀之(AEEA)
10-NH
2。
向含有(AEEA)
10-NH
2之離心管中添加DEPBT (150 mg，0.50 mmol)、HMPB (120 mg，0.50 mmol)及DIEA (0.174 mL，129 mg，1.0 mmol)於DMSO (1.5 mL)中之溶液，使溶液靜置5分鐘，隨後將其添加至管中。將所得混合物置於振盪器上且混合2小時，且接著添加MTBE (20 mL)以誘導相分離。將混合物離心(2500 rpm，3分鐘)且丟棄上清液。將新鮮MTBE (20 mL)添加至管中且離心(2500 rpm，3分鐘)且丟棄上清液，留下呈油狀之標題化合物。ESMS
m/z1712.70 (M+Na-1H)。
實例 7製備N-(17-胺基-8,17-二側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9-氮雜十七基)-4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁醯胺[HMPB-(AEEA)
2-NH
2]
基本上如實例6中所述地製備標題化合物，不同之處在於將HMPB與(AEEA)
2-NH
2偶聯，以得到HMPB-(AEEA)
2-NH
2。ESMS
m/z552.3 (M+Na
+)。
實例 8製備N-(35-胺基-8,17,26,35-四側氧基-3,6,12,15,21,24,30,33-八氧雜-9,18,27-三氮雜三十五烷基)-4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁醯胺[HMPB-(AEEA)
4-NH
2]
基本上如實例6中所述地製備標題化合物，不同之處在於將HMPB與(AEEA)
4-NH
2偶聯，以得到HMPB-(AEEA)
4-NH
2。ESMS
m/z842.4 (M+Na
+)。
實例 9製備N-(53-胺基-8,17,26,35,44,53-六側氧基-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-十二氧雜-9,18,27,36,45-戊氮雜五十三烷基)-4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁醯胺[HMPB-(AEEA)
6-NH
2]
基本上如實例6中所述地製備標題化合物，不同之處在於將HMPB與(AEEA)
6-NH
2偶聯，以得到HMPB-(AEEA)
6-NH
2。ESMS
m/z1132.5 (M+Na
+)。
實例 10製備2-((5-胺基-10,11-二氫-5H-二苯并[a,d][7]輪烯-3-基)氧基)-N-(53-胺基-8,17,26,35,44,53-六側氧基-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-十二氧雜-9,18,27,36,45-戊氮雜五十三烷基)乙醯胺[Ramage-(AEEA)
6-NH
2]
將 Ramage 基團偶聯至 Sieber 樹脂上之 (AEEA)
6 上 ： Sieber樹脂上之一部分Fmoc-(AEEA)
6(986.8 mg，0.5 mmol)用DMF溶脹(10 mL經20分鐘，重複3次)，使用含20%哌啶之DMF去保護(10 mL經20分鐘，重複三次)，接著用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)。將Fmoc-Suberol (0.76 g，1.5 mmol，3.0當量)於DMF:DMSO (4:1，5 mL)中之溶液添加至反應容器中，接著添加Oxyma (0.750 M於DMF中，2 mL，1.5 mmol，3.0當量)及DIC (0.660 M於DMF中，2.5 mL，1.65 mmol，3.3當量)且藉由氮氣鼓泡混合4小時。將反應容器排乾，用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)，接著使用含20%哌啶之DMF去保護(10 mL經20分鐘，重複3次)。樹脂用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)。在最後一次DMF洗滌之後，樹脂用DCM洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)且在氮氣流下乾燥4小時以得到Sieber樹脂上之1.21 g Rink-(AEEA)
6。
自 Sieber 樹脂裂解 Ramage-(AEEA)
6-NH
2 ： 基本上如實例1中所述地自Sieber樹脂裂解Ramage-(AEEA)
6-NH
2，不同之處在於使用含2% TFA之DCM且在下一步處理前攪拌反應10分鐘而非30分鐘。ESMS
m/z1153.55 (M+H)。
實例 11製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[(11-胺基-6,11-二氫-5H-二苯并[1,2-e:1',2'-f][7]輪烯-2-基)伸氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[Ramage-(AEEA)
10-NH
2]
使用實例10中所述之程序，將Fmoc-Suberol與Sieber樹脂上之(AEEA)
10偶聯，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z1733.8 (M+H)。
實例 12製備2-((5-胺基-10,11-二氫-5H-二苯并[a,d][7]輪烯-3-基)氧基)-N-(35-胺基-8,17,26,35-四側氧基-3,6,12,15,21,24,30,33-八氧雜-9,18,27-三氮雜三十五烷基)乙醯胺[Ramage-(AEEA)
4-NH
2]
使用實例10中所述之程序，將Fmoc-Suberol與Sieber樹脂上之(AEEA)
4偶聯，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z863.4 (M+H)。
實例 13製備2-((5-胺基-10,11-二氫-5H-二苯并[a,d][7]輪烯-3-基)氧基)-N-(17-胺基-8,17-二側氧基-3,6,12,15-四氧雜-9-氮雜十七基)乙醯胺[Ramage-(AEEA)
2-NH
2]
使用實例10中所述之程序，將Fmoc-Suberol與Sieber樹脂上之(AEEA)
2偶聯，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z595.3 (M+Na)。
實例 14製備N-(2-(2-(2-胺基-2-側氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(2-(2-(2-(4-(羥基甲基)苯氧基)乙醯胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺[HMPA-(AEEA)
2-NH
2]
將 HMPA 基團偶聯至 Sieber 樹脂上之 (AEEA)
2 上 ： Sieber樹脂上之一部分Fmoc-(AEEA)
