DE2001902A1

DE2001902A1 - Verfahren zur Anreicherung von Proteinen

Info

Publication number: DE2001902A1
Application number: DE19702001902
Authority: DE
Inventors: Gotthilf Dr Rer Nat Naeher; Waldemar Thum; Dr Rer Nat Bergmeyer Ha Ulrich; Guenter Dr Rer Nat Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1970-01-16
Filing date: 1970-01-16
Publication date: 1971-08-12
Also published as: DE2001902B2; IL35497A; NL7017514A; AT307447B; IL35497A0; JPS4939836B1; CH560723A5; NL168267B; SE368408B; US3794562A; DE2001902C3; NL168267C; DK145601C; DK145601B; FR2075149A5; ZA707605B; GB1298431A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Proteinen, Unter Anreicherung im Sinne der Erfindung werden hierbei Fällung, Reinigung und Fraktionierung von Proteinen verstanden.

Für die Anreicherung von Proteinen, insbesondere, aus biologischem Material, sind bereits mehrere Anreicherungsmittel bzw. Verfahren bekannt.. Beispiele für geeignete Mittel sind Ammoniumsulfat, anorganisches Gel, Aktivkohle, Chromatographie an Aus- <| tauschern und Molekularsieben und einige andere. In Anbetracht der außerordentlichen Vielfalt von natürlich vorkommenden Proteinen und ihrer Begleitstoffe macht sich jedoch häufig das Fehlen von Variationsmöglichkeiten bei der Auftrennung bzw. Reinigung sehr nachteilig bemerkbar. Aus der an sich schon begrenzten Anzahl von Verfahren und Mitteln zur Anreicherung von Proteinen erweisen sich zumeist nur ganz wenige in einem speziellen Fall als brauchbar, war zur Folge hat, daß vielfach die gleichen Reinigungsschritte wiederholt werden müssen, um eine einigermaßen befriedigende Anreicherung su erzielen. Zumeist sind die erzielten Anreicherungsgrade zudem gering und die spätere Entfernung des zur Anreicherung verwendeten Mittels erfor-

0 ^

dert besondere Aufwendungen, Eindampfen großer Flüssigkeitsvolumina und dgl. Die verschiedenen bekannten Verfahren zur Anreicherung von Proteinen weisen daher im großen und ganzen gesehen stets die gleichen Verfahrensschritte auf, die sich in großer Ähnlichkeit ständig wiederholen.

Es besteht daher Bedarf nach weiteren Verfahren zur Anreicherung von Proteinen, welche eine bessere Variation und daher auch wirksamere Gestaltung der Proteinanreicherung gestatten und die Nachteile der bi3her bekannten Methoden und Mittel zur Anreicherung von Proteinen nicht oder nur in geringerem Grade aufweisen.

Erfindungsgemäß wird zur Anreicherung von gelösten, insbesondere von enzymatisch aktiven Proteinen, wasserlösliches Polyäthylenimin verwendet.

Es war bereits bekannt, Polyäthylenimin als Plockungshilfsmittel zu verwenden, z.B. zur Klärung von Abwasser, zur Verbesserung der Filtrierbarkeit von Niederschlägen und dgl. Ferner wurde bereits vorgeschlagen, unlöslich gemachtes Polyätliylenimin nach Art eines Ionenaustauschers zur Chromatographie von Nucleinsäuren zu verwenden. Polyäthylenimin wird außerdem als Haftvermittler in verschiedenen Industriezweigen, z.B. für Fasern, Farben, Klebstoffe, Lacke und dgl. verwendet. Bei Kenntnis dieser Verwendungsarten konnte nicht erwartet werden, daß sich wasserlösliches Polyäthylenimin besonders gut zur Anreicherung von gelösten Proteinen eignet.

Für die Erfindung sind als Polyäthylenimin die handelsüblichen Sorten von schwachbasisch über mittelbasisch bis starkbasisch geeignet. Die erzielbare Trennwirkung hängt bis zu einem gewissen Grade vom Molekulargewicht ab, so daß mit bestimmten Molekulargewichten je nach den speziellen Proteinen oft besonders günstige Anreicherungswirkungen erzielt v/erden können. Als brauchbar erwiesen sich grundsätzlich alle untersuchten

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wasserlöslichen Polyäthyienimine, beispielsweise' solche mit Molekulargewichten zwischen 600 und 100000 und darüber, entsprechend Brookfield-Viskositäten von 500 bis 25 000 cps bei 25^QC. Auch die üblichen modifizierten Polyäthyienimine, -beispielsweise teilweise oder vollständig äthoxylierte Polyäthyienimine, können verwendet werden.

Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fällung von Proteinen wird der Proteinlösung eine geringe Menge PoIy-Sthylenimin zugesetzt, worauf das Protein ausfällt. Die Ausfällung findet bei geringer Ionenkonzentration und hoher Verdünnung in Bezug auf Polyäthylenimin statt. Durch Erhöhung der Ionenkonzentration kann aus dem Niederschlag das gefällte Protein wieder in Lösung gebracht werden. Zurück bleibt hierbei gewöhnlich ein an Polyäthylenimin reicher, am gewünschten, z.B. aktiven Protein armer Niederschlag. Die Fällung ist abhängig vom pH-Wertbereich und erfolgt im allgemeinen zwischen pH 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen pH 5,5 und 8_r5. Über und unter den angegebenen Grenzwerten geht gefälltes Protein nor- · malerweise wieder in Lösung-.

