JPS6371177A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はグルコシル−サイクロデキストリン（以下Ｇ、
−ＣＤと略称する）を生産する際に用いる固定化酵素に
関するものである。

〈従来の技術〉 分岐デキストリンに複合体形成剤を加えてサイクロデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼ（以下ＣＧＴａ　
ｓ　ｅと略称する）を作用させると分岐サイクロデキス
トリン（以下分岐ＣＤと略称する）が生成されると同時
に通常のＣＤも生成される。このＣＤには６個のグルコ
ースが環状にα−１，４結合したα−ＣＤと７個のグル
コースが結合したβ−ＣＤと８個のグルコースが結合し
たγ−ＣＤなどが含まれる。また前記の分岐ＣＤには、
これら各々のＣＤの環に、さらにグルコースが枝状に１
個以上６個位まで直鎖に結合したものが含まれ、その内
、グルコースが１個結合したものをＧ、−ＣＤという。

ところで、分岐ＣＤは発見されてから日も浅く、未だ実
験室的段階のもので工業的に製造されていない。分岐Ｃ
Ｄの実験室的な製造は以下の通りである。すなわち分岐
デキストリンを多量に含有する溶液に複合体形成剤を加
え、さらにＣＧＴａｓｅを加え約２４時間反応させると
、数％の分岐ＣＤと約２０％のＣＤおよび７０数％のオ
リゴ糖を含むデキストリンが生成される。次にＧ、−Ｃ
Ｄの実験室的な製造は以下の通りである。すなわち前記
分岐ＣＤとＣＤおよびオリゴ糖の混合液中のＣＧＴａ　
ｓ　ｅを失活後、ここにタカアミラーゼとグルコアミラ
ーゼを添加し、約２４時間反応させる。当該反応により
Ｇ１−ＣＤとグルコースの混合液が得られる。さらにグ
ルコースをアルコールに変化させる酵母処理および不純
物吸着のための活性炭処理を行うことにより、比較的精
製度の高いＧ、−ＣＤを得ることができる。なお、タカ
アミラーゼはＣＤをオリゴ糖に分解し、グルコアミラー
ゼは分岐ＣＤをＧ、−ＣＤにすると共に、オリゴ糖およ
びデキストリンをグルコースに分解する能力をもってい
る。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、このような方法でＧ、−〇〇を製造する
場合、各々の酵素の反応が非常に長時間かかること、ま
た各々の酵素反応がバッチ式であるため再使用ができず
使い捨てになるため、酵素費用が高（つくなどの欠点が
ある。

そこで発明者等はＧ、−ＣＤを製造するのに必要な前述
の種々の酵素を担体に固定したいわゆる固定化酵素の製
造について検討し、前述のタカアミラーゼについても行
い、タカアミラーゼを弱塩基性アニオン交換樹脂に吸着
させて、当該固定化酵素の性能について検討してみた。

その結果、当該固定化酵素の性能は、初期においてはＣ
Ｄの分解性能は優れているが、これを長時間使用した場
合、ＣＤの分解能力の低下が著しく、長時間の使用に耐
えないことが判明した。固定化酵素は、比較的長時間使
用可能であることも、重要な要件のひとつであり、長時
間の使用に耐えない固定化酵素はその経済価値が小さい
。

そこで本発明者等はＣＤの分解能力が比較的長時間持続
できる固定化酵素を得ることを目的とし、鋭意研究を行
った結果、タカアミラーゼを吸着させる担′体にアルコ
ール性水酸基を有することが、性能′低下防止に極めて
重要であることを知見した。

〈問題点を解決する手段〉 本発明はこれらの知見に基づくもので、アニオン交換基
と０．５ｍ　ｍｏ　ｉｔ／ｇ　（乾燥樹脂）以上のアル
コール注水ａ基を有する担体に、タカアミラーゼを吸着
させたことを特徴とする固定化酵素に関するものである
。

〈作用〉 以下に本発明の詳細な説明する。

前述したごとく、弱塩基性アニオン交換樹脂にタカアミ
ラーゼを吸着させた固定化酵素を用いＣＤの分解を行う
と、後述する実施例で示すごとく、２日目を過ぎると急
激にＣＤの分解率は低下する。

この原因について鋭意検討した結果、原液中の高分子物
質がイオン交換樹脂母体の細孔を封鎖することに起因し
ていると考えられる。すなわち弱塩基性アニオン交換樹
脂はスチレンとジビニルベンゼンの共重合体あるいはア
クリルとジビニルベンゼンの共重合体にアミン基をつけ
たものであり、その母体は疎水性であるため、高分子物
質が吸着され易く、また一度吸着された高分子物質は容
易に脱着されない、特に、分岐デキストリン溶液のよう
に原液中には分子量の大きい高分子物質が多量に含まれ
、当該高分子物質がイオン交換樹脂に吸着され易いので
性能低下の原因となる。

