Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego zwanego dalej 6-APA.Znane jest, ze pewne enzymy zdolne sa do rozszczepiania wiazania amidowego w penicylinach. Takie enzymy sa cenne dla przemyslowego wytwarzania 6-APA z naturalnie wystepujacych penicylin uzyskiwanych w procesach fermentacyjnych.Obecnie stwierdzono, ze w procesie wytwarzania 6-APA mozna stosowac pewne nierozpuszczalne w wodzie kompleksy enzym-polimer, które nie tylko maja bardzo korzystna aktywnosc enzymatyczna ale takze bardzo dobra stabilnosc mechaniczna i chemiczna. Z powodu tak dobrej aktywnosci enzymatycznej, kompleksy takie sa bardzo wydajne przy konwersji naturalnych penicylin do 6-APA, a ze wzgledu na stabilnosc mechaniczna i chemiczna takie kompleksy moga byc wielokrotnie stosowane bez straty enzymatycznej aktywnosci. Dzieki temu sposób wedlug wynalazku jest duzo efektywniejszy od znanych sposobów wytwarzania 6-APA.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie kwas 6-aminopenicylanowy przez reakcje benzylopenicyliny lub fenoksypenicyliny albo ich soli w wodnym roztworze przy pH w granicach 6,0-9,0, z nierozpuszczalnym w wodzie kompleksem enzym-substrat skladajacym sie z enzymu zwanego penicylinaza, zaadsorbowanego na substracie, którym jest nierozpuszczalny w wodzie polimer, zwiazany poprzecznie czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal i aldehyd mrówkowy, przy czym, substratem tym jest nierozpuszczalny w wodzie polimer lub kopolimer kwasu metakrylowego.Wymienione wyzej kompleksy otrzymuje sie przez adsorpcje enzymu - penicylinazy na nierozpuszczalnym w wodzie polimerze lub kopolimerze kwasu metakrylowego, a nastepnie, reakcje z czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal i aldehyd mrówkowy.Stosowany w niniejszym sposobie wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny enzym-acylaze korzystnie jest uzyskiwac z bakterii, takich jak szczepy Escherichia coli lub, w przypadku stosowania jako substancji wyjsciowej fenyloksymetylopenicyliny — z nizszych roslin zarodnikowych lub promieniowców.Aktywnosc enzymatyczna deacylazy okresla sie zwykle na podstawie zdolnosci do wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny. Tak wiec, aktywnosc enzymów decylazy oznacza sie jako ilosc 6-APA (w mikromolach-/im)2 94 970 uzyskana w ciagu minuty z roztworu benzylopenicyliny o pH 7,8 i temperaturze 37 C, przypadajaca na miligram biafka zawartego w enzymie. Zawartosc bialka w enzymie oznacza sie standardowa metoda Lowry'ego.Aktywnosc enzymatyczna kompleksów enzym-substrat wedlug wynalazku oznacza sie w podobny sposób jako Posc 6-APA (w/im) wytworzona w ciagu minuty z roztworu benzylopenicyliny o pH 7,8 i temperaturze 37°C, przypadajaca na gram kompleksu enzym-substrat.Jak stwierdzono, wydajnosc adsorpcji, reakcji wiazania poprzecznego, oraz aktywnosc wytworzonego, nierozpuszczalnego w wodzie kompleksu enzym-substrat wzrasta w przypadku gdy uzywa sie czystszego enzymu wyjsciowego. Jednakze, z uwagi na to iz niektóre korzysci wynikajace z uzycia czystszego enzymu wyjsciowego rosna wolniej niz wynikaloby to ze wzrostu czystosci uzytego enzymu, oraz z uwagi na ograniczenia zwiazane z ekonomia procesu, uzywa sie deacylazy o czystosci w granicach od 0,15 do 50 mikromoli/min/mg bialka zawartego w enzymie, a korzystnie w granicach od 1,5 do 30 mikromoli/min/mg bialka.Korzystne jest zwiekszenie czystosci enzymu przed adsorpqa i reakcja wiazania poprzecznego. Mozna to ^uzysftpc TiaiJjtJtize ultrafiltracji lub ogrzewania roztworu enzymu w ciagu krótkiego czasu, np. w ciagu okolo 30 fminut, wlemperaturze okolo 50°C. Inne, typowe sposoby oczyszczania enzymu to stracanie frakcjonowane lub "obróbka przy pomocy jonowymiennych celuloz lub Sephadex'u. f &^^ wedlug wynalazku substratem sa polimery lub kopolimery kwasu metakrylowego. Zawieraja ipna .whllieyupy karboksylowe, co powoduje, ze polimer ten ma charakter kwasowy. Jako substraty preferowane saf raczej makroporowate polimery i kopolimery kwasu metakrylowego niz zele dimerów i kopolimerów tego kwasu.Jest rzecza pozadana, by polimery kwasu metakrylowego byly nierozpuszczalne w wodzie oraz by posiadaly postac kopolimerów usieciowanych. Jako przyklady takich polimerów moga sluzyc kopolimery kwasu metakrylowego z dwuwinylobenzenem lub dwuestry kwasu metakrylowego z glikolem, np. dwumetakry- lan glikolu etylenowego. Do wytwarzania powyzszych kopolimerów mozna równiez uzywac innych komonome- rów, takich jak estry kwasu metakrylowego.Jedna z korzysci wynikajacych z niniejszego wynalazku jest to, iz mozna uzywac jako substratów takich polimerów które sa produktami handlowymi stosowanymi do róznych celów, zwlaszcza jako kationity o charakterze slabo kwasnym. Szczególnie prz/datny jest tu kopolimer kwasu metakrylowego i dwuwinylobenze- nu sprzedawany przez f-me Rohm and Haas Co. ze Stanów Zjednoczonych AP pod nazwa Amberlite IRC-50, oraz kopolimer kwasu metakrylowego sprzedawany dawniej przez f-me Permutit Co. Ltd. pod nazwa Zeokarb 227. Ten ostatni jest kopolimerem dwuwinylobenzenu i kwasu metakrylowego zawierajacym równiez pewna ilosc grup benzenosulfonylowych.Polimery bedace substratami w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie korzystnie w postaci drobnoziarnis¬ tej tj. zawierajacej czastki o takich rozmiarach, by przechodzily przez sito 10 ASTM, a wiec, czastki o srednicach ponizej 2,0 mm. Jednakze, uzyskiwany sposobem wedlug wynalazku kompleks enzym-substrat powinien posiadac czastki o wiekszych rozmiarach, w przeciwnym razie nie móglby byc wydzielany z mieszaniny poreakcyjnej na drodze odsiewania, lub stosowany w reaktorze kolumnowym. Tak wiec, polimer powinien skladac sie z czastek o wymiarach wiekszych od 0,01 mm tj. powinien byc w calosci zatrzymywany na sicie 800*ASTM. Wybór odpowiedniego rozmiaru czastek z podanego wyzej zakresu zalezec bedzie od rodzaju stosowanego reaktora.Acylaza przygotowana