Die Trennung des Protein und Polyäthylenimin enthaltenden Niederschlages kann nach den üblichen Methoden der Proteinanreicherung erfolgen. Beispielsweise kann das Polyäthylenimin am Kationenaustauscher oder umgekehrt das Protein am Anionenaustauscher abgetrennt werden. Weitere Beispiele für mögliche Trennungen sind Amnionsulfatfällung, Fällung mit organischen Lösungsmittels, Molekularsiebtrennung (insbesondere wenn das verwendete Polyäthylenimin im Vergleich zum gefällten Protein ein sehr großes bzw. sehr geringes Molekulargewicht aufweist) und dgl.

Unter Anreicherung im Sinne der Erfindung fällt auch die Pro-· teinreinigung. Die Reinigung kann bestehen ^us einer Fällung, wie sie vorstehend beschrieben,wird, wobei gewisse Verunreinigungen gelöst zurückbleiben. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit

; 109833/0960

besteht in der sogenannten negativen Fällung. Hierbei werden durch die Zugabe des Polyäthylenimins zuerst die Verunreinigungen gefällt, während das gewünschte Protein im Überstand verbleibt und beispielsweise nach Abtrennung der ersten Fällung getrennt ausgefällt wird. Weiter fällt unter den Begriff der Reinigung die Gesamtausfällung sowohl von Ballaststoffen als auch von Protein und anschließende selektive Wiederauflösung nur des gewünschten Proteins, während die Ballaststoffe ebenso wie gegebenenfalls inaktive Proteine im Niederschlag verbleiben. Beispielsweise können Ballaststoffe wie unten noch näher defl-, niert bei hohen Ionenkonzentrationen ausfallen, bei denen das gewünschte Protein bzw. die Proteine löslich bleiben. Wenn anschließend die Ionenkonzentration verringert wird, so fallen auch die Proteine aus.

Unter Anreicherung im Sinne der Erfindung wird schließlich auch die Fraktionierung verstanden. Fraktionierung ist die Abtrennung inaktiver Proteine vom gewünschten aktiven Protein. Unter inaktivem Protein werden hierbei auch an sich aktive Proteine verstanden, die jedoch nicht die im speziellen Fall gesuchte bzw. gewünschte Wirksamkeit aufweisen. Die Fraktionierung erfo3.gt durch Zugabe steigender Mengen an Polyäthylenimin, wobei die verschiedenen Proteine nacheinander mit überraschend guter Trennwirkung ausfallen.

Unter Ballaststoffen, d.h. denjenigen Stoffen, die beim Reinigungsschritt im Sinne der Erfindung vom aktiven Protein abgetrennt werden, sind Nucleinsäuren, Zellwandbestandteile wie Polyuronsäuren etc. und Plasmabestandteile, ausgenommen die Proteine selbst, zu verstehen.

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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nur sehr geringe Mengen an Polyäthylenimin zugesetzt werden müssen, um die gewünschten Trennwirkungen zu erzielen» So genügen bei niedrigen Salzkonzentrationen häufig .schon Mengen in der Größenordnung von 0,005.bis 1 .VoI.-jS einer 1Obigen Polyäthyleniminlösung in Wasser, um vollständige Fällung oder Fraktionierung bestimmter Proteine zu erzielen. Andererseits können zur Ausfällung von Ballaststoffen bei relativ hohen Salzaktivitäten in der Lösung auch erheblich größere Mengen an Polyäthyleniminlösung zugesetzt werden, beispielsweise 15 bis 20 Vol.-$ einer 10bigen Lösung oder mehr. Das " erfindungsgemäße Verfahren ist außerordentlich schonend und verläuft daher unter denkbar bester Erhaltung der Aktivität der Proteine. Wie die folgenden Beispiele zeigen, können bei negativen Anreicherungsschritten Aktivitätsausbeuten bis 100 $> erreicht werden, während bei positiven Anreicherungsschritten, also unter Ausfällung des jeweils gewünschten Proteins, Aktivitätsausbeuten bis zu 90 io erzielt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1

Trennung von Albumin und Ribonucleinsäure (HIiS-) mittels Polyäthylenimin (PEI), Molgewicht ca. 50000

500 mg Serum-Albumin (entspricht 400 mg Protein nach der Biuret-Methode) und 500 mg Ribonucleinsäure werden in 50 ml 0,05 M Phosphat-Puffer, pH =7,0, gelöst und der pH-Wert mit 2 N NaOH auf 7,0 nachgestellt. Durch stufenweise Zugabe von PEI (Molgewicht 50000; tO?Sige Lösung, pH = 7,0) fällt nur RNS, dagegen kein Albumin. Bei Verringerung der Puffer-Molarität durch Verdünnen mit Wasser fällt anschließend'das Albumin aus (Tab. 1). .