一方後述する実施例で示したごとく、当該担体としてア
ルコール性水酸基を有するものを用いると、極めて長時
間安定してＣＤを分解することができる。

担体にアルコール性水酸基を付加すると担体が親水性と
なり、そのため前述したような原液中の高分子物質が吸
着されないのか、あるいは一度吸着しても通液中にすぐ
脱着されるものと考えられる。

いずれにしてもアルコール性水酸基を有する担体を用い
ると、アルコール性水酸基を有しない通常の弱塩基性ア
ニオン交換樹脂を担体として用いる場合に比較して、大
幅にそのＣＤ分解能力を持続させることができる。

本発明に用いる担体としては、たとえば不飽和カルボン
酸グリシジルエステルたとえばメタまたはアクリル酸グ
リシジルエステル、クロトン酸グリシジルエステルなど
に、架橋剤としてジビニルベンゼン、ジメタクリル酸エ
チレングリコール、ジメタクリル酸ポリエチレングリコ
ールなどを反応させて得た母体に、ジエチルアミノエチ
ル、ジエチルアミノプロビル等の３級アミンあるいはト
リメチールアミン、トリプロピルアミン等の４級アミン
からなるアニオン交換基を付加させたちのが挙げられる
。アルコール性水酸基を付加させるには母体を重合させ
る際に用いる原料に当初からアルコール性水酸基を有す
るものを用いたり、あるいは母体にアニオン交換基を付
加する際あるいはアニオン交換基を付加した後にアルコ
ール性水酸基を生成させたりするものであり、このよう
に担体を製造する種々の過程でアルコール性水酸基を付
加させることができる。

たとえば本発明に用いるアニオン交換基とアルコール性
水酸基を有する担体のひとつの製造例を示すと以下の通
りである。

すなわちメタクリル酸グリシジルにメチルアミノエタノ
ールを反応させてアミン基を導入すると次のような反応
により Ｃ！Ｈｔ−Ｎ−（ＣＩＩ）　ｔ エポキシ環が開環してアミン基が導入されると共にアル
コール性水酸基が生成される。

本発明に用いる担体は、以上のようにしてアルコール性
水酸基を付加したものであるが、この付加量が少ないと
本発明の目的を達成することができない。

たとえばアルコール性水酸基の付加量がＱ、５ｍｍｏ１
／ｇｃ乾燥樹脂）未満である場合は、ＣＤ分解能力の持
続時間が短いので少なくとも担体に０．５　ｍｍｏＪ！
／ｇ（乾燥樹脂）以上のアルコール性水酸基を付加する
必要がある。

次に母体構造としてはゲルタイプと巨大綱目構造（ＭＲ
タイプ）があり、後者の方が粒子の細孔径が大きいので
酵素が吸着され易く有利である。また当該担体の粒子径
としては０．０５〜０．６Ｎのものを用いるが、好まし
くは０．１〜０．２鶴のものがよい。すなわち、粒子径
があまり小さいと固定化酵素をカラムに充填し、これに
原液を通液した場合、圧力損失の増大をきたす。一方、
粒子径があまり大きいと比表面積が小となり、吸着させ
ようとする酵素の量が小となり、期待する性能が得られ
なくなる。

次に、当該担体にタカアミラーゼを吸着させる方法を説
明すると、まず当該担体をアルカリ溶液で再生し、交換
基を遊離塩基形または水酸化物イオン形にしたのち、ｐ
Ｈ６前後の緩衝液、たとえば酢酸・酢酸ナトリウム溶液
、リン酸・リン酸ナトリウム溶液で洗浄し前処理を行う
。このように調整した当該担体の一定量にタカアミラー
ゼを接触させ吸着させる。

当該担体とタカアミラーゼの接触法としては、容器に本
発明に用いる担体と酵素溶液を入れ、バッチ法で攪拌し
ながら吸着させるか、あるいは当該担体をカラムに充填
し、酵素溶液を下降流または上昇流で通液する。この場
合、流出液を再循環して吸着させてもよい。接触時間と
しては０．５〜４時間で吸着させるが、好ましくは１時
間程度がよい。

次に、当該担体に吸着させるタカアミラーゼの吸着量と
してはＣＤの分解の点では多い程よいが、しかし、単位
樹脂量光たりの酵素をあまり多く吸着させようとすると
吸着率が低下し経済的に不利となる。