do reakcji z polimerem powinna stanowic roztwór wodny, który zostal wczesniej poddany dializie w celu obnizenia przewodnictwa jonowego od wartosci 5—10 m Siemensów do okolo 0,1—5 m Siemensów, korzystnie okolo 1 m Siemensa. Roztwór enzymu powinien korzystnie posiadac pH 4,5—7,0; dla okreslenia optymalnej wartosci pH roztworu tj. wartosci przy której uzyskuje sie maksymalna adsorpcje i aktywnosc enzymu, moze zajsc koniecznosc przeprowadzenia kilku doswiadczen. Zwykle jednak, optymalna wartosc pH zawiera sie w granicach 52—6,5. Czas zetkniecia polimeru z roztworem enzymu powinien byc wystarczajaco dlugi, by uzyskac maksymalna adsorpcje enzymu; zwykle wynosi on od 2 do 16 godzin.Po zaadsorbowaniu na substracie, enzym sieciuje sie in situ, poddajac go reakcji z czynnikiem sieciujacym, takim jak aldehyd glutarowy, glioksal lub aldehyd mrówkowy, przy czym preferowane jest stosowanie aldehydu glutarowego lub glioksalu. Aldehyd glutarowy nadaje kompleksowi enzym-substrat wlasnosci szczególnie korzystne w przypadku stosowania go do produkqi 6-APA. Czynnika sieciujacego uzywa sie zwykle w roztworze wodnym w stezeniu 0,1 —15% wagowych, a korzystnie 0,5-5,0% wag.Po zakonczeniu reakq"i sieciowania nalezy usunac cala reszte nieprzereagowanego czynnika sieciujacego.Mozna to uzyskac przemywajac produkt woda lub roztworem pochodnej aminowej; jak stwierdzono, doskona¬ lym srodkiem do tego celu jest mocznik.Przed uzyciem kompleksu enzym-substrat w procesie wytwarzania 6-APA nalezy doprowadzic ostroznie jego pH do wartosci w granicach 6,0-9,0 zwykle 7,0-8,5 (preferowana wartosc pH kompleksu wynosi 7,8);94 970 3 uzyskuje sie to zwykle przez dodanie do mieszaniny po zakonczeniu reakqi sieciowania, zasady. Uzyskany kompleks enzym substrat poddaje sie reakcji z wodnym roztworem (o odpowiedniem pH) benzylopenicyliny lub fenoksymetylopenicyliny lub ich soli, w temperaturze 30-50°, korzystnie w temperaturze 37°C. W trakcie reakqi z benzylopenicyliny wydziela sie kwas fenylooctowy, a z fenoksymetylopenicyliny — kwas fenoksyocto- wy. W celu utrzymania pH mieszaniny w odpowiednich granicach, wydzielajace sie kwasy zobojetnia sie w sposób ciagly lub periodyczny. Jak juz stwierdzono, dobór odpowiedniej zasady do tego celu nie jest sprawa istotna. Zwykle uzywa sie wodorotlenku sodu, chociaz mozna równiez uzywac lotnych zasad aminowych, takich jak amoniak lub trójetyloamina.Nierozpuszczalne w wodzie kompleksy enzymowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku sa wystarczaja¬ co trwale — i to zarówno pod wzgledem mechanicznym, jak i biologicznym. \N zwiazku z tym umozliwiaja przeprowadzenie co najmniej 40 kolejnych reakcji rozerwania wiazania amidowego penicyliny w dzialajacym periodycznie reaktorze.Sposób wedlug wynalazku ilustruja podane nizej przyklady, które takze ilustruja wysoka aktywnosc enzymatyczna oraz uzytecznosc kompleksów w polaczeniu z innymi kompleksami enzym-polimer. W przykla¬ dach tych stosuje sie czesciowo oczyszczony enzym acylaze — uzyskany na drodze mechanicznej w homogeniza- torze, z komórek wytwarzajacych acylaze szczepów bakterii Escherichia coli NC 1B 8734.Po doprowadzeniu mieszaniny do pH 5 szkielety komórek odsacza sie, a uzyskany roztwór enzymu oczyszcza sie dalej w stopniu niezbednym do uzyskania odpowiedniej aktywnosci (tj. od 1,5 do 30 mikromo- li/min/mg bialka). Nastepnie, roztwór enzymu poddaje sie dializie az do uzyskania przewodnosci okolo 1 m siemensa.Przyklad I. 20,25 lub 50 g podwielokrotnosci dostepnych w handlu kationitów i anionitów dyspergu¬ je sie w 100—500 ml destylowanej wody i dodaje, energicznie mieszajac, taka ilosc wodorotlenku sodu lub kwasu chlorowodorowego, by doprowadzic pH mieszaniny— w przypadku kationitów — do wartosci w granicach 4,4—6,3, a w przypadku anionitów —do wartosci w granicach 6,5-9,0. Nastepnie zywice odsacza sie, przemywa dokladnie destylowana woda i ponownie dysperguje w roztworze 60—100,250 lub 500 ml czesciowo oczyszczo¬ nej penicylinazy o aktywnosci 3,85-6,75 mikromoli/min/mg bialka i o przewodnosci < 1 mS dostosowanej do odpowiedniej wartosci pH.Ilosc enzymu adsorbowanego na zywicy waha sie od 71 do 308 mikromoli/min/g zywicy. Mieszanine pozostawia sie, lekko wstrzasajac i dodajac roztworu mianowanego w celu utrzymania odpowiedniego pH, wciagu 16 godzin, w celu zaadsorbowania enzymu na zywicy, a nastepnie przesacza. Odsaczone zywice dysperguje sie w 100 ml 0,825-3,3% (wag./obj.) roztworu aldehydu glutarowego w wodzie.j pozostawia, dodajac roztworu mianowanego w celu utrzymania odpowiedniego pH, w ciagu 16 godzin do przereagowania. Uzyskane kompleksy enzym-zywica odsacza sie, przemywa trzykrotnie woda destylowana, dysperguje w wodzie lub 0,2 m roztworze buforu fosforanowego o pH 7,8, doprowadza Ph mieszaniny do wartosci 7,8 i poddaje wciagu 1 godziny reakgi ze 100 ml 0,1 m wodnego roztworu mocznika o pH = 7,8, po czym przemywa trzykrotnie woda destylowana.Kazdego z tak wytworzonych kompleksów uzywa sie w procesie wytwarzania 6-APA z benzylopenicyliny, prowadzonego w typowych warunkach: przy pH = 7,8 i w temperaturze 37°C. Aktywnosci stosowanych komple¬ ksów podane sa w tabeli I i odnosza sie do kompleksów wytworzonych przy pH optymalnym dla adsorpqi enzymu i utrzymania jego aktywnosci.Zywice Bio-Rex i Chelex sa produktami handlowymi f-my Bio-Rad Laboratories of California, ze Stanów Zjednoczonych AP; zywice Lewatit sa produktami handlowymi f-my Bayer AG z RFN; zywice Zeokarb i Zerolit sa produktami handlowymi f-my The Permutit Co. Ltd., a zywice Amberlite sa produktami handlowymi f-my Rohm and Haas, Philadelphia, ze Stanów Zjednoczonych AP. Nalezy zauwazyc, ze korzysci wynikajace z wysokiej aktywnosci i stabilnosci ograniczone sa do przypadków, w których substratem jest polimer lub kopolimer kwasu metakrylowego.94 970 Tabela I Doswiad- Rodzaj monomeru oraz czenie grup funkcyjnych zywicy Zywica Aktywnosc kompleksu Fizyczna