JP5366260B2 - 固相担持コバルト・カルボニル錯体を用いたタンパク質の精製方法 - Google Patents
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(1) 固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。
(2) 前記アルキンタグを有するリガンドと、前記タンパク質とを結合させるステップを含む、上記方法。
(3) 以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)固相担持コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む、上記方法。
(4) 以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、固相担持コバルト・カルボニル錯体とを反応させてリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iii)前記ステップ(ii)の前記リガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む上記方法。
(5) 以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体と固相に担持したホスフィンを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(v)ステップ(iv)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む上記方法。
(6) 洗浄を行うステップをさらに含む、上記方法。
により表されるものである、上記いずれかの方法。
により表される、タンパク質を精製するためのリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体。
により表される、固相担持コバルト・カルボニル錯体と、下記の式:
であるアルキンタグを有するリガンドとを含んでなる、タンパク質の精製用のキット。
本発明によれば、アルキンタグを有するリガンドとタンパク質を結合させて複合体を形成し、次いで該複合体中のアルキンタグを固相担持コバルト・カルボニル錯体と反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成し、これを利用することにより、目的のタンパク質を分離することができる。
本明細書において用いる「固相担持コバルト・カルボニル錯体」との用語は、固相に担持されたコバルト・カルボニル錯体をいう。コバルト・カルボニル錯体は固相に結合した配位子とコバルトカルボニルCo2(CO)8との反応によって生成されうる。配位子は固相に直接担持されてもよいし、又はスペーサーを介して担持されてもよいが、好ましくはスペーサーを介して固相に担持される。
低級アルコキシは、一般式−OR(ここでRは低級アルキル基である)で表される、置換された又は置換されていない、直鎖又は分枝鎖の酸素原子と結合した炭化水素をいう。代表的な低級アルコキシはC1〜C6アルコキシであり、限定するものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどである。
アシルは、一般式−C(=O)R(ここでRは低級アルキル基である)で表される、置換された又は置換されていない、直鎖又は分枝鎖の酸素原子と結合した炭化水素をいう。代表的なアシル基はC1〜C6アシルであり、限定するものではないが、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイルなどであり、
ヒドロキシは−OHであり、
ニトロは−NO2であり、
シアノ(ニトリル、カルボニトリル)は−CNであり、
アルキルオキシカルボニルは一般式−COOR、(ここでRはアルキル基である)である。アルキルオキシカルボニル基の例としては、−C(=O)OCH3、−C(=O)OCH2CH3などが挙げられるが、これらに限らない、
アミノは一般式−NR1R2で表され、ここでR1及びR2は独立に、アミノ置換基、例えば、水素、上記に定義したアルキル基又はアリール基であり、あるいは環式アミノ基の場合には、R1とR2は、それらが結合している窒素原子と一緒に4〜8個の環原子を有する複素環を形成する。アミノ基の例としては、−NHCH3、−NHCH(CH3)2、−N(CH3)2、−N(CH2CH3)2、及び−NHPhが挙げられ、環式アミノ基の例としては、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、モルホリノが挙げられるが、これらに限らない、
アミドは一般式−C(=O)NR1R2で表され、ここでR1及びR2は独立に、アミノ基について定義したようなアミノ置換基である。アミド基の例としては、限定するものではないが、−C(=O)NH2、−C(=O)NHCH3、−C(=O)N(CH3)2、−C(=O)NHCH2CH3、及び−C(=O)N(CH2CH3)2、並びに、R1及びR2が、それらの結合している窒素原子と一緒になって、複素環式構造を形成するアミド基、例えば、ピペリジノカルボニル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニルにおける前記アミド基が挙げられる。
本発明の固相担持コバルト・カルボニル錯体は、(Co2(CO)8)のコバルト・カルボニルと、固相に担持された配位子Lとを配位結合させることにより調製することができる。固相に担持された配位子と配位結合したコバルト・カルボニル錯体の例としては、(Co2(CO)8)とトリフェニルホスフィニル基との錯体が好ましい。
本明細書において用いる「アルキンタグを有するリガンド」との用語は、少なくとも1つのアルキンタグを有し、少なくとも1つのリガンドを有する化合物をいう。好ましくはアルキンタグを有するリガンドは、少なくとも1つの末端にアルキンタグを有し、少なくとも1つの別の末端にリガンドを有する、少なくとも2以上の末端を有する化合物である。
固相担持コバルト・カルボニル錯体とアルキンタグを有するリガンドとが結合した複合体は、上記固相担持コバルト・カルボニル錯体と、上記アルキンタグを有するリガンドとを反応させて形成させることができる(図1〜図3を参照されたい)。ここで、該複合体中のリガンドは目的タンパク質と結合したものであっても結合していないものであってもよい。固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとの反応は、コバルト・カルボニルとアルキンとの錯体形成反応に基づいている。反応条件は、0〜5℃の温度で上記の物質を好ましくは中性域のバッファー等の溶媒中で接触させることを含む。
本発明ではいずれのスキームでも実施可能である。
以下に、本発明の固相担持コバルト・カルボニル錯体を用いたタンパク質の精製方法の例を、図1、図2又は図3を参照しながら説明する。
以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)固相担持コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む、上記方法である(図1)。
以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、固相担持コバルト・カルボニル錯体とを反応させてリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iii)前記ステップ(ii)