2(845 mg，0.5 mmol)用DMF溶脹(10 mL經20分鐘，重複3次)，使用含20%哌啶之DMF去保護(10 mL經20分鐘，重複三次)，接著用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)。將HMPA (91 mg，0.5 mmol，1.0當量)、DIEA (0.174 mL，1.0 mmol，2.0當量)及DEPBT (150 mg，0.5 mmol，1.0當量)於DMF (10 mL)中之溶液添加至反應容器中且藉由氮氣鼓泡混合2小時。將反應容器排乾，用DMF洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)，接著用DCM洗滌(10 mL經2分鐘，重複5次)且在氮氣流下乾燥4小時，得到Sieber樹脂上之908.6 mg HMPA-(AEEA)
2。
自 Sieber 樹脂裂解 HMPA-(AEEA)
2-NH
2 ： 基本上如實例1中所述地自Sieber樹脂裂解HMPA-(AEEA)
2-NH
2，得到標題化合物。ESMS
m/z472.2 (M+H
+)。
實例 15製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-(羥基甲基)苯氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯胺[HMPA-(AEEA)
10-NH
2]
使用實例14中所述之程序，將HMPA與Sieber樹脂上之(AEEA)
10偶聯，藉由固相合成製備標題化合物。ESMS
m/z1632.7 (M+H)。
實例 16- 使用 Rink-(AEEA)
6-NH
2 之液相肽合成及自連接子「硬」裂解使用液相肽合成按以下製備SEQ ID NO: 1之19聚體肽。
(SEQ ID NO: 1)
Rink-(AEEA)
6-NH
2 上之胺基酸鏈之延長 ： 將Fmoc-Ser(
tBu)-OH (0.5 mmol)、PyOxim (0.5 mmol)及DIEA (1 mmol)溶解於DMF (1 mL)中。混合溶液1分鐘，且接著添加Rink連接子-(AEEA)
6-NH
2(在實例1中製備，0.16 mmol)。混合反應溶液10分鐘，且接著添加MTBE (5 mL)。以3250 rpm離心混合物且丟棄上清液。將剩餘材料與含30%哌啶之DMF (1 mL)混合5分鐘。混合5分鐘後，添加MTBE (5 mL)。離心混合物且丟棄上清液。LCMS確認在各離心步驟中在含MTBE之上清液中不存在產物。
重複胺基酸偶聯及去保護步驟，按SEQ ID NO: 1中給出之C末端至N末端之次序偶聯Fmoc保護之胺基酸(經
tBu保護之側鏈-OH及-CO
2H基團)。當肽構築體小於或等於15個胺基酸時，DMF及DMSO可互換作為胺基酸偶聯及去保護步驟之反應溶劑。當肽長度大於15個胺基酸時，DMSO較佳作為反應溶劑。在完成SEQ ID NO: 1中之最終丙胺酸殘基偶聯後，使用上文所述之30%哌啶/DMF去保護反應條件移除最終Fmoc基團。凍乾產物以得到SEQ ID NO: 1之肽(0.612 mg，含殘餘溶劑)。ESMS
m/z1697.7 (M+2H
+/2)，1132.0 (M+3H
+/3)。粗分離重量支持LCMS資料，表明在液相合成期間，在用MTBE進行之相分離步驟期間，上清液中無產物損失。
自連接子「硬」裂解肽 ： 為移除可溶性連接子及保護基，在25℃下在含有TFA:三異丙基矽烷:1,2-乙二硫醇:水(85:5:5:5 v/v比率)之溶液中攪拌SEQ ID NO: 1之肽2小時，得到具有以下序列之肽：
AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH
2(SEQ ID NO: 2)
用MTBE (相比於反應體積為10:1 MTBE)沈澱SEQ ID NO: 2之肽，如上文所述進行離心，接著在真空中乾燥。高解析度MS
m/z觀測值944.4783 (電荷狀態+2，中性質量1886.9426)，理論中性質量1886.9414。
實例 17- 使用 Ramage-(AEEA)
10-NH
2 及自連接子「軟」裂解之液相肽合成 在 Ramage-(AEEA)
10-NH
2 上製備 SEQ ID NO: 3 ： 使用基本上如實例16中所述之程序，藉由液相肽合成製備SEQ ID NO: 3之肽，該製備開始於將Fmoc-Ser(
tBu)-OH偶聯至3.0 mmol Ramage-(AEEA)
10-NH
2上，接著進行Fmoc去保護。按SEQ ID NO: 3中給出之C末端至N末端之次序對剩餘的Fmoc保護之胺基酸(經
tBu保護之側鏈-OH基團)進行偶聯/去保護。Pro(7)及Pro(8)以二聚體(Fmoc-Pro-Pro-OH)形式併入。PyBOP可與PyOxim互換使用。ESMS
m/z913.1 (M+3H
+/3)。
(SEQ ID NO: 3)
自連接子「軟」裂解肽 ： 向SEQ ID NO: 3之肽中添加含2% TFA之DCM (10體積)，且在室溫下培育反應物30分鐘。使用1當量吡啶中和反應物且在真空中濃縮反應混合物。在產物中觀測到起始材料，向其中添加20體積含2% TFA之DCM。將混合物在室溫下培育30分鐘，用吡啶中和，且再次在真空中濃縮。向殘餘物中添加含5% TFA之DCM溶液(50體積)。40分鐘後，用減壓濃縮之吡啶中和溶液，得到SEQ ID NO: 4之粗肽。ESMS
m/z1042.50 (M+Na+)。
G-P-S(
tBu)-S(
tBu)-G-A-P-P-P-S(
tBu)-NH
2(SEQ ID NO: 4)
實例 18- 使用 Rink-(AEEA)
2-NH
2 之 液相肽合成 (SEQ ID NO: 5)
基本上如實例16中所述，在液相肽合成中使用Rink-(AEEA)
2-NH
2作為載體製備SEQ ID NO: 5之肽。將MTBE添加至最終Fmoc去保護反應混合物中，接著離心混合物。丟棄上清液，得到呈油狀沈積物之SEQ ID NO: 5之肽。ESMS
m/z1631.8 (M+Na
+), 1609.8 (M+H
+), 805.5 (M+2H
+/2)。
實例 19- 使用 HMPA-(AEEA)
10-NH
2 之液相肽合成及自連接子「軟」裂解使用液相肽合成按以下製備SEQ ID NO: 6之肽。
(SEQ ID NO: 6)
HMPA-(AEEA)
10-NH
2 上之 胺基酸鏈之延長 ： 向Fmoc-Gly-OH (0.2388 g，0.8032 mmol)於DMSO (2 mL)中之溶液中添加PyBOP (0.418 g，0.803 mmol)及DIEA (0.207 g，1.60 mmol)。將其混合1分鐘且添加至HMPA-(AEEA)
10-NH
2(0.4372 g，0.2678 mmol)中且混合90分鐘，接著添加MTBE (40 mL)。在室溫下以3000 rpm離心混合物3分鐘且傾析上清液。此洗滌重複3次，留下底部油狀物層。再次重複偶聯程序，接著將所得油狀物與含10%哌啶之DMF (2 mL)混合15分鐘。添加MTBE (20 mL)且以與上文所述類似之方式離心所得混合物。再次進行10%哌啶/DMF去保護程序，得到底部油狀物層。
以上文所述之方式按SEQ ID NO: 6中給出之C末端至N末端之次序對剩餘的Fmoc保護之胺基酸(經三苯甲基保護之麩醯胺酸側鏈-CONH
2基團及經-Boc保護之色胺酸側鏈-NH基團)進行偶聯/去保護，攪拌後續偶聯反應物45分鐘而非90分鐘。在攪拌最終胺基酸(Fmoc-Phe-OH)偶聯反應物45分鐘後，將乙酸異丙酯添加至混合物中，接著如上文所述地離心且用MTBE洗滌，得到作為標題化合物之底部油狀物層。ES/MS m/z 1556.10 (M+2H+/2)。
自連接子軟裂解肽 ： 對SEQ ID NO: 6之肽進行基本上如實例17中所述之軟裂解程序，使用含3% TFA之DCM進行兩次30分鐘培育，得到SEQ ID NO: 7之肽。ES/MS