enzym-zywica przy postac optymalnej wartosci pH zywicy m/min/g m/min/g subst. subst mokrej suchej a Styren-czwartorzedowe amonowe b Styren-czwartorzedowe amonowe c Arylan-czwartorzedowe amonowe d Styren-poliaminowe e Styren-poliaminowe f Akrylan-poliaminowe g Styren-S03 H h Styren-S03 H i Styren-S03H j Styren-S03 H k Fenol-formaldehyd-S03 H I Styren-S03H m Styren-P03 H2 n Styren-CH2 -N/CH2 -COOH/2 ó Metakrylan-COOH p Akrylan-COOH q Akrylan-COOH r Akrylan-COOH s - + 2 -COOH t + 2 -COOH OH u F«wol-formaldehyd[QQQH Polimetakrylan COOH -SO3H Amberlite IRA-938 Amberlite IRA-401 Amberlite IRA-458 Lewatit MP62 Amberlite IR45 Amberlite IRA-68 Lewatit SP120 Lewatit 8100 ZerolJt 325 Amberlite IR-120 Bio-Rex 40 Bio-Rad AG/MP/50 Bio-Rex 63 Chelex 100 Amberlite IRC-50 Amberlite IRC-72 Amberlite IRC-84 Zerolit 236 Lewatit CHP-80 Lewatit CHP Zerolit 216 Zeokarb 227 Makroporowata Zel Zel Makroporowata Zel Zel Makroporowata Zel Zel M Zel Makroporowata Zel Zel Makroporowata Makroporowata Zel Zel Makroporowata Makroporowata Zel Zel ,4 2,3 • 4,71 ,1 2,3 2,3 19,3 2,3 2,3 2,3 4,01 9,9 2,3 7,16 37,0 ca. 8,0 7,0 ca. 8,0 152 2,3 2,3 32,4 ,8 ,1 ,7 ,8 ,8 392 ,8 .8 53 8,3 19,8 ,1 \ 883 ca. 24,0 ' 13,9 ca. 17,1 * 36.5 ,8 53 ,9 57,0 Uwagi: ' Wyniki bardzo rózniace sie miedzy soba, obliczone wartosci sa srednia z kilku oznaczen. a Nieznana budowa polimeru. < 3 Zywica niedostepna w handlu. 4 Wielkosc czastek — 200 mesh; dla innych zywic 14,50 mesh Zywice a—c maja charakter silnie zasadowy Zywice d—f maja charakter slabo zasadowy Zywice g—I maja charakter silnie kwasowy Zywice o—u maja charakter slabo kwasny94 970 Tabela II Przyklad II III IV V Aktywnosc enzymu wyjsciowego m/min/mg bialka 4,64 7,87 ,5 18,2 Szybkosc adsorpqi enzymu na zywicy m/min/g zywicy 216 463 1160 586 Aktywnosc kompleksu enzym—zywica m/min/g subst suchej 38,1 72,0 124,0 109,0 Przyklady II—V. Ponizsze przyklady ilustruja efekt wywolany rózna czystoscia uzywanej w procesie adsorpcji acyl£zy. Stosuje sie tu sposób opisany w przykladzie I. Enzym adsorbuje sie przy pH = 5,7. Uzyskany kompleks enzym - zywica poddaje sie reakcji z 3,3% (wag/obj.) roztworem aldehydu glutarowego. W doswiadcz- eniach uzywa sie zywicy „Amberlite IRC-50" przemytej najpierw zasada, a nastepnie kwasem. W tabeli 11 podane sa aktywnosci uzyskanych tym sposobem kompleksów enzym-substrat. Uzyskane wyniki wskazuja, ze w bada¬ nym zakresie zwiekszenie czystosci enzymu wyjsciowego powoduje wzrost aktywnosci uzyskiwanego kompleksu.Przyklad VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV Tab e PH 4,9 ,1 ,3 ,5 ,7 ,7 ,9 6,1 63 6,5 la III Aktywnosc kompleksu enzym-substrat miki ornoIi/m in/g subst. wilgotnej ,2 21,2 40,8 49,0 572 44,4 13,0 8,4 ,6 ,6 Przyklady VI—XV. Ponizsze przyklady sluza jako ilustraqa wplywu pH srodowiska w którym zachodzi proces adsorbowania enzymu na zywicy, na produkt bkoncowy. Przeprowadza sie nastepujace doswiadczenia: /a/ Piec podwielokrotnosci 50 g zywicy „Amberlite IRC-50" doprowadza sie odpowiednio do pH = 4,9; ,1; 5,3; 5,5 i 5,7, suszy i miesza (kazda) z 200 ml roztworu zawierajacego 95 ml czesciowo oczyszczonej penicylinazy o aktywnosci 60,9 mikromola/min/ml i przewodnosci 0,55 mS, która zawiera w 1 ml 16,8 mg bialka. Adsorpcje prowadzi sie w ciagu 16 godzin, po czym - uzyskany kompleks poddaje obróbce w sposób opisany w przykladzie I. lub /b/ Piec dalszych podwielokrotnosci zywicy „Amberlite IRC-50" poddaje sie obróbce w opisany wyzej sposób, z ta tylko róznica, ze adsorpcje prowadzi sie w srodowisku opH w granicach 5,7-6,5. Do adsorpcji uzywa sie 105 ml enzymu o aktywnosci 54,7 mikromola/min/ml i przewodnosci 0,75 mS, który zawiera w 1 ml 16,8 mg bialka.Uzyskane wyniki podane sa w tabeli III. Wskazuja one, ze optymalna wartosc pH dla procesu adsorpcji94 970 zawiera sie w granicach 5,2-5,8.Przyklady XVI—XVII. Ponizsze przyklady sluza, jako ilustraqa skutków wynikajacych zuzycia zywicy o innych rozmiarach czastek. W pierwszym przypadku uzywa sie zywicy Amberlite IRC-50 skladajacej sie z czastek o rozmiarach stosowanych w chromatografii np. z czastek przechodzacych przez sito 100 A.S.T.M. a zatrzymanych na sicie 200 A.S.T.M. (tj. z czastek o rozmiarach 0,74-0,149 mm). g podwielokrotnosci zywicy poddaje sie w ciagu 3 godzin, przy pH = 6,7, procesowi adsorpcji 200 ml enzymu (23,7 mikromola/mih/ml; 3,86 mikromola/min/mg bialka). Uzyskany kompleks odsacza sie i poddaje, wciagu 16 godzin, dzialaniu 200 ml 0,825% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego, a nastepnie wydziela z mieszaniny i przemywa w sposób opisany w przykladzie I. Uzyskuje sie 21 g produktu o aktywnosci 114,5 mikormola/min/g substancji wilgotnej. Porównujac uzyskany produkt z produktem z przykladu II, w którym uiyto zywicy „Amberlite IRC-50" skladajacej sie z czastek przechodzacych przez sito 14 A.S.T.M. a zatrzyma¬ nych na sicie 50 A.S.T.M. (tj. czastek o srednicach 0,297—1,41 mm) mozna zauwyzyc, ze lepsze wyniki uzyskuje sie w przypadku uzycia zywicy o mniejszych rozmiarach czastek.Doswiadczenie powtarza sie z zywica skladajaca sie z czastek o rozmiarach stosowanych w farmacji tj. z zywica „Amberlite IRP-64" skladajaca sia z czastek przechodzacych przez sito 100 A.S.T.M. a zatrzymanych na sicie 500 A.S.T.M. (a wiec, z czastek o srednicach 0,037-0,149). Zywice te poddaje sie przy pH =6,3 adsorpcji enzymem (3920 mikromoli/min/g zywicy, aktywnosc = 17,4 mikromoli/min/mg bialka). Uzyskany kompleks enzym-zywica poddaje sie reakqi z 3,3% (wag/obj) roztworem aldehydu glutarowego, po czym obrabia wsposób opisany w przykladzie I. W wyniku uzyskuje sie kompleks enzym-zywica o aktywnosci 478,4 mikromola/min/g subst wilgotnej.Przyklad XVIII. Przemywajac zywice „Amberlite IRC-50" 0,2 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 5,5, lub mieszajac ja z woda destylowana i dodajac roztworu wodorotlenku sodu, doprowadza sie jej pH do wartosci 5,5. Nastepnie, zywice przemywa sie tak dlugo woda destylowana, az przestanie sie zauwazac zmiany jej przewodnosci. 