NO147644B - Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre Download PDFInfo
- Publication number
- NO147644B NO147644B NO4429/73A NO442973A NO147644B NO 147644 B NO147644 B NO 147644B NO 4429/73 A NO4429/73 A NO 4429/73A NO 442973 A NO442973 A NO 442973A NO 147644 B NO147644 B NO 147644B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- enzyme
- penicillin
- complex
- solution
- deacylase
- Prior art date
Links
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 title claims description 35
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 60
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 60
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 32
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 32
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 22
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims description 3
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims description 3
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Substances [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D499/00—Heterocyclic compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. penicillins, penems; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
- C07D499/21—Heterocyclic compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. penicillins, penems; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a nitrogen atom directly attached in position 6 and a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D499/42—Compounds with a free primary amino radical attached in position 6
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/813—Continuous fermentation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av 6-aminopenicillansyre (i det følgende betegnet 6-APA).
Det er velkjent at 6-APA kan fremstilles ved innvirkning
på et penicillin av enzymer som spalter amidbindingen i penicillinet. De enzymer som er kjent for å spalte denne amidbind-ing, skal i det følgende betegnes penicillin-deacylase-enzymer, selv om de også kan beskrives som penicillinamidaser.
Det er kjent å binde penicillin-deacylase-enzymer til vann-uløselige polymere materialer, hvorved det produseres et vannuløselig enzymkompleks som bevarer sin penicillin-deacylase-aktivitet. Slike uløselige enzymkomplekser er verdifulle ved det at det resulterende 6-APA er praktisk talt fritt for enzym.
I tillegg kan enzymkomplekset lett lagres og transporteres.
Det er også kjent at vannløselige enzymkomplekser kan fremstilles ved å binde enzymer til vannløselige polymere materialer. Imidlertid er det hittil ikke blitt foreslått å anvende et penicillin-deacylase-enzym på denne måte. Dette er utvilsomt på grunn av at man tror at et slikt kompleks ikke lett kunne separeres og gjenvinnes for bruk om igjen ut fra den vandige reaksjons-blanding som er anvendt for produksjon av 6-APA, og at bruk av et slikt enzym på denne måte sannsynligvis ikke ville være kommersielt mulig.
Det har nå vist seg at penicillin-deacylase-enzymer kan bindes til vannløselige polymere materialer for frembringelse av vannløselige enzymkomplekser og at slike komplekser bevarer deacylase-aktiviteten til det frie enzym. Videre har det også vist seg at når et slikt enzymkompleks anvendes ved fremstilling av 6-aminopenicillansyre, kan mer konsentrerte løsninger anvendes enn med de vann-uløselige komplekser, og dette fører til de økonomiske fordeler ved større kapasitet eller muligheten til å bruke et kjemisk anlegg av mindre størrelse. Videre har det vist seg at det vannløselige enzymkompleks kan separeres fra den vandige løsning av 6-APA som er produsert, ved anvendelse av ultrafiltreringsteknikker. Dette etterlater den vandige løsning av 6-APA, og eventuelt uomsatt penicillin fra hvilket 6-APA lett kan isoleres ved konsentrering av løsningen, fulgt av justering av pH-verdien til ca. det isoelektriske punkt på 4,3. Det sepa-rerte enzymkompleks er fremdeles i vandig løsning og viser seg å bevare sin deacylase-aktivitet i høy grad. Disse r.^ egenska-per gjør det mulig å anvende det om igjen yten ytterligere be-handling. Videre tillater disse enzymkomplekser fremstilling av 6-APA i løsninger med høyere konsentrasjon. Således gjør fore-liggende oppfinnelse det mulig å produsere 6-APA på en økonomisk måte, spesielt ved en kontinuerlig prosess som hele tiden utføres i et homogent vandig miljø.
Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av 6-aminopenicillansyre, og denne fremgangsmåte omfatter å bringe benzylpenicillin eller fenoksymetylpenicillin eller et salt derav, i vandig løsning som holdes på
en pH-verdi i området 6,0-9,0, i kontakt med et kompleks av penicillin-deacylase-enzym som er bundet til et polymert materiale .