m/z1519.60 (M+Na+)。
Fmoc-F-V-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-A-G-OH (SEQ ID NO: 7)
實例 20- 使用 HMPB-(AEEA)
10-NH
2 之液相肽合成及自連接子「軟」裂解使用液相肽合成按以下製備SEQ ID NO: 8之肽。
(SEQ ID NO: 8)
HMPB-(AEEA)
10-NH
2 上之胺基酸鏈之延長 ： 基本上如實例16中所述地製備SEQ ID NO: 8之肽，偶聯Fmoc保護之胺基酸(經三苯甲基保護之麩醯胺酸側鏈-CONH
2基團及經-Boc保護之色胺酸側鏈-NH基團)，且接著以實例16中所述之方式按SEQ ID NO: 8中給出之C末端至N末端之次序去保護，得到SEQ ID NO: 8之肽。ESMS
m/zESMS
m/z1585.70 (M+2H
+/2)。
軟裂解以獲得 SEQ ID NO: 7 之肽 ： 將SEQ ID NO: 8之肽溶解於含3% TFA之DCM (20體積)中且在室溫下培育30分鐘。反應混合物用1當量吡啶中和，且接著用水洗滌。在真空中濃縮有機層，得到SEQ ID NO: 7之肽。ESMS
m/z1497.7 (M+H+)。
實例 21製備20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基-2-側氧基-乙氧基)乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁氧基]-2-甲氧基-苯基]甲氧基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-三級丁氧基羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-二十烷酸三級丁酯[脂肪酸側鏈-HMPB-(AEEA)
10-NH
2]
方法 1 [ 偶聯次序 - (AEEA)
2 、 γ-Glu 、 脂肪酸 ] ：向Fmoc-(AEEA)
2-OH (4.493 g，8.469 mmol)及DMAP (51.7 mg，0.423 mmol)於DMSO (11 mL)中之溶液中添加DIC (1.33 mL，8.469 mmol)且使其靜置5分鐘。向溶液中添加HMPB-(AEEA)
10-NH
2(2.823 mmol)，用DMSO (3 mL)對其進行向前沖洗。混合反應溶液2小時，且接著添加MTBE (45 mL)。將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液且添加新鮮MTBE (45 mL)，接著將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液且添加EtOAc (45 mL)，接著將混合物以3000 rpm離心2分鐘且接著傾析上清液，得到油狀沈積物。將30%哌啶/DMF (8 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘，隨後添加MTBE (45 mL)。將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，且添加新鮮MTBE (45 mL)，接著再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。再次傾析上清液，留下油狀沈積物。
向Fmoc-Glu-O
tBu (1.201 g，2.823 mmol)及PyBOP (1.469 g，2.823 mmol)於DMSO (9 mL)中之溶液中添加DIEA (0.983 mL，5.64 mmol)。使溶液老化5分鐘且接著添加至油狀沈積物中且混合30分鐘。添加MTBE (45 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液且添加新鮮MTBE (45 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液，且添加EtOAc (45 mL)，接著將混合物以3000 rpm離心2分鐘。再次傾析上清液，留下油狀沈積物。將30%哌啶/DMF (8 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘，隨後添加MTBE (45 mL)。將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，且添加新鮮MTBE (45 mL)，接著再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。再次傾析上清液，留下油狀沈積物。
向20-三級丁氧基-20-側氧基-二十烷酸(1.13 g，2.83 mmol，1.0當量)及DEPBT (844.7 mg，2.823 mmol，1.0當量)於DMSO:甲苯(9:1，10 mL)中之溶液中添加DIEA (0.983 mL，5.64 mmol，2.0當量)。使溶液老化5分鐘且接著添加至油狀沈積物中且混合30分鐘。添加MTBE (45 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液，添加新鮮MTBE (45 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。再次傾析上清液且添加EtOAc (45 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，留下呈油狀沈積物之標題化合物。ESMS
m/z1274.10 (M+2H
+/2)。
方法 2 [ 偶聯次序 - (AEEA)
2 、 γ-Glu- 脂肪酸之丁二醯亞胺酯 ] ：如上文所述以相同規模將Fmoc-(AEEA)
2-OH與HMPB-(AEEA)
10-NH
2偶聯。將30%哌啶/DMF (3 mL)之溶液添加至Fmoc-(AEEA)
2-HMPB-(AEEA)
10-NH
2之油狀物中且混合15分鐘。將MTBE (40 mL總體積)添加至反應物中且將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)。傾析MTBE且將DMSO (2 mL)添加至油狀物中以使其溶解。添加新鮮MTBE (40 mL總體積)且再次將混合物離心且傾析MTBE層。將(2S)-2-[(20-三級丁氧基-20-側氧基-二十醯基)胺基]戊二酸O1-三級丁酯O5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(5.76 g，8.46 mmol)溶解於DMSO:甲苯之混合物(9:1比率，5.4 mL DMSO+0.6 mL甲苯)中。添加DIEA (3 mL，16.92 mmol)且使所得溶液靜置5分鐘以預活化。將混合物添加至離心管中之AEEA
2-HMPB-(AEEA)
10-NH
2(2.82 mmol)後維持30分鐘。添加MTBE (40 ML總體積)，且將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)。移除MTBE層，且添加新鮮MTBE (40 mL總體積)，且再次將混合物離心。丟棄上清液，留下呈油狀物之標題化合物。ESMS m/z 1273.70 (M+2H+/2)。