100 g wilgotnej zywicy dodaje sie do roztworu penicylinazy o aktywnosci 5,25 mikromola/min/mg bialka w 500 ml 0,02 m roztworu buforu fosforanowego opH=5,5 i miesza wciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej. Wytracony osad odsacza sie, dysperguje w 500 ml 0,25% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego rozpuszczonego w roztworze buforu fosforanowego i miesza w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej.Uzyskany kompleks enzym-zywica odsacza i przemywa tak dlugo 0,2 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 7,8, az zywica osiagnie taka sama wartosc pH. g wytworzonego w ten sposób kompleksu uzywa sie w reakcji rozszczepienia 200 ml 6,25% (wag/obj) wodnego roztworu benzylopenicyliny w 0,02 m roztworze buforu fosforanowego, reakcji prowadzonej w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C i przy pH = 7,8. Jak stwierdzono, powyzszy kompleks mozna latwo odzyskiwac z mieszaniny poreakcyjnej i stosowac ponownie. Przy tym, jego wlasnosci mechaniczne i biologiczne pozostaja niezmienione, co pozwala na co najmniej 25 krotne uzywanie tego kompieksu w reakcjach rozszczepiania penicylin. < Przyklad XIX. Przyklad ten sluzy jako ilustracja sposobu stosowania wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku kompleksu enzym-substrat w prowadzonej na wielka skale produkcji 6-APA, oraz sposobu ponownego uzycia niniejszego kompleksu w warunkach produkcyjnych.Kompleks enzym-substrat o aktywnosci 26,3 mikromola/min/g wytwarza sie z zywicy „Amberlite IRC-50" i stosuje w reakcji rozszczepiania 40 litrów 6,5% (wag/obj) roztworu benzylopenicyliny w 0,02 m buforu fosforanowego. Po reakcji kompleks pozostaje w reaktorze (zaopatrzonym w tym celu w druciana siatke), a odsaczony produkt, którym jest roztwór 6-APA, poddaje sie dalszej przeróbce. Kompleks, po przemyciu woda, mozna stosowac w dalszych reakcjach. Przecietna wydajnosc 50 kolejnych (z tym samym kompleksem) reakcji konwersji do 6-APA, prowadzonych w ciagu 6 godzin kazda, wynosi 95%.Przyklad XX. Przyklad ten sluzy jako ilustracja stabilnosci mechanicznej kompleksu enzym-substrat pokazanej na przykladzie kompleksu wytworzonego w przykladzie I z zywicy „Amberlite IRC-50" i porównanej ze stabilnoscia kompleksu wytworzonego w podobny sposób, lecz z innego, nieaktywnego substratu, a mianowi¬ cie — z zywicy XAD-7, która jest usieciowanym estrem akrylowym, dostepnym w handlu i wytwarzanym przez f-me Rohm and Haas Corp., Stany Zjednoczone AP. 1,6 g próbki kazdego z kompleksów dysperguje sie w temperaturze 37°C w 8 litrach 0,2 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,8 i miesza w ciagu 72 godzin z predkoscia 200 obr./min w zaopatrzonej w przegrody kadzi fermentacyjnej New Brunswick Magnaferm. Co 4 godziny pobiera sie z kazdej kadzi próbke i oszacowuje wzrokowo ilosc uszkodzonych kulek zywicy. Ilosc uszkodzonych kulek zywicy XAD-7 jest znacznie wieksza niz zywicy IRC-50 (ilosc uszkodzonych kulek zywicy IRC-50 po 64 godzinach prowadzenia eksperymentu jest94 970 7 równa ilosci uszkodzonych kulek zywicy XAD-7 po 8 godzinach eksperymentu). Uzyskane wyniki wskazuja wyraznie na znacznie wieksza wytrzymalosc mechaniczna zywicy IRC-50.Przyklad XXI. 235 g Amberlite IRC-50 o aktywnosci 39,4 mikromola/min/g wytworzonego w sposób .opisany w przykladzie I, uzywa sie w serii doswiadczen do rozszczepienia 6,25% (wag/obj.) roztworu soli potasowej benzylopenicyliny G. Kazde doswiadczenie prowadzi sie w ciagu 2 1/2 godziny, w temperaturze 37°C i przy pH = 7,8, uzywajac 1 litra roztworu soli potasowej benzylopenicyliny G. Po kazdym doswiadczeniu Amberlite IRC-50 odsacza sie i przemywa woda destylowana. Przesacz i popluczyny zateza sie w obrotowej wyparce prózniowej, miesza z równa objetoscia ketonu metyloizobutylowego, schladza do temperatury 4—10°C i zakwasza, stracajac osad kwasu 6-aminopenicylanowego. Wytracony osad przemywa sie niewielka iloscia wody destylowanej, przeplukuje acetonem i suszy w piecu. W przeprowadzonych doswiadczeniach srednia wydajnosc wagowa kwasu 6-aminopenicylanowego wynosila 91,3%.Przyklad XXI I. Adsorpqa enzymu acylazy na polietylenie pokrytym uretanem.Czastki polietylenu o malej gestosci (<400j/m) pokrywa sie polimerem uretanowym (Urithsne 641 W, Cray Valley Products Limited) i pozostawia w ciagu 10 dni do wyschniecia. Nastepnie, przemywa sie je w ciagu 1 godziny 20% roztworem wodnym acetonu (w% obj), przeplukuje dokladnie woda destylowana i poddaje, wciagu 5 godzin, przy pH w granicach 4,8-9,0, adsorpqi 5g podwielokrotnosciami 125 ml enzymu (54,0 mikromola/min/ml; 3,80 mikromola/min/mg bialka). Czasteczki pokryte uretanem odsacza sie, poddaje w ciagu 3 godzin dzialaniu 75 ml 3,3% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego i doprowadza do pH = 7,8 sposobem opisanym w przykladzie I.Pomimo, iz pokryte uretanem, uzyskane czastki posiadaja mniejsze rozmiary niz czastki IRC-50.Aktywnosc uzyskanego kompleksu jest 2—3-krotnie mniejsza niz kompleksu z IRC-50.Aktywnosc pH 4,8 .2 ,6 6,0 6.4 7.0 7,5 8,0 8.5 9.0 mikromole/min/g subst. wilgotnej 11,3 14,0 16.4 13,2 13,6 12,3 7,8 ,0 9,0 122 Przyklad XXII I. Adsorpcja enzymu acylazy na nylonie.Orgolac'4 (sproszkowany nylon 6 o srednicy czastek <30 im\, zf-my Ato Chimie Limited, UK) przemywa sie wciagu 1 godziny 65% (wag/obj) roztworem kwasu mrówkowego, a nastepnie dokladnie przeplukuje woda destylowana. 