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er karakterisert ved at det anvendes et vannløselig kompleks av penicillin-deacylase-enzym og en sukrose/epiklorhydrin-kopolymer, og at enzymkomplekset separeres fra reaksjonsblandingen ved en ultrafiltreringsteknikk, 6-aminopenicillansyren som er dannet, utvinnes fra permeatløsningen, eventuelt etter at denne er ført gjennom et annet reaktorkar og deretter til en annen ultrafiltreringsenhet, og det nevnte enzymkompleks brukes om igjen ved at det bringes i kontakt med en ytterligere mengde av penicillinet.
Deacylase-enzymet for bruk i forbindelse med oppfinnelsen oppnås fortrinnsvis fra bakterier, for eksempel stammer av Escherichia coli, når det anvendes for spalting av benzylpenicillin; eller fra sopp eller actinomycetes når det anvendes for spalting av fenoksymetylpenicillin. Slike enzymer er generelt velkjente. De anvendes ved fremstilling av 6-APA i pH-området 6,0-9,0, fortrinnsvis ved pH 7,0-8,5. Siden deacylering av et penicillin resulterer i frigjøring av en fri syre fra peni-cillinsidekjeden, er det nødvendig å opprettholde det ovenfor nevnte pH-område under prosessen for fremstilling av 6-APA, om nødvendig ved tilsetning av et alkali, for eksempel en løsning av natrium- eller ammoniumhydroksyd eller trietylamin.
En spesielt nyttig polymer av denne type er en som
er kommersielt tilgjengelig under handelsbetegnelsen "FICOLL", som er en sukrose/epiklorhydrin-kopolymer. En "FICOLL"-polymer med en molekylvekt på ca. 400 000 har vist seg å være spesielt
godt egnet. Anvendelsen av polymerer av denne type gir et vann-løselig penicillin-deacylase-enzym med høy aktivitet. Imidlertid, og av større viktighet, har slike enzymkomplekser spesielt lav viskositet, og dette gjør at de er lettere å separere ved
hjelp av ultrafiltreringsteknikker fra reaksjonsblandingen hvor de er blitt anvendt for fremstilling av 6-APA; og derfor kan de separeres på en mer bekvem måte og resirkuleres for bruk om igjen.
De vannløselige enzymkomplekser for anvendelse i forbindelse med oppfinnelsen kan fremstilles ved hvilken som helst av de kjente metoder for binding av enzymer til polymerer, for-utsatt at det resulterende kompleks kan ansees som vannløselig. Bruken av betegnelsen "vannløselig" betyr her at enzymkomplekset er løselig eller dispergerbart i vann slik at man får en ekte eller kolloidal løsning av minst 0,1 gram pr. liter ved pH 7,8.
Penicillin-deacylase-enzymet kan bindes til polymeren i et stort område av vektforhold, f.eks. innen vektforholdet polymer-.enzym på 0,1 til 100:1. Imidlertid foretrekkes det å anvende polymeren og enzymet i et vektforhold polymer:protein i området 2;1 til 20:1.
Etter fremstillingen kan det vannløselige enzymkompleks gjerne renses før bruk ved ultrafiltrering eller ved gelgjennom-trengningskromatografi, f.eks. på "Sephadex G-100".
De vannløselige enzymderivater som anvendes i henhold til oppfinnelsen bevarer aktiviteten til mor-deacylase-enzymet og kan således brukes i satsvise eller kontinuerlige prosesser for fremstilling av 6-APA.
En integrerende del av det anlegg som anvendes for fremstillingen av 6-APA under anvendelse av de her beskrevne komplekser er en ultrafiltreringsinnretning. Dette innebærer anvendelse av en semi-permeabel membran som har grenser for ute-stengning som tillater passasje av lavmolekylære substanser, men hindrer passasje av høymolekylære substanser. Utestengnings-grensen velges i henhold til molekylvekten til enzymkomplekset. Det velges å tillate passasje av 6-APA, men å ekskludere enzym/- polymerkomplekset, hvorved dette kan gjenvinnes for bruk om igjen.
Ved ultrafiltreringsteknikken gjenvinnes det vannløse-lige kompleks i vandig løsning, og dette kan bli resirkulert direkte for bruk om igjen. Rensning av enzymkomplekset før bruk om igjen er vanligvis ikke nødvendig.
En spesielt godt egnet metode som kan anvendes for den kontinuerlige fremstilling av 6-APA skal nå beskrives under hen-visning til den ledsagende tegning, som er en skjematisk presen-tasjon av et kjemisk anlegg som er egnet for ovennevnte formål.