したがってタカアミラーゼの吸着量としては湿潤樹脂１
ｇ当たり蛋白質として１〜５０■の範囲で吸着させるの
がよく、好ましくは５〜２０■の範囲で吸着させるとよ
い、なお本発明における湿潤樹脂とは、水分含有率５０
〜６０％程度の水を吸着した一般に市販されているイオ
ン交換樹脂と同様の状態を指す。

く効果〉 以上説明したごとく、本発明に用いる担体はタカアミラ
ーゼを極めて容易に吸着させることができると共に、吸
着したタカアミラーゼは脱離することなく、また当該固
定化酵素をカラムに充填してＧ、−ＣＤ、ＣＤデキスト
リン等混合溶液を通液することにより非常に簡単な操作
でＣＤを連続的に分解することができ、かつ本発明の固
定化酵素は非常に長時間にわたり極めて安定した性能を
保持することが可能である。

したがって固定化酵素を使用することにより、バッチ法
のように酵素が１回きりの使い捨てでないため、酵素の
消費量が極めて少なく、経済的メリットは非常に大きい
。

以下に本発明の効果をより明確にするために実施例を説
明する。

実施例−１ メタクリル酸グリシジルとジメタクリル酸エチレングリ
コールの重合体にトリプロピルアミンを付加することに
より、アニオン交換基およびアルコール性水酸基を乾燥
樹脂１β当たり、それぞれ１．４２ｍｅｑ、および１．
８５ｍｍｏｌ付加させた粒径約０゜１８鶴の担体に次の
ような手順によりタカアミラーゼを吸着させた。

すなわち直径１０ｆｌ、高さ２００鶴のカラムに当該担
体４ｇ（５，２ｍｆｆ１）を充填し、次にＩＮ−水酸化
ナトリウム溶液２５ｍｊ！を通薬後、水洗して担体をＯ
Ｈ形とした０次いで１／１０Ｍ酢酸・酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６，０）５００ｍＡを通薬して前処理を行い
、当該前処理を行った担体をカラムから取り出し、１０
０ｍ１ｔのビーカーに入れ、これにタカアミラーゼ液（
活性３５２１Ｕ／ｍｆ）４ｍＡと緩衝液３　ｍ　ｌを加
え、攪拌しながら１時間反応させ、酵素を吸着させた。

なおこのようにして得た固定化酵素は湿潤担体１β当た
り蛋白質として９．２■のタカアミラーゼが吸着されて
いる。この固定化酵素を再びカラムに充填し、２００ｍ
Ａの前述の緩衝液を通薬した後、このカラムにＧ、−Ｃ
Ｄ８％、α−ＣＤ９．９％、β−ＣＤ　８．２％、γ−
ＣＤ　１．１％、デキストリンその他７２．８％を含む
固形物を固形物濃度１０％（重量％）とした混合液を温
度５０℃、通達Ｓ　Ｖ　Ｏ，２で通液し、長期間にわた
りＣＤ分解率を測定した。

比較のために弱塩基性アニオン交換樹脂Ａ（母体はスチ
レンとジビニルベンゼンの共重合体）および弱塩基性ア
ニオン交換樹脂Ｂ（母体はアクリル酸とジビニルベンゼ
ンの共重合体）を用い本発明に用いる担体と全く同様な
方法でタカアミラーゼを吸着させ、次いで前述と同様の
方法で前記混合液を通液して処理液中のＣＤの分解率を
測定した。なお、酵素吸着量は湿潤担体１β当たり蛋白
質として弱塩基性アニオン交換樹脂Ａは１０．２■、弱
塩基性アニオン交換樹脂Ｂは９．６■であった。その結
果を第１図に示す。第１図に示したＣＤ分解率は全ＣＤ
（α−ＣＤ１β−ＣＤ、ｒ−ＣＤの総和）に対するもの
である。

第１図に見られるごとく、本発明の固定化酵素は弱塩基
性アニオン交換樹脂を担体とした固定化酵素・　　に比
し、極めて優れた性能を有している。なお、本発明の固
定化酵素、比較例の固定化酵素共にＧ、−ＣＤはほとん
ど分解されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例における本発明の固定化酵素と比較例の
固定化酵素のＣＤの分解率を示すグラフであり、縦軸に
ＣＤ分解率、横軸に通液時間を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アニオン交換基と０．５ｍｍｏｌ／ｇ（乾燥樹脂）以上
   のアルコール性水酸基を有する担体に、タカアミラーゼ
   を吸着させたことを特徴とする固定化酵素。