10 g podwielokrotnosci powyzszej substancji poddaje sie w ciagu 16 godzin, przy pH w granicach 4,8-9,0, adsorpqi 100 ml enzymu (50,9 mik»-omola/min/ml; 4,7 mikromola/min/mg bialka). Uzyskany kom¬ pleks odsacza sie, poddaje wciagu 3 godzin reakqi z 100 ml 3,3% (wag/obj) roztworu aldehydu glutarowego, ponownie odsacza i przemywa w sposób opisany w przykladzie I.Kompleks o najwyzszej aktywnosci 41,7 mikromola/min/g substancji wilgotnej uzyskany przy pH 4,8 jest porównywalny z typowym kompleksem uzyskiwanym z IRC-50. Jednakze, w tym przypadku wystepuje duza róznica w rozmiarach czastek nylonu i IRC50. Przy uzyciu IRP-64 (tj. IRC-50 o rozmiarach czastek stosowanych wfarmaqi, czyli 0,037—0,149 mm) uzyskuje sie z acylaza kompleks o aktywnosci 478 mikromoli/min/g subst. wilgotnej, tj. o aktywnosci przeszlo jedenastokrotnie wiekszej niz w przypadku uzycia jako substratu-nylonu.Aktywnosc pH 4,8 52 ,6 6,0 6,4 7,0 mikromole/min/g subst. wilgotnej 41.7 36,1 26,9 22,2 ,7 17,68 94 970 1 2 7,5 17,6 8,0 21,3 8,5 15,7 9,0 9,3 PL PLThe subject of the invention is a process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid, hereinafter referred to as 6-APA. It is known that certain enzymes are capable of cleaving the amide bond in penicillins. Such enzymes are valuable for the industrial production of 6-APA from naturally occurring penicillins obtained in fermentation processes. It has now been found that in the production of 6-APA it is possible to use certain water-insoluble enzyme-polymer complexes that not only have very favorable enzymatic activity but also very good mechanical and chemical stability. Due to such good enzymatic activity, such complexes are very efficient in converting natural penicillins to 6-APA, and due to their mechanical and chemical stability, such complexes can be used repeatedly without loss of enzymatic activity. As a result, the method according to the invention is much more effective than the known methods of producing 6-APA. The method according to the invention produces 6-aminopenicillanic acid by reacting benzylpenicillin or phenoxypenicillin or their salts in an aqueous solution at a pH of 6.0-9.0, with an insoluble in water an enzyme-substrate complex consisting of an enzyme called penicillinase, adsorbed on a substrate, which is a water-insoluble polymer, cross-linked with a cross-linking agent such as glutaraldehyde, glyoxal and formaldehyde, the substrate being a water-insoluble polymer or Methacrylic acid copolymer. The above-mentioned complexes are obtained by adsorption of the enzyme penicillinase on a water-insoluble polymer or copolymer of methacrylic acid, followed by reaction with a cross-linking agent such as glutaraldehyde, glyoxal and formaldehyde. Used in this method for the preparation of 6-APA. from benzylpenicillin enzyme-aces The lase is preferably obtained from bacteria such as strains of Escherichia coli or, when used as starting material phenyloxymethylpenicillin, from lower spore plants or actinomycetes. Deacylase enzymatic activity is usually determined by the ability to produce 6-APA from benzylpenicillin. Thus, the activity of the decylase enzymes is determined as the amount of 6-APA (in micromoles- / m) 2 94 970 obtained per minute from a benzylpenicillin solution at pH 7.8 and 37 ° C per milligram protein contained in the enzyme. The protein content of the enzyme is determined by the standard Lowry method. The enzymatic activity of the enzyme-substrate complexes according to the invention is similarly determined as Posc 6-APA (w / m) prepared within one minute from a benzylpenicillin solution at pH 7.8 and temperature 37 ° C per gram of enzyme-substrate complex. The adsorption efficiency, the crosslinking reaction, and the activity of the water-insoluble enzyme-substrate complex produced are found to increase when a purer starting enzyme is used. However, because some of the benefits of using a purer starting enzyme grow more slowly than would result from the increase in the purity of the enzyme used, and due to economic constraints, deacylase with a purity ranging from 0.15 to 50 micromolar is used. / min / mg protein contained in the enzyme, and preferably in the range from 1.5 to 30 micromol / min / mg protein. It is preferable to increase the purity of the enzyme prior to adsorption and the crosslinking reaction. This may be achieved by ultrafiltration or heating of the enzyme solution for a short time, e.g., about 30 fminutes, at a temperature of about 50 ° C. Other typical methods of enzyme purification are fractionated wastage or "treatment with ion exchange celluloses or Sephadex. F & ^^ According to the invention, the substrate is methacrylic acid polymers or copolymers. They contain carboxylic acid. The preferred substrates are the macroporous polymers and copolymers of methacrylic acid rather than the gels of dimers and copolymers of this acid. It is desirable that the methacrylic acid polymers be water-insoluble and have the form of cross-linked copolymers. As examples of such polymers, methacrylic acid copolymers with methacrylic acid copolymers may be used. or methacrylic acid glycol esters, eg ethylene glycol dimethacrylate. Other comonomers such as methacrylic acid esters may also be used to prepare the above copolymers. One of the advantages of the present invention is that such polymers can be used as substrates which are pr commercial drugs used for various purposes, especially as weakly acid cation exchangers. A particularly suitable copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene sold by the company Rohm and Haas Co. from the United States of America, AP under the name Amberlite IRC-50, and methacrylic acid copolymer formerly sold by f-me Permutit Co. Ltd. under the name Zeocarb 227. The latter is a copolymer of divinylbenzene and methacrylic acid also containing a certain amount of benzenesulfonyl groups. The substrate polymers in the process of the invention are preferably used in fine grain form, i.e. containing particles of sufficient size to pass through a sieve 10 ASTM, i.e. particles less than 2.0 mm in diameter. However, the enzyme-substrate complex obtained by the process of the invention should have larger particles, otherwise it could not be separated from the reaction mixture by sieving or