實例 22藉由軟裂解方法製備2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-三級丁氧基-4-[(20-三級丁氧基-20-側氧基-二十醯基)胺基]-5-側氧基-戊醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙酸[脂肪酸側鏈]
將脂肪酸側鏈-HMPB-(AEEA)
10-NH
2(在實例21中製備，2500 mg)添加至2% TFA/甲苯溶液(10體積，25 mL)中。將混合物混合10分鐘且接著以3000 rpm離心5分鐘。收集上清液且用吡啶(與TFA等莫耳)中和。向剩餘油狀沈積物中添加MTBE (25 mL)，且將混合物以3000 rpm離心5分鐘。收集上清液，添加新鮮MTBE (25 mL)至油狀物中，且再次將混合物以3000 rpm離心5分鐘。再次收集上清液，得到油狀沈積物。再重複裂解及洗滌兩次。用飽和NaCl水溶液及水洗滌有機物，接著在減壓下濃縮合併之有機物，得到標題化合物。ESMS m/z 874 (M+H+)。使用UPLC-CAD [管柱：Waters CSH™ C
18150×2.1 mm，1.7 μm；管柱溫度：50℃；梯度-30至90%溶劑B:溶劑A經21分鐘運行；流動速率-0.5 mL/分鐘；溶劑A：含0.2% TFA之水；溶劑B：乙腈；偵測器：光電二極體陣列UV，CAD]分析粗產物。粗產物顯示61.71%之純度。
實例 23製備20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基-2-側氧基-乙氧基)乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-4-側氧基-丁氧基]-2-甲氧基-苯基]甲氧基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-三級丁氧基羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-二十烷酸三級丁酯[脂肪酸側鏈-HMPB-(AEEA)
6-NH
2]
向Fmoc-AEEA-OH (1156 mg，3 mmol)及DMAP (18.4 mg，0.149 mmol)於DMSO (4 mL)中之溶液中添加DIC (0.47 mL，3 mmol)。使所得溶液靜置5分鐘以活化且接著添加至HMPB-(AEEA)
6-NH
2(1 mmol)中。將反應混合物置於振盪器上且混合2小時。添加MTBE (40 mL總體積)以誘導出油且將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)。丟棄MTBE層，且添加新鮮MTBE (40 mL總體積)。將混合物再次離心，且丟棄MTBE。向所得油狀物中添加30%哌啶/DMF (3 mL)且混合15分鐘。接著添加MTBE (40 mL總體積)，且將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)。傾析MTBE層且將DMSO (2 mL)添加至油狀物中以使其溶解且添加新鮮MTBE (40 mL總體積)。將混合物再次離心，且傾析MTBE層。將Fmoc-AEEA-OH (1156 mg，3 mmol)及PyOxim (1598.1 mg，3 mmol)之溶液溶解於DMSO (4 mL)中。添加DIEA (1 mL，6 mmol)且使所得溶液靜置5分鐘以預活化。將混合物添加至離心管中之AEEA-HMPB-(AEEA)
6-NH
2(1 mmol)中且使其混合30分鐘。使用30%哌啶/DMF (3 mL)移除Fmoc且如上文所述地進行MTBE洗滌。將(2S)-2-[(20-三級丁氧基-20-側氧基-二十醯基)胺基]戊二酸O1-三級丁酯O5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(2040 mg，3 mmol)溶解於DMSO:甲苯之混合物(9:1比率，2.7 mL DMSO+0.3 mL甲苯)中。添加DIEA (1 mL，6 mmol)且使所得溶液靜置5分鐘以預活化。將混合物添加至離心管中之AEEA
2-HMPB-(AEEA)
6-NH
2(1 mmol)後維持30分鐘。接著重複MTBE洗滌以誘導油狀物形成。丟棄MTBE，留下呈油狀沈積物之標題化合物。ESMS m/z 1966.3 (M+H+)。
實例 24製備20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基-2-側氧基-乙氧基)乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]苯基]甲氧基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-2-側氧基-乙氧基]乙氧基]乙胺基]-1-三級丁氧基羰基-4-側氧基-丁基]胺基]-20-側氧基-二十烷酸三級丁酯[脂肪酸側鏈-HMPA-(AEEA)
10-NH
2]
向Fmoc-(AEEA)-OH (578 mg，1.50 mmol)及DMAP (9.2 mg，0.075 mmol)於DMSO (4 mL)中之溶液中添加DIC (0.235 mL，1.50 mmol)。使溶液老化5分鐘且接著添加至HMPA-(AEEA)
10-NH
2(0.500 mmol)中且混合2小時。添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液，且添加新鮮MTBE (14 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，且如上文所述地用Fmoc-(AEEA)-OH進行第二偶聯循環，且2小時後添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。傾析上清液，且添加新鮮MTBE (14 mL)且再次以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，得到油狀沈積物。將30%哌啶/DMF (3 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，將油狀沈積物溶解於1 mL DMSO中，且添加新鮮MTBE (14 mL)。再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘，且接著傾析上清液，得到油狀沈積物。
向Fmoc-AEEA-OH (586 mg，1.5 mmol)及PyOxim (791 mg，1.5mmol)於DMSO (4 mL)中之溶液中添加DIEA (0.523 mL，3.0 mmol)。使溶液老化5分鐘且接著將其添加至如上獲得之油狀沈積物中且混合30分鐘。添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，且添加新鮮MTBE (14 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，得到油狀沈積物。將30%哌啶/DMF (3 ml)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘，且接著丟棄上清液。添加新鮮MTBE (14 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，得到(AEEA)
2-HMPA-(AEEA)
10-NH
2油狀沈積物。
以與Fmoc-AEEA-OH之第二偶聯類似的方式，將Fmoc-Glu-O
tBu偶聯至(AEEA)
2-HMPA-(AEEA)
10-NH