En reaktortank 1 er forsynt med en rører 2 og en kappe gjennom hvilken vann med bestemt temperatur strømmer fra innløpet 3 til utløpet 4. Karet inneholder et pH-responderende element 5
som ved hjelp av en regulator 6 driver en kran 7 i en mateledning
8 gjennom hvilken en alkalisk løsning mates for opprettholdelse
av pH-verdien til innholdet i karet 1 på et forutbestemt nivå. Inn i reaktortanken 1 kan en løsning av penicillinet pumpes via pumpen 9 inn i rørledningen 10 fra en lagringstank 11 som er utstyrt med en rører 12, idet tanken 11 også er utstyrt med en vann-kappe med innløp 13 og utløp 14 gjennom hvilket vann kan strømme for å justere penicillinløsningen til den ønskede reaksjonstempe-ratur.
Reaksjonsblandingen kan tappes ut av reaktortanken 1 gjennom en ledning 15 og pumpes ved hjelp av en pumpe 16 inn i en ultrafiltreringsenhet 17. Den tilbakeholdte løsning fra enheten returneres via ledning 18 til reaktortanken 1.
Permeatløsningen fra ultrafiltreringsenheten 17 kan føres direkte til en gjenvinningsenhet (ikke vist) hvor den 6-APA som har dannet seg, kan separeres som et krystallinsk, fast stoff etter konvensjonell konsentrering av løsningen og pH-justering mot det isoelektriske punkt for 6-APA. Imidlertid passerer permeatløsningen fortrinnsvis fra enheten 17 via ledning 19 til en annen reaktortank 20, utstyrt som reaktortank 1 med en vann-kappe med innløp 21 og utløp 22, en rører 23, et pH-responderende element 24 og en pH-reguleringsenhet 25 som aktiverer en kran 26
i en alkalimateledning 27. Fra den annen reaktortank 20 tappes reaksjonsblandingen ut gjennom ledning 28 ved hjelp av en pumpe
29 inn i en annen ultrafiltreringsenhet 30 fra hvilken den tilbakeholdte løsning resirkuleres via ledning 31 til den annen reaktortank 20 og permeatløsningen passerer via ledning 32 til en gjenvinningsenhet (ikke vist) hvor det fremstilte 6-APA ut-
vinnes som beskrevet ovenfor.
Ved en slik fremgangsmåte anvendes fortrinnsvis en
løsning av benzylpenicillin på ca. 7 vekt/volum%-konsentrasjon sammen med tilstrekkelig av enzymkomplekset til å nedbryte ca. 90 % av penicillinet i løpet av 3 timer. Reaksjonsblandingen tappes ut fra tank 1, og frisk penicillinløsning pumpes inn i denne fra tank 11 i regulerte hastigheter, slik at den gjennom-snittlige oppholdstid for løsningen i reaktoren er ca. 3 timer. Således tillates innholdet i tank 1 å reagere i 3 timer før noe tappes ut via ledning 15 og frisk løsning får strømme inn via ledning 10. I den annen reaktortank 20 reguleres den gjennomsnitt-lige oppholdstid ved hjelp av pumpene 16 og 29 til ca. 1 time, som er tilstrekkelig til å sikre nedbrytning av eventuelt penicillin som er igjen i uomsatt tilstand i første reaktortank 1 og som passerer med den produserte 6-APA gjennom den første ultrafiltreringsenhet 17.
I det ovenfor beskrevne kjemiske anlegg kan reaktor-
karene om ønskes erstattes av en rekke med rørformede reaktorer som er utstyrt med kappe, og utstyrt for sekvensiell tilsetning av alkaliløsning etterhvert som reaksjonsblandingen passerer gjennom dem.
Denne kontinuerlige reaksjon er spesielt lett å ut-
føre med en sukrose/epiklorhydrin-kopolymer, på grunn av den lave viskositet som deres løsninger har, hvilket gjør det mulig å utføre ultrafiltreringstrinnene uten medfølgende teknologiske problemer.
Oppfinnelsen skal illustreres ved eksempler, hvor aktiviteten er uttrykt i mikromol 6-aminopenicillansyre frem-
stilt fra benzylpenicillin ved pH 7,8 og 37°C pr. minutt pr. gram eller ml preparat.