used in a column reactor. Thus, the polymer should consist of particles with dimensions greater than 0.01 mm, ie, it should be fully retained on the 800 * ASTM sieve. The selection of the appropriate particle size from the range given above will depend on the type of reactor used. The acylase prepared for reaction with the polymer should be an aqueous solution that has been previously dialyzed in order to reduce the ionic conductivity from Siemens 5-10 m to about 0.1-5 m Siemens, preferably about 1 m Siemens. The enzyme solution should preferably have a pH of 4.5-7.0; Several experiments may be necessary to determine the optimal pH value of the solution, i.e. the value at which maximum adsorption and enzyme activity is achieved. Usually, however, the optimum pH value is in the range of 52-6.5. The contact time of the polymer with the enzyme solution should be long enough to obtain maximum enzyme adsorption; usually it is from 2 to 16 hours. Once adsorbed on the substrate, the enzyme cross-links in situ by reacting it with a cross-linking agent such as glutaraldehyde, glyoxal or formaldehyde, with the use of glutaraldehyde or glyoxal being preferred. Glutaraldehyde gives the enzyme-substrate complex properties that are particularly advantageous when used in the production of 6-APA. The cross-linking agent is usually used in an aqueous solution in a concentration of 0.1-15% by weight, preferably 0.5-5.0% by weight. or a solution of an amine derivative; urea has been found to be an excellent agent for this purpose. Before using the enzyme-substrate complex in the production of 6-APA, carefully adjust its pH to a value in the range 6.0-9.0, usually 7.0 -8.5 (the preferred complex pH value is 7.8); 94 970 3 this is usually obtained by adding a base to the mixture after the crosslinking reaction is complete. phenoxymethylpenicillins or their salts, at a temperature of 30-50 °, preferably at 37 ° C. During the reaction, phenylacetic acid is released from benzylpenicillin, and phenoxyacetic acid is released from phenoxymethylpenicillin. If the pH of the mixture remains within the appropriate limits, the evolving acids become neutralized either continuously or periodically. As already stated, the selection of an appropriate rule for this purpose is not essential. Usually sodium hydroxide is used, although volatile amine bases such as ammonia or triethylamine can also be used. The water-insoluble enzyme complexes used in the process of the invention are sufficiently stable - both mechanically and biologically. Therefore, it is possible to carry out at least 40 consecutive reactions of breaking the amide bond of penicillin in a batch reactor. The method according to the invention is illustrated by the following examples, which also illustrate the high enzymatic activity and the utility of the complexes in combination with other enzyme-polymer complexes. In these examples, a partially purified acylase enzyme is used - obtained mechanically in a homogenizer, from cells producing acylase strains of Escherichia coli NC 1B 8734 bacteria. After adjusting the mixture to pH 5, the cell skeletons are drained and the enzyme solution obtained is purified further to the extent necessary to obtain the desired activity (ie 1.5 to 30 micromol / min / mg protein). The enzyme solution is then dialyzed until a conductivity of about 1 m Siemens is obtained. the amount of sodium hydroxide or hydrochloric acid to adjust the pH of the mixture - in the case of cation exchangers - to a value in the range of 4.4-6.3, and in the case of anion exchangers - to a value in the range of 6.5-9.0. Then the resins are drained, washed thoroughly with distilled water and redispersed in a solution of 60-100,250 or 500 ml of partially purified penicillinase with an activity of 3.85-6.75 micromol / min / mg of protein and conductivity <1 mS adjusted to the appropriate pH value The amount of enzyme adsorbed on the resin ranges from 71 to 308 micromol / min / g resin. The mixture is left to shake gently and the standard solution is added to maintain the appropriate pH for 16 hours to adsorb the enzyme to the resin and then sift through. The drained resins are dispersed in 100 ml of a 0.825-3.3% (w / v) solution of glutaraldehyde in water, and allowed to react for 16 hours by adding a standard solution to maintain the appropriate pH. The resulting enzyme-resin complexes are filtered off, washed three times with distilled water, dispersed in water or 0.2 m phosphate buffer solution at pH 7.8, the pH of the mixture is adjusted to 7.8 and reacted with 100 ml of 0.1 for 1 hour. m of an aqueous urea solution at pH = 7.8, then washed three times with distilled water. Each of the complexes thus prepared is used in the production of 6-APA from benzylpenicillin, carried out under standard conditions: at pH = 7.8 and temperature 37 ° C . The activities of the complexes used are given in Table I and relate to the complexes prepared at the optimum pH for the adsorption of the enzyme and the maintenance of its activity. Bio-Rex and Chelex resins are commercial products of Bio-Rad Laboratories of California, from the United States of America AP ; Lewatit resins are commercial products of Bayer AG from Germany; Zeokarb and Zerolit resins are commercial products of The Permutit Co. Ltd. and Amberlite resins are commercial products of Rohm and Haas, Philadelphia, of the United States AP. It should be noted that the benefits of high activity and stability are limited to cases where the substrate is a polymer or copolymer of methacrylic acid.94 970 Table I Experience - Type of monomer and combination of resin functional groups Resin Complex activity Physical enzyme-resin in the form of an optimal value resin pH m / min / gm / min / g substance wet dry substance a Styrene-quaternary ammonium b Styrene-quaternary ammonium c Aryl-quaternary