2上，接著添加MTBE且離心，接著用含30%哌啶之DMF去保護，接著添加MTBE且離心，得到呈油狀沈積物形式之Fmoc-γGlu-(AEEA)
2- HMPA-(AEEA)
10-NH
2。
向20-(三級丁氧基)-20-側氧基二十烷酸(600 mg，1.5 mmol，3.0當量)及PyBOP (781 mg，1.5 mmol，3.0當量)於DMSO (4 mL)中之溶液中添加DIEA (0.523 mL，3.0 mmol，6.0當量)。使溶液老化5分鐘，在此期間沈澱出活化酯，因此添加甲苯(8 mL)且接著再次老化5分鐘。將溶液添加至Fmoc-γGlu-(AEEA)
2- HMPA-(AEEA)
10-NH
2中且混合一小時(未達成反應混合物之完全溶解)。添加MTBE (14 mL)，且將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，且添加新鮮MTBE (14 mL)，且再次將混合物以3000 rpm離心2分鐘。丟棄上清液，留下呈油狀之標題化合物。ESMS
m/z2488.2 (M+H
+)；1245.5 (M+2H
+/2)。
實例 25- 使用 HMPB-(AEEA)
10-NH
2 之液相肽合成及自連接子「軟」裂解 (SEQ ID NO: 9)
HMPB-(AEEA)
10-NH
2 上之 胺基酸鏈之延長 ： 將Fmoc-Ala-OH (1.9 g，6 mmol)及DMAP (36.8 mg，0.301 mmol)之混合物溶解於4 mL DMSO中。將DIC (0.93mL，6 mmol)添加至混合物中且使其靜置5分鐘以預活化。將此混合物添加至HMPB-(AEEA)
2-NH
2中且在室溫下振盪混合物2小時。添加MTBE，使混合物體積達到40 mL，誘導相變且使偶聯產物Fmoc-Ala-HMPB-(AEEA)
2-NH
2沈澱為油狀物。將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)且傾析MTBE上清液。將額外MTBE添加至油狀沈積物中，使體積達到40 mL，且將混合物離心且傾析MTBE上清液。用Fmoc-Ala-OH重複偶聯程序兩次以達成完全偶聯。
向所得油狀沈積物中添加30%哌啶於DMF (3 mL)中之溶液且振盪混合物15分鐘。接著添加MTBE以使體積達到40 mL，使得油狀物沈澱。將混合物離心(3000 rpm×2分鐘)，傾析上清液，且將DMSO (1 mL)添加至油狀沈積物中。添加MTBE以使體積達到40 mL，且再次離心混合物，且傾析上清液以留下油狀沈積物。
基本上如實例16中所述地重複胺基酸偶聯及去保護步驟，首先偶聯(2S)-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-三級丁氧基-4-[(20-三級丁氧基-20-側氧基-二十醯基)胺基]-5-側氧基-戊醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-2-(9H-茀-9-基甲氧羰基胺基)己酸，且接著按SEQ ID NO: 9中給出之C末端至N末端之次序偶聯剩餘的Fmoc保護之胺基酸(經
tBu保護之天冬胺酸側鏈-CO
2H基團，經三苯甲基保護之麩醯胺酸側鏈-NH
2及經-Boc保護之離胺酸-NH
2)，使用DEPBT替代PyOxim且在各偶聯程序中混合60分鐘，得到SEQ ID NO: 9之肽。ESMS
m/z1961.08 (M+2H
+/2)。
軟裂解以獲得 SEQ ID NO: 10 之肽： 在室溫下將SEQ ID NO: 9之肽(0.38 mmol，1.5g)於含2% TFA之DCM (15 mL)中之混合物培育30分鐘。接著添加吡啶(1當量)以中和反應物。用水洗滌反應混合物且在真空中濃縮有機層。用EtOAc洗滌殘餘物，接著再次將其溶解於DCM中且在真空中濃縮，得到SEQ ID NO: 10之肽。ESMS
m/z1125 (M+2H+/2)。
使用UPLC-MS [管柱：Waters CSH™ C
18150×2.1 mm，1.7 mm；管柱溫度：50℃；梯度-30至90%溶劑B:溶劑A經21分鐘運行；流動速率：0.5 mL/分鐘；溶劑A：含0.2% TFA之水；溶劑B：乙腈；偵測器：光電二極體陣列UV，ESMS]分析粗產物。粗產物顯示71.31%之純度。
(SEQ ID NO: 10)
實例 26- 用 HMPB-(AEEA)
10-NH
2 之 液相肽合成使用液相肽合成按以下製備SEQ ID NO: 11之肽。
(SEQ ID NO: 11)
將Fmoc-Leu-OH (4.2 g，12 mmol)及DMAP (73.6 mg，0.602 mmol)之混合物溶解於DMSO (5 mL)中。添加DIC (1.58 g，1.96 mL，12 mmol)且使混合物靜置5分鐘以預活化。將混合物添加至HMPB-(AEEA)
10-NH
2(4 mmol)中且在室溫下振盪2小時。添加MTBE，使混合物體積達到40 mL，誘導相變且偶聯產物Fmoc-Leu-HMPB-(AEEA)
2-NH
2沈澱為油狀物。將混合物(3000 rpm×3分鐘)離心且傾析MTBE上清液。將額外MTBE添加至油狀沈積物中，使體積達到40 mL，且將混合物離心且傾析MTBE上清液。用Fmoc-Leu-OH重複偶聯程序兩次以達成完整偶聯。
向所得油狀沈積物中添加30%哌啶於DMF (3 mL)中之溶液且振盪混合物15分鐘。接著添加MTBE以使體積達到40 mL，使得油狀物沈澱。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)，傾析上清液，且將DMSO (1 mL)添加至油狀沈積物中。添加MTBE以使體積達到40 mL，且再次離心混合物，且傾析上清液以留下油狀沈積物。
基本上如實例16中所述地重複後續胺基酸偶聯及去保護步驟，按SEQ ID NO: 11中給出之C末端至N末端之次序偶聯Fmoc保護之胺基酸(經
tBu保護之-OH及-CO
2H側鏈基團)，得到SEQ ID NO: 11之肽。ESMS
m/z1893 (M+2H+/2)，1262 (M+3H+/3)。
實例 27- 四聚肽之液相合成及自基於 HMPB 之 連接子「軟」裂解 (SEQ ID NO: 12)
HMPB-(AEEA)
10-NH
2 上之四聚肽製備 ： 基本上如實例16中所述地製備SEQ ID NO: 12之肽，但有以下變化：第一胺基酸(Fmoc-Gly-OH)按以下與HMPB-(AEEA)
10-NH
2偶聯：將Fmoc-Gly-OH、DIC及DMAP (3:3:0.15莫耳比)溶解於DMSO中且混合1分鐘，接著添加至HMPB-(AEEA)
10-NH
2中。2小時後，添加MTBE (5 mL)以起始相分離。以3250 rpm離心混合物且丟棄上清液。用Fmoc-Gly-OH如上文所述地進行第二偶聯循環且在2小時後，添加MTBE (5 mL)以起始相分離。以3250 rpm離心混合物且丟棄上清液。使用30%哌啶/DMF移除Fmoc基團，且接著基本上如實例16中所述地進行後續偶聯及去保護，得到SEQ ID NO: 12之肽。ESMS
m/z2360.1 (M+Na
+)，2338.1 (M+H
+)，1169.6 (M+2H
+/2)。
自 HMPB-(AEEA)
10-NH
2 連接子軟裂解四聚肽 ： 採用兩種方法「軟」裂解SEQ ID NO: 12之肽，得到SEQ ID NO: 13之經保護之四聚肽：
Boc-Y(
tBu)-Aib-E(
tBu)-G-OH (SEQ ID NO: 13)。