Eksempel !_
5g "Ficoll", som er en sukroseepiklorhydrinkopolymer
med molekylvekt 400.000, ble oppløst i 165 ml vann og pH-verdien justert til 10,0 med 2n NaOH. 400 mg cyanogenbromid ble tilsatt
til "Ficoll"-løsningen og løsningen omrørt magnetisk, idet temperaturen ble holdt på 2 0°C. pH-verdien ble holdt på 11,0 ved tilsetning av 2n NaOH. 20 minutter etter tilsetningen av cyanogen-bromidet ble løsningen justert til pH 8,5 med 2n HC1 og blandet med 170 ml av en vandig løsning av penicillin deacylase (560 mg protein) som hadde en slik aktivitet at den vil produsere 6,9 mikromol 6-APA pr. milligram protein pr. minutt ved pH 7,8 og 37°C. Løsningen ble .omrørt natten over ved 4°C og ble så konsentrert ved ultrafiltrering gjennom en "XM-300" Amicon membran.
Denne membran hadde en nominell molekylvekt-avkutting på 300.000. Den tilbakeholdte løsning i ultrafiltreringcellen, som inneholdt "Ficoll"-penicillindeacylasekomplekset, ble vasket. Volumet av den tilbakeholdte løsning ble deretter redusert til 44 ml, og produktet ble lagret ved 4°C. Den tilbakeholdte løsning hadde en viskositet lik viskositeten for det native enzym. Aktiviteten til "Ficoll"-penicillin-deacylasekomplekset ble bestemt på følgende måte: En fosfatpuffer (15 ml:0,2m) og benzyl-penicillin-løsning (5 ml 20 vekt/volum%) fikk stabilisere seg ved 37°C til pH 7,8 ved tilsetning av 0,ln NaOH. Enzymløsningen (2 ml) ble tilsatt for igangsetting av reaksjonen. Reaksjonsblandingens pH-verdi ble holdt på pH 7,8 ved tilsetning av 0,ln NaOH. Reaksjonen ble fortsatt i 20 minutter og avlesninger foretatt hvert minutt.
Under anvendelse av denne fremgangsmåte viste det seg
at "Ficoll"-penicillin-deacylaseenzymkomplekset beholdt 86,2% av aktiviteten til det native enzym. Proteininnholdet til "Ficoll"-penicillindeacylaseenzymkomplekset ble bekreftet ved metoden til Lowry, Rosebrough, Farr og Randall (1951). Under anvendelse av denne fremgangsmåte viste det seg at det totale koplingsutbytte var 87,1%.
Eksempel 2.
Eksempel 1 ble gjentatt, men pH-verdien som koplingen fant sted ved mellom penicillin-deacylasen og det aktiverte "Ficoll" var snarere 10,o enn 8,5. Volumet til sluttproduktet var 40 ml.
Det totale koplingsutbytte, basert på protein tilbakeholdt i ultrafiltreringsretentatet, var 78,5 %. Enzym-aktiviteten som var i behold, var 74,8 %.
Eksempel 3
Eksempel 1 ble gjentatt igjen, men pH-verdien som koplingen fant sted ved mellom penicillin-deacylasen og det aktiverte "Ficoll" var snarere 6,0. Volumet til sluttproduktet var 35 ml. Det totale koplingsutbytte, basert på protein tilbakeholdt i ultrafiltreringsretentatet, var 68 %. Enzym-aktiviteten som var i behold, var 56,7 %.
Eksempel 4
Studier angående muligheten for fornyet anvendelse
Løsning av "Ficoll"-penicillin-deacylasekompleks (se aks.l) (4 ml = 44,4 mg protein) - ble satt til en løsning av 6,3 g kaliumbenzylpenicillin i vann og omrørt ved 37°C. pH-verdien til reaksjonsblandingen ble holdt konstant på 7,8 ved kontinuerlig tilsetning av 0,ln NaOH under anvendelse av et titrimeter. Reaksjonen var fullstendig etter ca. 4 timer, men den ble fortsatt i 6 timer. Opptaket av 0,ln NaOH indikerte at utbyttet av 6-APA var 96,2 % av det teoretiske. Enzymet ble separert fra reaktantene med liten molekylvekt ved ultrafiltrering .gjennom en membran med molekylvektavkutting på 50 000. Etter vask av enzymet i ultrafiltreringscellen med destillert vann ble enzympolymeren igjen utsatt for ultrafiltrering inn-til volumet var redusert til 150 ml. Retentatet ble brukt om igjen for omdannelse av en ytterligere porsjon på 6,3 g kal-siumbenzylpenicillin, som ble omdannet til 6-APA med en effektivitet på 96,5 %. Hele syklusen ble gjentatt enda tre ganger, og utbyttene av 6-APA var 92,0, 96,0 og 91,0 % av den teoretiske verdi.