ammonium d Styrene-polyamine e Styrene-polyamine f Acrylate-polyamine g Styrene-S03 H h Styrene-S03 H i Styrene-S03H H j Styrene-S03 Phenol-formaldehyde-SO3 HI Styrene-SO3H m Styrene-P03 H2 n Styrene-CH2 -N / CH2 -COOH / 2 - Methacrylate-COOH p Acrylate-COOH q Acrylate-COOH r Acrylate-COOH s - + 2 -COOH t + 2 -COOH OH u F «vol-formaldehyde [QQQH Polymethacrylate COOH -SO3H Amberlite IRA-938 Amberlite IRA-401 Amberlite IRA-458 Lewatit MP62 Amberlite IR45 Amberlite IRA-68 Lewatit SP120 Lewatit 8100 ZerolJt 40-120 Amberlite IR-120 Amberlite Bio-Rad AG / MP / 50 Bio-Rex 63 Chelex 100 Amberlite IRC-50 Amberlite IRC-72 Amberlite IRC-84 Zerolit 236 Lewatit CHP-80 Lewatit CHP Zerolit 216 Zeocarb 227 Macroporous Gel Gel Macroporous Gel Gel Macroporous Gel Gel M Zel Macroporous Gel Gel Macroporous Macroporous Gel Gel Macroporous Macroporous Gel Zel, 4 2.3 • 4.71, 1 2.3 2.3 19.3 2.3 2.3 2.3 4.01 9, 9 2.3 7.16 37.0 ca. 8.0 7.0 ca. 8.0 152 2.3 2.3 32.4, 8, 1.7, 8, 8 392, 8.8 53 8.3 19.8, 1, 883 ca. 24.0 '13.9 ca. 17,1 * 36.5, 8 53, 9 57.0 Notes: 'Results very different from each other, the calculated values are the average of several determinations. a Unknown polymer structure. <3 Resin not commercially available. 4 Particle size - 200 mesh; for other resins 14.50 mesh Resins a-c are strongly alkaline Resins d-f are slightly basic Resins g-I are strongly acidic Resins o-u are slightly acidic94 970 Table II Example II III IV V Activity of the starting enzyme m / min / mg protein 4.64 7.87, 5 18.2 Adsorption rate of the enzyme on the resin m / min / g resin 216 463 1160 586 Activity of the enzyme-resin complex m / min / g dry substance 38.1 72.0 124.0 109.0 Examples II-V. The following examples illustrate the effect of the different purity of the acylase used in the adsorption process. The method described in Example 1 is used here. The enzyme is adsorbed at pH = 5.7. The obtained enzyme-resin complex is reacted with a 3.3% (w / v) solution of glutaraldehyde. In the experiments, the "Amberlite IRC-50" resin was washed first with the base and then with the acid. The activities of the enzyme-substrate complexes obtained in this way are given in Table 11. increase in the activity of the obtained complex Example VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV Tab e PH 4.9, 1, 3, 5, 7, 7, 9 6.1 63 6.5 la III Activity of the enzyme-substrate mica complex / m in / g wet substance, 2 21.2 40.8 49.0 572 44.4 13.0 8.4, 6, 6 Examples VI-XV The following examples serve as an illustration of the influence of the pH of the environment in which the process takes place adsorbing the enzyme on the resin to the end product The following experiments are performed: / a / Oven aliquots of 50 g of Amberlite IRC-50 resin are adjusted to pH 4.9, respectively; , 1; 5.3; 5.5 and 5.7, dried and mixed (each) with 200 ml of a solution containing 95 ml of partially purified penicillinase with the activity of 60.9 micromol / min / ml and conductivity of 0.55 mS, which contains 16.8 mg per ml proteins. The adsorption is carried out for 16 hours, after which - the obtained complex is processed as described in example I. or / b / Five further aliquots of "Amberlite IRC-50" resin are processed as described above, with the only difference that adsorption is carried out in the opH environment within the range of 5.7-6.5 105 ml of the enzyme with the activity of 54.7 micromol / min / ml and conductivity of 0.75 mS is used for adsorption, which contains 16.8 mg of protein per ml The obtained results are given in Table III.They indicate that the optimal pH value for the adsorption process94,970 is within the range of 5.2-5.8. Examples XVI - XVII. In the first case, the Amberlite IRC-50 resin is used, consisting of particles of the size used in chromatography, e.g. particles passing through a 100 ASTM sieve and retained on a 200 ASTM sieve (i.e. particles with a size of 0.74-0.149 mm) .g of an aliquot of resin will surrender they are eaten for 3 hours, at pH = 6.7, with the adsorption process of 200 ml of enzyme (23.7 micromol / mlh / ml; 3.86 micromol / min / mg protein). The resulting complex is filtered off and treated for 16 hours with 200 ml of 0.825% (w / v) glutaraldehyde solution, then separated from the mixture and washed as described in Example I. 21 g of the product with an activity of 114.5 micormoles are obtained. / min / g wet substance. By comparing the product obtained with the product of Example 2, in which the resin "Amberlite IRC-50" was used, consisting of particles passing through a 14 ASTM sieve and retained on a 50 ASTM sieve (i.e. particles with a diameter of 0.297-1.41 mm), it is possible to note that better results are obtained when using a resin with a smaller particle size. The experiment is repeated with a resin consisting of particles of the size used in pharmacy, i.e. resin "Amberlite IRP-64" consisting of a grain of particles passing through a 100 ASTM sieve and detained on a 500 A.S.T.M. (so, with particles with a diameter of 0.037-0.149). These resins are subjected to enzyme adsorption at pH = 6.3 (3920 micromol / min / g resin, activity = 17.4 micromol / min / mg protein). The obtained enzyme-resin complex is reacted with a 3.3% (w / v) solution of glutaraldehyde, and then processed as described in example I. The result is an enzyme-resin complex with an activity of 478.4 micromol / min / g of substance. humid Example XVIII. By washing the "Amberlite IRC-50" resin with 0.2 m phosphate buffer solution at pH = 5.5, or by mixing it with distilled water and adding sodium hydroxide solution, its pH is adjusted to 5.5. Then, the resins are washed in this way long distilled water until no change in its conductivity is noticed.100 g of wet resin is added to a penicillinase solution with an activity of 5.25 micromol / min / mg of the protein in 500 ml of 0.02 m phosphate buffer opH = 5.5 and