方法 1 ：向SEQ ID NO: 12之肽中添加5% TFA/DCM溶液(10體積)。30分鐘後，將溶液用吡啶中和且用10% NaCl溶液洗滌兩次。有機物經Na
2SO
4乾燥且在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於最少DMF中且用水(3體積)稀釋。用MTBE萃取混合物三次且將合併之有機物在減壓下濃縮，得到SEQ ID NO: 13之肽。ESMS
m/z687.4 (M+Na+)，665.4 (M+H+)。
方法 2 ：向SEQ ID NO: 12之肽中添加2% TFA/甲苯溶液(10體積)。將混合物混合10分鐘且接著以3000 rpm離心5分鐘。收集上清液且用吡啶(與TFA等莫耳)中和。向剩餘油狀沈積物中添加MTBE (3 mL)，且將混合物以3000 rpm離心5分鐘。收集上清液，將新鮮MTBE (3 mL)添加至油狀物中，且再次將混合物以3000 rpm離心5分鐘。再次收集上清液，得到油狀沈積物。對油狀沈積物再重複裂解及洗滌兩次。用飽和NaCl水溶液及水洗滌合併之有機上清液混合物，接著在減壓下濃縮合併之有機物，得到SEQ ID NO: 13之肽。
(SEQ ID NO: 14)
HMPB-(AEEA)
4-NH
2 上之四聚肽製備 ： 使用HMPB-(AEEA)
4-NH
2基本上如上文所述地製備SEQ ID NO: 14之肽。ESMS
m/z1488.7 (M+Na
+)。
自 HMPB-(AEEA)
4-NH
2 連接子軟裂解四聚肽 ： 向SEQ ID NO: 14之肽中添加3% TFA/DCM溶液(20體積)。30分鐘後，溶液用吡啶中和且用水洗滌兩次。有機物用MgSO
4乾燥且在減壓下濃縮，得到SEQ ID NO: 13之肽。ESMS
m/z687.4 (M+Na+), 665.4 (M+H+)。
(SEQ ID NO: 15)
HMPB-(AEEA)
2-NH
2 上之四聚肽製備 ： 使用HMPB-(AEEA)
2-NH
2基本上如上文所述地製備SEQ ID NO: 15之肽。ESMS
m/z1198.5 (M+Na
+)。
(SEQ ID NO: 16)
HMPB-(AEEA)
6-NH
2 上之四聚肽製備 ： 使用HMPB-(AEEA)
6-NH
2基本上如上文所述地製備SEQ ID NO: 16之肽。ESMS
m/z1778.8 (M+Na
+)。
實例 28- 四聚肽之液相合成及自基於 HMPA 之 連接子「軟」裂解 (SEQ ID NO: 17)
HMPA-(AEEA)
10-NH
2 上之四聚肽製備 ： 向Fmoc-Gly-OH (140 mg，0.470891 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加DIC (60 mg，0.47 mmol)及2,4,6-三甲基吡啶(0.125 mL，0.945 mmol)。將此溶液添加至HMPA-(AEEA)
10-NH
2(256 mg，0.15679 mmol)中且在室溫下振盪2小時。將MTBE (20 mL)添加至其中且離心所得混合物(5000 rpm×3分鐘)。傾析上清液且再進行萃取MTBE洗滌三次，各次藉由傾析將底部油狀物層與上清液分離。重複以上偶聯及洗滌製程三次以推動反應完成。將沈積油狀物層與含25%哌啶之DMF (2 mL)混合20分鐘。其用MTBE (20 mL)洗滌且以與上文所述類似之方式離心三次，留下底部油狀物層。
向Fmoc-Glu(O
tBu)-OH (90.74 mg，0.2111 mmol)及PyOxim (112.5 mg，0.2111 mmol)於DMSO (750 μL)及乙腈(750 μL)中之溶液中添加DIEA (74 μL，0.424 mmol)且混合溶液2分鐘。將此溶液添加至以上油狀沈積物(0.180 g，0.107 mmol)中且在室溫下混合30分鐘，接著添加MTBE (20 mL)。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。進行此萃取洗滌兩次，且各次傾析上清液且因此與底部油狀物層分離。將10%哌啶/DMF (2 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。將其用MTBE (20 mL)洗滌且以與上文所述類似之方式離心兩次，留下底部油狀物層。
向Fmoc-Aib-OH (68.4 mg，0.210 mmol)及PyOxim (110.8 mg，0.2080 mmol)於DMSO (750 μL)中之溶液中添加DIPEA (55.05 μL，0.316 mmol)。混合溶液2分鐘且將其添加至以上油狀物層(0.197 g，0.105 mmol)中且使其在室溫下混合30分鐘，接著添加MTBE (20 mL)，使得油狀物沈澱。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。進行此萃取洗滌兩次，各次藉由傾析將底部油狀物層與上清液分離。將10%哌啶/DMF (2 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。其類似地用MTBE (20 mL)洗滌且如上文所述地離心兩次，留下底部油狀物層。
向Boc-Tyr(
tBu)-OH (106.4 mg，0.3153 mmol)及PyOxim (166.3 mg，0.3153 mmol)於DMSO (750 μL)及乙腈(750 μL)中之溶液中添加DIPEA (91 μL，0.316 mmol)。混合溶液2分鐘且將其添加至以上油狀物層(201.0 mg，0.1026 mmol)中且使其在室溫下混合30分鐘，接著添加MTBE (20 mL)，使得油狀物沈澱。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)。進行此萃取洗滌兩次，各次藉由傾析將底部油狀物層與上清液分離。進行以上偶聯及洗滌製程4次以推動反應完成，得到呈油狀之SEQ ID NO: 17之肽。ESMS m/z 2279.10 (M+H+)；1140.20 (M+2H+/2)。
自 HMPA-(AEEA)
10-NH
2 連接子軟裂解四聚肽 ： 向SEQ ID NO: 17之肽(102.3 mg，0.04488 mmol)中添加含1% TFA之DCM (1.22 mL)且將混合物在室溫下攪拌1小時。將吡啶(10.6 mg，0.134 mmol)添加至所得溶液中。用水(4.5 mL)洗滌混合物，接著收集有機層且濃縮，得到呈油狀之SEQ ID NO: 13之肽；LCMS表明反應已進行至起始材料至產物之33%轉化率。ESMS m/z 665.40 (M+H+)；687.30 (M+Na+)。
HMPA-(AEEA)
10-NH
2 上之 四聚肽製備： (SEQ ID NO: 18)
向Fmoc-Gly-OH (522.5 mg，1.757 mmol)於DMSO (2.5 mL)中之溶液中添加EDC (249.7 mg，1.609 mmol)及氰基乙醛酸乙酯-2-肟(272.4 mg，1.898 mmol)。將此溶液添加至HMPA-(AEEA)
2(0.4143 g，0.8787 mmol)中且在室溫下混合溶液2小時，接著添加MTBE (30 mL)以沈澱油狀物。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。進行此萃取洗滌三次，各次藉由傾析將底部油狀物層與上清液分離。重複以上偶聯及洗滌製程三次以推動反應完成。將沈積油狀物層與含10%哌啶之DMF (2 mL)混合20分鐘。其用MTBE (20 mL)洗滌且以與上文所述類似之方式離心。再次進行後一Fmoc移除步驟，得到底部油狀物層。