Eksempel 5
18,5 ml av det "Ficoll"-penlcillindeacylasekompleks
som er beskrevet i eksempel 1, ble blandet opp til
400 ml med destillert vann og omrørt ved 37°C og pH 7,8. 25 g kaliumbenzylpenicillin ble tilsatt, og pH-verdien ble holdt konstant ved 7,8 ved kontinuerlig tilsetning av 10m NH4OH. Reaksjonen ble fortsatt i 4 timer. Enzymet ble separert fra reaktantene med liten molekylvekt ved dialyse mot destillert vann under anvendelse
av en hulfiber-dialysator (modell "DC2", Amicon Corporation, Lexington, Mass. USA) med en dialysepatron med molekylvektav-
kutting på 50.000. Enzymløsningen ble deretter, konsentrert til omtrent 100 ml. Dialysatorenheten ble så vasket med 2 x 100 ml alikvoter av destillert vann, og disse ble slått sammen med enzym-løsningen og lagret ved 4°C mellom hvert forsøk.
Syv påfølgende forsøk ble utført, og effektiviteten med hvilken kaliumbenzylpenicillin ble hydrolysert til 6-APA, var 93,2%. Effektiviteten for enzymgjenvinningen var 99,6%, hvorav 2,5% gikk tapt i prøver som ble tatt under hvert forsøk. Friskt enzym ble tilsatt før hvert forsøk for å kompensere for eventuelle tap.
Eksempel 6
En enzymisk hydrolyse av kaliumbenzylpenicillin under anvendelse av et "Ficoll"-penicillin-deacylasekompleks ble utført etter den metode som er beskrevet i eksempel 5. Reaksjonen ble fortsatt i 4 timer ved pH 7,8 og 37°C. Enzymet ble separert fra reaktantene med lav molekylvekt på følgende måte: Volumet av reaksjonsblandingen ble redusert til omtrent 40 ml ved ultrafiltrering gjennom en hulfibermembran med molekylvekt-avkutting på 50.000. 20 ml destillert vann ble tilsatt til konsentratet, og konsentrerings-prosessen ble gjentatt. De 2 alikvoter med væske ble slått sammen,
og volumet ble redusert til 120 ml i en roterende inndamper ved 35°C. Samme volum av metylisobutylketon (MIBK) ble tilsatt til konsentratet, og blandingen ble rørt kraftig i et avkjølt metall-kar. Da temperaturen var falt til 4°C, ble saltpetersyre tilsatt langsomt til pH-verdien var 4,3. Omrøringen ble fortsatt i ytterligere 30 minutter. Det utfelte 6-APA ble gjenvunnet ved filtrering» vasket med MIBK, vann og aceton og tørket natten over ved 37°C.
Eksempel 7
En enzymisk hydrolyse av kaliumbenzylpenicillin ble utført generelt som beskrevet i eksempel 5, men ved en øket konsentrasjon av kaliumbenzylpenicillin (dvs. 9vekt/volum%) under anvendelse av 27 g substrat i et reaksjonsvolum på 300 ml, og hvor enzymkonsentrasjonen var det dobbelte av den som ble brukt i eksempel 5. Reaksjonen ble fortsatt i 4 timer ved pH 7,8 og 37°C, og fra denne ble 6-APA produsert med en effektivitet på 93,2%.