stirred for a while 20 hours at room temperature The precipitate is filtered off, dispersed in 500 ml of 0.25% (w / v) glutaraldehyde solution dissolved in a phosphate buffer solution and stirred for 20 hours at room temperature. The resulting enzyme-resin complex is filtered off and washed. for as long as 0.2 m phosphate buffer solution with pH = 7.8 until the resin reaches the same pH value. g of the complex obtained in this way is used in a cleavage reaction 0.02 m phosphate buffer solution, reaction for 2 hours at 37 ° C and pH = 7.8. As stated, the above complex can easily be recovered from the reaction mixture and reused. At the same time, its mechanical and biological properties remain unchanged, which allows this complex to be used at least 25 times in penicillin cleavage reactions. <Example XIX. This example serves as an illustration of how to use the enzyme-substrate complex according to the invention in the large-scale production of 6-APA, and how to reuse the complex under production conditions. The enzyme-substrate complex with an activity of 26.3 micromol / min / g produces from the resin "Amberlite IRC-50" and used in the splitting reaction 40 liters of 6.5% (w / v) benzylpenicillin solution in 0.02 m phosphate buffer. After the reaction, the complex remains in the reactor (provided with a wire mesh for this purpose) and the drained product, which is the 6-APA solution, is further processed The complex, after washing with water, can be used in further reactions Average yield of 50 consecutive (with the same complex) conversion reactions to 6-APA carried out over 6 hours each, is 95%. Example XX This example serves as an illustration of the mechanical stability of the enzyme-substrate complex shown in the example of the complex prepared in Example I from resin "A mberlite IRC-50 "and compared with the stability of a complex prepared in a similar manner, but from a different, inactive substrate, namely XAD-7 resin, which is a cross-linked acrylic ester, commercially available and manufactured by f-me Rohm and Haas Corp., United States AP. 1.6 g of a sample of each of the complexes is dispersed at 37 ° C in 8 liters of 0.2 M phosphate buffer solution, pH = 7.8, and mixed for 72 hours at 200 rpm in a fermentation vessel with baffles New Brunswick Magnaferm. Every 4 hours a sample is taken from each vat and the number of damaged resin beads is assessed visually. The number of damaged XAD-7 resin beads is significantly greater than that of IRC-50 resin (the number of damaged IRC-50 resin beads after 64 hours of experiment is 94 970 7 equal to the number of damaged XAD-7 resin beads after 8 hours of experiment). The obtained results clearly indicate a much higher mechanical strength of the IRC-50 resin. Example XXI. 235 g of Amberlite IRC-50 with an activity of 39.4 micromol / min / g prepared as described in example 1 is used in a series of experiments to cleave a 6.25% (w / v) solution of benzylpenicillin G potassium salt. Each experiment is carried out for 2 1/2 hours at 37 ° C and pH = 7.8 using 1 liter of benzylpenicillin G potassium salt solution. After each experiment, the Amberlite IRC-50 is filtered off and washed with distilled water. The filtrate and the washings are concentrated in a rotary vacuum evaporator, mixed with an equal volume of methyl isobutyl ketone, cooled to 4-10 ° C and acidified, losing the 6-aminopenicillanic acid precipitate. The precipitate is washed with a little distilled water, rinsed with acetone and dried in an oven. In the conducted experiments, the average weight yield of 6-aminopenicillanic acid was 91.3%. Example 21 I. Adsorpq of the acylase enzyme on polyethylene coated with urethane. Products Limited) and is allowed to dry within 10 days. Then, they are washed within 1 hour with a 20% aqueous solution of acetone (in% by volume), rinsed thoroughly with distilled water and subjected, within 5 hours, at a pH of 4.8-9.0, to adsorption of 5 g with 125 ml aliquots of the enzyme ( 54.0 micromol / min / ml; 3.80 micromol / min / mg protein). The urethane-coated particles are filtered off, treated for 3 hours with 75 ml of a 3.3% (w / v) solution of glutaraldehyde and adjusted to pH 7.8 as described in example I. Despite the urethane-coated particles, the resulting particles have smaller size than the particles of IRC-50. The activity of the obtained complex is 2-3 times smaller than that of the complex with IRC-50. Activity pH 4.8 .2, 6 6.0 6.4 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 micromol / min / g subst. 11.3 14.0 16.4 13.2 13.6 12.3 7.8.0 9.0 122 Example XXII I. Adsorption of acylase enzyme on nylon.Orgolac'4 (powdered nylon 6 with particle diameter <30 µm \ , ex Ato Chimie Limited, UK) is washed with 65% (w / v) formic acid solution for 1 hour and then thoroughly rinsed with distilled water. 10 g aliquot of the above substance is subjected to 16 hours, at a pH in the range 4.8-9.0, adsorption of 100 ml of enzyme (50.9 micromol / min / ml; 4.7 micromol / min / mg of protein) ). The resulting complex is filtered off, reacted within 3 hours with 100 ml of a 3.3% (w / v) solution of glutaraldehyde, drained again and washed as described in Example I. Complex with the highest activity 41.7 micromol / min. g wet substance obtained at pH 4.8 is comparable to the conventional complex obtained with IRC-50. However, in this case there is a big difference in the particle size of the nylon and the IRC50. Using IRP-64 (i.e. IRC-50 with a particle size used in farms, i.e. 0.037-0.149 mm), an acylase complex is obtained with an activity of 478 micromol / min / g of substance. moist, i.e. with an activity more than eleven times greater than when nylon was used as a substrate. Activity pH 4.8 52, 6 6.0 6.4 7.0 micromol / min / g substance. moist 41.7 36.1 26.9 22.2, 7 17.68 94 970 1 2 7.5 17.6 8.0 21.3 8.5 15.7 9.0 9.3 PL PL