の前記リガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む上記方法とすることができる(図2)。
以下のステップ(i)〜(v):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドと、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体と固相に担持したホスフィンとを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(v)ステップ(iv)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含む上記方法とすることができる(図3)。
以下の実施例は、例示のみを意図し、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って調製する。
IR (neat): 2077 (m), 2021(m), 1894 (s), 1955 (m), 1887 (vs) cm-1。
モデル化合物とタンパク質の組み合わせとして、ビオチン及びアビジンの組み合わせで精製操作を行うことにした。ビオチンにアルキンを導入した化合物7を以下のスキームに基づき合成した。
6-アミノヘキサン酸(656 mg, 5 mmol)を1N水酸化ナトリウム水溶液5 mLと1,4-ジオキサン10 mLの混合溶媒に溶かし、室温にて(Boc)2O(1.25 ml, 5.4 mmol)を加え撹拌した。4時間後、濃塩酸で中和し、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:ヘキサン=1:1)にて精製し、表題化合物4(1.19 g, 100%)を得た。
化合物4(120 mg, 0.52 mmol)、1−エチルー3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド・塩酸塩(120 mg, 0.63 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(90 mg, 0.67 mmol)をジクロロメタン5 mLで溶かし、ここに室温で1-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカ-1-アミン(110 μL, 0.5 mmol)を加え撹拌した。4時間後減圧下に溶媒を留去して、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=95:5)にて精製し、表題化合物5(184.9 mg, 86%)を得た。
化合物5(132 mg, 0.31 mmol)を3M塩酸メタノール溶液10 mLで溶かし、40 ℃で撹拌した。6時間後、反応液を炭酸水素ナトリウムのカラムに通し、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をジメチルホルムアミド8 mLに溶かし、ビオチン(90 mg, 0.37 mmol)、1−エチルー3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド・塩酸塩(90 mg, 0.47 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(62 mg, 0.46 mmol)を室温で加え撹拌した。12時間後減圧下に溶媒を留去して、得られた残渣を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール=1:0 → 6:1)にて精製し、さらに中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール=3:1)にて精製を行い、表題化合物6(113.8 mg, 67%)を得た。
化合物6(48 mg, 0.09 mmol)をメタノール溶液2 mLに溶かし、10% パラジウム‐炭素(10 mg)を加えた後、水素雰囲気下24時間撹拌した。反応液をセライトろ過し、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をジクロロメタン6 mLに溶かし、炭酸水素ナトリウム(165 mg, 2 mmol)及びプロパルギルクロロホルメート(1 mmol)を氷冷下加え、1時間撹拌した後に減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール=3:1)にて精製し、表題化合物7(15.7 mg, 30%)を得た。
可溶化バッファー(10 mM HEPES-Na, 0.5% Triton X-100, 150 mM NaCl, pH 7.0)0.5 mLに、アルキンタグ導入ビオチン7(2.5 nmol)及びFITC標識ニュートラアビジン(サーモフィッシャー社、2.5 nmol)を加え、4 ℃にて1時間転倒混和した。この混合液に実施例1で調整したPS-PEG担持コバルトモノホスフィン錯体(2)を添加し、4 ℃で3時間転倒混和した。その後、ビーズを可溶化バッファー0.5 mLで5回洗浄し、ビーズ上にニュートラアビジンを精製した。
Claims (6)
- 以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)固相担持コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。 - 以下のステップ(i)〜(iv):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのアルキンタグ部分と、固相担持コバルト・カルボニル錯体とを反応させてリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iii)前記ステップ(ii)の前記リガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体のリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。 - 以下のステップ(i)〜(v):
(i)アルキンタグを有するリガンドを用意するステップ、
(ii)前記アルキンタグを有するリガンドのリガンド部分と、該リガンドに結合可能であるタンパク質とを結合させてリガンド−タンパク質複合体を生成するステップ、
(iii)コバルト・カルボニル錯体と、前記ステップ(ii)の前記リガンド−タンパク質複合体のアルキンタグ部分とを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、
(iv)ステップ(iii)のリガンド−タンパク質複合体結合コバルト・カルボニル錯体と固相に担持したホスフィンを反応させてリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体を生成するステップ、及び
(v)ステップ(iv)のリガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体からタンパク質を解離するステップ
を含み、
該リガンド−タンパク質複合体結合固相担持コバルト・カルボニル錯体中のリガンド結合固相担持コバルト・カルボニル錯体が下記の式
により表されるものである、
固相担持コバルト・カルボニル錯体と、アルキンタグを有するリガンドとを用いることを特徴とするタンパク質の精製方法。 - 洗浄を行うステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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