向Fmoc-Glu(O
tBu)-OH (0.842 g，1.980 mmol)及PyOxim (1.055 g，1.980 mmol)於DMSO (3 mL)及乙腈(1 mL)中之溶液中添加DIEA (0.516 g，4.01 mmol)且混合溶液1分鐘。將此溶液添加至以上油狀物沈積物(0.504 g，0.954 mmol)中且在室溫下混合45分鐘，接著添加MTBE (40 mL)以沈澱油狀物。將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。進行此萃取洗滌兩次，且各次傾析上清液且因此與底部油狀物層分離。再次重複偶聯及洗滌步驟。將10%哌啶/DMF (2 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。其以與上文所述類似之方式洗滌，留下底部油狀物層。
向Fmoc-Aib-OH (970 mg，2.98 mmol)及PyOxim (1.57 g，2.92 mmol)於DMSO (3 mL)及乙腈(1 mL)中之溶液中添加DIEA (782 μL，4.48 mmol)且混合溶液1分鐘。將此溶液添加至以上油狀沈積物(1.001 g，1.402 mmol)中且在室溫下混合45分鐘，接著將混合物用MTBE洗滌且如上文所述地離心。將10%哌啶/DMF (2 mL)添加至油狀沈積物中且混合15分鐘。將混合物用MTBE洗滌且如上文所述地離心。再次進行後一Fmoc移除步驟，得到底部油狀物層。
向Boc-Tyr(
tBu)-OH (1.63 g，4.83 mmol)及PyOxim (2.55 g，4.74 mmol)於DMSO (3 mL)及乙腈(1 mL)中之溶液中添加DIEA (1.13 mL，6.48 mmol)且混合溶液1分鐘。將此溶液添加至以上油狀沈積物(1.289 g，1.613 mmol)中且在室溫下混合60分鐘，接著將其用MTBE洗滌且如上文所述地離心。再次重複偶聯及MTBE洗滌步驟，得到呈油狀之SEQ ID NO: 18之肽。ESMS m/z 1118.50 (M+H+)；1140.50 (M+Na+)。
自 HMPA-(AEEA)
2-NH
2 連接子軟裂解四聚肽 ： 向SEQ ID NO: 18之肽(50 mg，0.045 mmol)中添加1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(200 μL，1.91 mmol)於DCM (0.8 mL)中之混合物且將所得混合物在室溫下攪拌20分鐘。添加ACN (2 mL)且在真空中濃縮反應混合物。重複ACN添加及濃縮步驟兩次。使殘餘物經受以上條件(在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇及DCM中攪拌20分鐘，接著添加ACN且濃縮)兩次，得到呈油狀之SEQ ID NO: 13之肽；LCMS表明反應已進行至起始材料至產物之8%轉化率。ESMS m/z 664.40 (M+)。
實例 29- 基於液相片段使用 Rink 連接子 -(AEEA)
6-NH
2 製備 SEQ ID NO: 22 之肽本文描述經由基於液相片段之方法合成SEQ ID NO: 22之肽。
在 Rink-(AEEA)
6-NH
2 上製備 SEQ ID NO: 19 之肽 ： 使用基本上如實例16中所述之程序，藉由液相肽合成來製備SEQ ID NO: 19之肽，該製備開始於將Fmoc-Ser(
tBu)-OH偶聯至0.05 mmol Rink-(AEEA)
6-NH
2上，接著進行Fmoc去保護。按SEQ ID NO: 19中給出之C末端至N末端之次序對剩餘的Fmoc保護之胺基酸(經
tBu保護之側鏈-OH基團)進行偶聯/去保護。
(SEQ ID NO: 19)
ESMS
m/z1095.7 (M+2H
+/2)，731.0 (M+3H
+/3)。
將 SEQ ID NO: 7 之肽偶聯至 SEQ ID NO: 19 之肽上 ： 使用基本上如實例16中所述之偶聯程序，使用DMSO作為反應溶劑將SEQ ID NO: 7之肽偶聯至SEQ ID NO: 19之肽上，得到SEQ ID NO: 20之肽。在1分鐘反應時間之後對反應物取樣且藉由LCMS進行分析，其顯示反應完成。
(SEQ ID NO: 20)
ESMS
m/z1835.90 (M+2H
+/2)，1224.20 (M+3H
+/3)。使用基本上如實例16中所述之去保護程序，使用DMSO作為反應溶劑自SEQ ID NO: 20之肽移除N末端Fmoc基團，得到SEQ ID NO: 21之肽：
(SEQ ID NO: 21)
ESMS
m/z1724.9 (M+2H
+/2)，1150.20 (M+3H
+/3)。
將 SEQ ID NO: 10 之肽偶聯至 SEQ ID NO: 21 之肽上 ： 使用基本上如實例16中所述之偶聯程序，使用DMSO作為反應溶劑將SEQ ID NO: 10之肽(0.06 mmol)偶聯至SEQ ID NO: 21之肽上，且接著使用基本上如實例16中所述之去保護程序，使用含30%哌啶之DMSO移除Fmoc基團，得到SEQ ID NO: 22之肽。
(SEQ ID NO: 22)
ESMS
m/z= 1820.1 (M+3H
+/3)，1365.3 (M+4H
+/4)。
實例 30使用基於片段之方法用Rink-(AEEA)
10-NH
2製備SEQ ID NO: 23之肽
(SEQ ID NO: 23)
向Fmoc-P-P-P-S(
tBu)-OH (SEQ ID NO: 24，0.2291 g，0.3395 mmol)於DMSO (2 mL)中之溶液中添加PyBOP (0.1781 g，0.3422 mmol)及DIEA (54.186 μL，0.311 mmol)。將其混合1分鐘且添加至Rink-(AEEA)
10-NH
2(0.500 g，0.338 mmol)中且混合60分鐘，接著添加MTBE (12 mL)，得到油狀沈澱物。混合物在室溫下離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。再重複此洗滌一次。以類似方式用乙酸異丙酯洗滌(兩次，各次10 mL)油狀沈積物。再重複偶聯兩次。將油狀物層與含20%哌啶之DMF (2 mL)混合20分鐘且以類似方式用MTBE (12 mL)及乙酸異丙酯洗滌，得到油狀沈積物。
向Fmoc-S(
tBu)-S(
tBu)-G-A-OH (SEQ ID NO: 25，0.2262 g，0.3454 mmol)於DMSO (2 mL)中之溶液中添加PyBOP (0.180 g，0.346 mmol)及DIEA (60.34 μL，0.346 mmol)。將溶液混合1分鐘且接著添加至來自前一步驟之油狀沈積物(0.5073 g，0.2303 mmol)中且混合60分鐘。添加MTBE (12 mL)，沈澱油狀物，且將混合物離心(3000 rpm×3分鐘)且傾析上清液。如上文所述用MTBE及乙酸異丙酯洗滌油狀沈積物兩次。再重複偶聯反應兩次。將油狀物層與含20%哌啶之DMF (2 mL)混合20分鐘且以類似方式用MTBE (12 mL)及乙酸異丙酯洗滌/離心，得到油狀沈積物。
以基本上如同前一偶聯及去保護所描述之方式，將以下各者依序偶聯至前一步驟中分離之油狀沈積物上：
1. Fmoc-A-G-G-P-OH (SEQ ID NO: 26)，
2. Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-OH (SEQ ID NO: 27)，
3.