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av 6-aminopenicillansyre omfattende å bringe, i vandig løsning ved en pH-verdi i området 6,0 til 9,0, benzylpenicillin eller fenoksymetylpenicillin eller et salt derav i kontakt med et kompleks av penicillin-deacylase-enzym bundet til et polymert materiale, karakterisert ved at det anvendes et vannløse-lig kompleks av penicillin-deacylase-enzym og en sukrose/epiklor-hydrin-kopolymer, og at enzymkomplekset separeres fra reaksjonsblandingen ved en ultrafiltreringsteknikk, 6-aminopenicillansyren som er dannet, utvinnes fra permeatløsningen, eventuelt etter at denne er ført gjennom et annet reaktorkar og deretter til en annen ultrafiltreringsenhet, og det nevnte enzymkompleks brukes om igjen ved at det bringes i kontakt med en ytterligere mengde av penicillinet .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB5382272A GB1449808A (en) | 1972-11-21 | 1972-11-21 | 6-aminopenicillanic acid preparation |
| GB4454273 | 1973-09-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO147644B true NO147644B (no) | 1983-02-07 |
| NO147644C NO147644C (no) | 1983-05-18 |
Family
ID=26265415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO4429/73A NO147644C (no) | 1972-11-21 | 1973-11-19 | Fremgangsmaate for fremstilling av 6-amino-penicillansyre |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3887432A (no) |
| JP (1) | JPS5646840B2 (no) |
| AR (1) | AR198122A1 (no) |
| AT (1) | AT324565B (no) |
| CA (1) | CA1061266A (no) |
| CH (1) | CH587266A5 (no) |
| DE (1) | DE2356630A1 (no) |
| DK (1) | DK139778B (no) |
| ES (1) | ES420695A1 (no) |
| FI (1) | FI50882C (no) |
| FR (1) | FR2217348B1 (no) |
| GB (1) | GB1449808A (no) |
| HU (1) | HU169168B (no) |
| IE (1) | IE38588B1 (no) |
| IL (1) | IL43590A (no) |
| NL (1) | NL7315887A (no) |
| NO (1) | NO147644C (no) |
| PH (1) | PH12447A (no) |
| PL (1) | PL86995B1 (no) |
| SE (1) | SE418197B (no) |
| YU (1) | YU298573A (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1463513A (en) * | 1974-08-13 | 1977-02-02 | Beecham Group Ltd | Enzymes |
| DE2703703A1 (de) * | 1977-01-29 | 1978-08-03 | Dynamit Nobel Ag | Traegergebundene acylasen |
| US4670397A (en) * | 1986-02-05 | 1987-06-02 | Phillips Petroleum Company | Fermentation apparatus |
| EP0455757B1 (en) * | 1989-08-04 | 1999-03-31 | GRANDICS, Peter | An integrated cell culture-protein purification system for the automated production and purification of cell culture products |
| US5500352A (en) * | 1993-03-24 | 1996-03-19 | Sepracor, Inc. | Membrane filtration process for 6-aminopenicillanic acid |
| ES2105988B1 (es) * | 1996-03-15 | 1998-07-01 | Antibioticos Sa | Procedimiento para purificar 7-sustituido-amino-desacetoxi-cefalosporinas mediante el empleo de membranas de filtracion. |
| ES2105989B1 (es) * | 1996-03-15 | 1998-07-01 | Antibioticos Sa | Procedimiento alternativo para la obtencion del acido 6-amino penicilanico (6-apa). |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3649457A (en) * | 1968-09-27 | 1972-03-14 | Monsanto Co | Enzymatic processing with polymer-enzyme product |
| US3625827A (en) * | 1968-09-27 | 1971-12-07 | Monsanto Co | Water-soluble polymer-enzyme products |
| US3736230A (en) * | 1969-02-17 | 1973-05-29 | P Delin | Process for producing 6-amino-penicillanic acid |
-
1972
- 1972-11-21 GB GB5382272A patent/GB1449808A/en not_active Expired
-
1973
- 1973-10-29 IE IE1946/73A patent/IE38588B1/xx unknown
- 1973-11-07 IL IL43590A patent/IL43590A/en unknown
- 1973-11-09 FR FR7339869A patent/FR2217348B1/fr not_active Expired
- 1973-11-12 PH PH15213A patent/PH12447A/en unknown
- 1973-11-13 CA CA185,658A patent/CA1061266A/en not_active Expired
- 1973-11-13 DE DE2356630A patent/DE2356630A1/de not_active Withdrawn
- 1973-11-14 AR AR250985A patent/AR198122A1/es active
- 1973-11-14 US US415688A patent/US3887432A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-11-16 FI FI733557A patent/FI50882C/fi active
- 1973-11-19 SE SE7315613A patent/SE418197B/xx unknown
- 1973-11-19 AT AT968373A patent/AT324565B/de not_active IP Right Cessation
- 1973-11-19 NO NO4429/73A patent/NO147644C/no unknown
- 1973-11-19 YU YU02985/73A patent/YU298573A/xx unknown
- 1973-11-20 PL PL1973166643A patent/PL86995B1/pl unknown
- 1973-11-20 DK DK625873AA patent/DK139778B/da unknown
- 1973-11-20 NL NL7315887A patent/NL7315887A/xx not_active Application Discontinuation
- 1973-11-20 ES ES420695A patent/ES420695A1/es not_active Expired
- 1973-11-21 JP JP13114073A patent/JPS5646840B2/ja not_active Expired
- 1973-11-21 HU HUBE1183A patent/HU169168B/hu unknown
- 1973-11-21 CH CH1636273A patent/CH587266A5/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5646840B2 (no) | 1981-11-05 |
| NO147644C (no) | 1983-05-18 |
| IL43590A0 (en) | 1974-03-14 |
| FI50882B (no) | 1976-04-30 |
| PL86995B1 (no) | 1976-06-30 |
| DK139778B (da) | 1979-04-17 |
| ES420695A1 (es) | 1976-07-16 |
| FI50882C (fi) | 1976-08-10 |
| FR2217348B1 (no) | 1980-02-15 |
| HU169168B (no) | 1976-10-28 |
| GB1449808A (en) | 1976-09-15 |
| CA1061266A (en) | 1979-08-28 |
| FR2217348A1 (no) | 1974-09-06 |
| AU6217873A (en) | 1975-05-08 |
| DE2356630A1 (de) | 1974-05-22 |
| IE38588B1 (en) | 1978-04-12 |
| NL7315887A (no) | 1974-05-24 |
| JPS4993588A (no) | 1974-09-05 |
| AT324565B (de) | 1975-09-10 |
| AR198122A1 (es) | 1974-05-31 |
| IL43590A (en) | 1976-08-31 |
| IE38588L (en) | 1975-05-21 |
| PH12447A (en) | 1979-03-08 |
| YU298573A (en) | 1982-06-30 |
| SE418197B (sv) | 1981-05-11 |
| DK139778C (no) | 1979-09-17 |
| CH587266A5 (no) | 1977-04-29 |
| US3887432A (en) | 1975-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102639722B (zh) | 糖液的制造方法 | |
| US5869297A (en) | Nanofiltration process for making dextrose | |
| KR20100024915A (ko) | 유산의 제조 방법 | |
| NO147644B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av 6-aminopenicillansyre | |
| JP2000281638A (ja) | 尿素の分離方法 | |
| PT104149A (pt) | Processo de co-produção de quitina, seus derivados e polímeros contendo glucose, manose e/ou galactose, por cultivo da levedura pichia pastoris | |
| JPS59113889A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物菌体の製造方法 | |
| FI79558C (fi) | Foerfarande foer isomerisering av glukos till fruktos. | |
| US5756715A (en) | Process for making crystalline iron dextran | |
| EP1554391B1 (en) | Separation of biomass from lactic acid containing fermentation products by means of flocculation | |
| US4374981A (en) | Ultrafiltration of fermentation broth containing nucleosides to separate inosine and guanosine from the broth | |
| US20240262858A1 (en) | Scalable production of polyribonucleotides of controlled size | |
| CN112607890B (zh) | 一种含钙、镁离子高含盐水零排放水处理工艺 | |
| CN100594967C (zh) | 从发酵液中分离多价离子和乳酸根离子的方法 | |
| CN108084209B (zh) | 从酶法合成β-内酰胺类抗生素母液中回收β-内酰胺类抗生素的方法 | |
| CN113443766A (zh) | 一种明胶废水处理方法及处理系统 | |
| CN217781042U (zh) | 一种氨基酸发酵液的提取装置 | |
| EP1041065A1 (en) | Method for isolating urea using membranes and compositions thereof | |
| JPS5867184A (ja) | アスパルタ−ゼの製造法 | |
| CN113354702B (zh) | 一种高纯nadp的分离提纯工艺 | |
| EP0725847B1 (en) | A process for the production of water-soluble salts of carboxylic and amino acids | |
| Kusaoke et al. | UTILIZATION OF PARTIALLY N-AND O-ACYLATED; CHITOSAN GELS AS SUPPORTS FOR THE IMMOBILIZATION OF INVERTASE | |
| JPS61277695A (ja) | フラクトオリゴ糖の製造方法 | |
| JPH01317391A (ja) | Ｄ―β―ヒドロキシアミノ酸を取得する方法 | |
| RU1772159C (ru) | Способ получени дубильного экстракта из таннидсодержащего сырь |