(SEQ ID NO: 28)，
4. Fmoc-K-I-A-Q(Trt)-OH (SEQ ID NO: 29)，
5. Fmoc-I-Aib-L-D(
tBu)-OH (SEQ ID NO: 30)，
6. Fmoc-S(
tBu)-D(
tBu)-Y(
tBu)-S(
tBu)-OH (SEQ ID NO: 31)。
在偶聯SEQ ID NO: 31之肽之後，進行哌啶/DMF去保護步驟，且在MTBE/乙酸異丙酯洗滌/離心程序之後獲得呈油狀之SEQ ID NO: 23之肽。ESMS m/z 1756.50 (M+4H+/4)。
序列表
SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH
2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4G-P-S(
tBu)-S(
tBu)-G-A-P-P-P-S(
tBu)-NH
2 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7Fmoc-F-V-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-A-G-OH
SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13Boc-Y(
tBu)-Aib-E(
tBu)-G-OH
SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24Fmoc-P-P-P-S(
tBu)-OH
SEQ ID NO: 25Fmoc-S(
tBu)-S(
tBu)-G-A-OH
SEQ ID NO: 26Fmoc-A-G-G-P-OH
SEQ ID NO: 27Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-OH
SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29Fmoc-K-I-A-Q(Trt)-OH
SEQ ID NO: 30Fmoc-I-Aib-L-D(
tBu)-OH
SEQ ID NO: 31Fmoc-S(
tBu)-D(
tBu)-Y(
tBu)-S(
tBu)-OH
SEQ ID NO: 32
TWI854284B_111131754_SEQL.xml
Claims (30)
- 一種下式之化合物
- 如請求項1之化合物，其中該化合物為
- 如請求項1之化合物，其中該化合物為
- 如請求項1之化合物，其中該化合物為
- 如請求項1之化合物，其中該化合物為
- 如請求項1之化合物，其中該化合物為
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中「m」為0、1、2或3，且「n」為1至50。
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中「m」為0、1、2或3，且「n」為1至10。
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中「m」為1且「n」為2、3、 4、5、6、7、8、9或10。
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該化合物用於液相合成。
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該液相合成為液相肽合成(LPPS)。
- 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該化合物為親水性的。
- 一種肽，其具SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23。
- 一種製備SEQ ID NO：2之肽之方法，其包含使用液相肽合成製備SEQ ID NO：1之肽，且接著用酸處理該製備之SEQ ID NO：1之肽以得到該SEQ ID NO：2之肽。
- 一種製備SEQ ID NO：4之肽之方法，其包含使用液相肽合成製備SEQ ID NO：3之肽，且接著用酸處理該製備之SEQ ID NO：3之肽以得到該SEQ ID NO：4之肽。
- 一種製備SEQ ID NO：7之肽之方法，其包含使用液相肽合成製備SEQ ID NO：6之肽，且接著用酸處理該製備之SEQ ID NO：6之肽以得到該SEQ ID NO：7之肽。
- 一種製備SEQ ID NO：10之肽之方法，其包含使用液相肽合成製備SEQ ID NO：9之肽，且接著用酸處理該製備之SEQ ID NO：1之肽以得到該SEQ ID NO：10之肽。
- 一種製備SEQ ID NO：13之肽之方法，其包含使用液相肽合成製備SEQ ID NO：11、12、14、15、16、17或18之肽，且接著用酸處理該製備之SEQ ID NO：11、12、14、15、16、17或18之肽以得到該SEQ ID NO：13之肽。
- 一種製備下式之化合物之方法：
- 如請求項19之方法，其包含：a.將Fmoc-AEEA-OH偶聯至如請求項1至12中任一項之連接子化合物上且使用鹼對所得產物去保護； b.將第二Fmoc-AEEA-OH偶聯至步驟a.之產物上且使用鹼對所得產物去保護；c.將Fmoc-Glu-OtBu偶聯至步驟b.之產物上且使用鹼對所得產物去保護；d.將20-(三級丁氧基)-20-側氧基二十烷酸偶聯至步驟c.之產物上；及e.用酸自步驟d.之產物移除該連接子化合物。
- 如請求項19之方法，其包含：a.將Fmoc-(AEEA)2-OH偶聯至如請求項1至12中任一項之連接子化合物上且使用鹼對所得產物去保護；b.將Fmoc-Glu-OtBu偶聯至步驟a.之產物上且使用鹼對所得產物去保護；c.將20-(三級丁氧基)-20-側氧基二十烷酸偶聯至步驟b.之所得產物上；及d.用酸自步驟c.之產物移除該連接子化合物。
- 如請求項19之方法，其包含：a.將Fmoc-(AEEA)2-OH偶聯至如請求項1至12中任一項之連接子化合物上且使用鹼對所得產物去保護；b.將(2S)-2-[(20-三級丁氧基-20-側氧基-二十醯基)胺基]戊二酸O1-三級丁酯O5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯偶聯至步驟a.之該所得產物上；及c.用酸自步驟b.之產物移除該連接子化合物。
- 一種化合物，其為
- 一種化合物，其為
- 一種化合物，其為
- 一種製備SEQ ID NO：20之肽之方法，其包含使SEQ ID NO：19之肽與SEQ ID NO：7之肽偶聯。
- 一種製備SEQ ID NO：22之肽之方法，其包含使SEQ ID NO：21之肽與SEQ ID NO：10之肽偶聯。
- 一種製備SEQ ID NO：22之肽之方法，其包含以下步驟：a.藉由使用如請求項1至12中任一項之化合物的液相肽合成製備SEQ ID NO：19之肽；b.將該SEQ ID NO：19之肽偶聯至SEQ ID NO：7之肽以生成SEQ ID NO：20之肽；c.對該SEQ ID NO：20之肽去保護以生成SEQ ID NO：21之肽；d.將SEQ ID NO：10之肽偶聯至該SEQ ID NO：21之肽；及e.對步驟d.之肽去保護以生成SEQ ID NO：22之肽。
- 如請求項28之方法，其進一步包含：f.藉由偶聯個別胺基酸、肽片段或其混合物延長步驟e.之SEQ ID NO：22之肽；g.用酸處理所得肽；及h.對該所得肽去保護。
- 一種製備SEQ ID NO：32之肽之方法，其包含以下步驟：a.將SEQ ID NO：24之肽偶聯至如請求項1至12中任一項之化合物且對所得肽去保護；b.將步驟a.之肽偶聯至SEQ ID NO：25之肽且對所得肽去保護；c.將步驟b.之肽與SEQ ID NO：26之肽偶聯且對所得肽去保護；d.將步驟c.之肽與SEQ ID NO：27之肽偶聯且對所得肽去保護；e.將步驟d.之肽與SEQ ID NO：28之肽偶聯且對所得肽去保護；f.將步驟e.之肽與SEQ ID NO：29之肽偶聯且對所得肽去保護；g.將步驟f.之肽與SEQ ID NO：30之肽偶聯且對所得肽去保護；及h.將步驟g.之肽與SEQ ID NO：31之肽偶聯且對所得肽去保護。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163260496P | 2021-08-23 | 2021-08-23 | |
| US63/260,496 | 2021-08-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202328055A TW202328055A (zh) | 2023-07-16 |
| TWI854284B true TWI854284B (zh) | 2024-09-01 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021143073A1 (zh) | 2020-01-19 | 2021-07-22 | 深圳市健元医药科技有限公司 | 一种索玛鲁肽的制备方法 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021143073A1 (zh) | 2020-01-19 | 2021-07-22 | 深圳市健元医药科技有限公司 | 一种索玛鲁肽的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Madsen et al., "Design and Combinatorial Development of Shield‑1 Peptide Mimetics Binding to Destabilized FKBP12", ACS Combinatorial Science, 2020, 22, pp 156-164. |
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