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200)902

Tabelle 1 RNS- und Albumin-Trennune mittels PEI

Vol.-Ji PEI	Phosphat	Σ mg PJTS	"Σ mg Protein
	M	im Überstand	im Überstand
O	0,05	500	400
3	0,05	275	390
6	0,05	75	390
9	0,05	50	380
12	0,05	30	380
15	0,05	30	380
3	0,01 ⁺	5	40

⁺ Der Überstand der Fällung mit 15 Vol.-$ PEI wurde mit Wasser entsprechend verdünnt.

Beispiel 2

Isolierung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) aus Bäckerhefe

Zu 1 1 entsalztem Wasser, enthaltend 20 g Na₂HPO,.12H₂O, und 370 mg Trilon werden 340 g getrocknete Bäckerhefe suspendiert und 4 Stunden bei 38⁰C inkubiert. Danach wird 1 1 Wasser von +4⁰C zugesetzt, gerührt und zentrifugiert. Der erhaltene Überstand enthält neben anderen Hefe-Bestandteilen G-6-PDH und Hexokinase. Es werden langsam 0,12 Volumen Polyäthylenimin (PEI), Molgewicht ca. 50000 (10#ige Lösung in H₂O), pH = 7,0, zugesetzt. Es entsteht ein Niederschlag, der Nucleinsäuren und Proteasen enthält. Die PEI-Fällung kann auch direkt im inkubierten Hefegärsaft ohne vorherige Zentrifugation durchgeführt werden. Der PEI-Niederschlag ist grobflockig und läßt sich zu-

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eammen mit aufgeplatzten Hefezellen sehr gut zentrifugieren. Die auf diese Weise vorgereinigte Enzymlösung (Überstand) wird mit festem Ammoniumsulfat auf 3.05 M eingestellt, der auftretende Niederschlag enthält die beiden Enzyme. Nach Zentrifugätion wird der Niederschlag mit 2.10" M MgCl₂-IiOsung, enthaltend 1.1Q~⁵ M Trilon und 1.10"⁵ M Na-Azid, pH = 6,5, aufgenommen und 12 Stunden gegenLeitungswasser dialysiert.

Als weiterer Reinigungsschritt wird das Dialysat (ca. 2,0 1, 0,01 M Ammoniumsulfat-Gehalt) mit 0,010 - 0,020 Volumen obiger PEI-Lösung versetzt, daß gerade noch ca. 5 # der G-6-PDH im Überstand verbleiben. Es wird zwischen pH = 6,0 bis 7,5, vorzugsweise pH = 7,0, gearbeitet. Der erhaltene Überstand wird verworfen.

Der PEI-Enzym-Niedersehlag wird einmal mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH S=- 7,6, auf suspendiert und zentrifugiert; das Waschwasser enthält ca. 2 $ der Enzymaktivität.

Zur Elution wird ein 0,03 M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, verwendet, bei Raumtemperatur ca. 15 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der Überstand enthält ca. 50 bis 60 # der G-6-PDH-Aktivität, bezogen auf die Aktivität nach Dialyse. Die G-6-PDH | wird bei diesem Schritt 7fach angereicliert (Tab. 2).

" Tabelle 2

positiver PSI-Schritt beim S-6-PDH-Yerfahren

Schritt U/mg U/mg '. Protein a) j» Protein Tj) #

nach Dialyse

PEI-Überstand Waschung 0,01 M, pH = 7,6 Eluat 0,03 M, pH = 7,6

1Ö9833/Ö96G"

0	,53	100	0,	50	100
		16	-		1,47
		1,8	-		0,70
3	,8	45	2,	92	53

-δα) = 0,85 % PEI-Zugabe einer 100#igen Lösung, pH = 7,0 b) = 1,23 # " " " "

Beispiel 3 · ,

Isolierung von Hexokinase (HK) aus Bäckerhefe

Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben gearbeitet unter Her- , stellung eines Dialysats.

Das Dialysat, 0,01 M Ammoniumsulfat-G-ehalt ca. 2,0 1, wird mit 0,009 Volumen Polyäthylenimin (PEl) Molgewicht ca. 50000, pH = 7,0 (iO$ige Lösung in HpO) versetzt, daß noch ca. 10 $ der HK-Aktivität im Überstand verbleiben. Zur Waschung wird der PEI-HK-Niederschlag einmal mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH - 7,6, aufsuspendiert und zentrifugiert. Das Waschwasser wird verworfen.

Der Enzym-Niederschlag wird mit 0,025 M Phosphat-Puffer, pH =7,6, aufgenommen, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend zentrifugiert. Der Überstand enthält ca. 40 $> der HK-Aktivität, bezogen auf das Dialysat; die Reinigung bei diesem Schritt ist das 4fache (Tab. 3).

Tabelle 3 positiver PEI-Schritt bei HK

Schritt	M, pH =	7,6	tJ/mg	Protein	t	5	100	8
nach Dialyse	; pH = 7,	6	2,	46		10,	1
PEI-Überstand		0,	39	10,	4
Waschung 0,01		ma	33,
Eluat 0,025 M		10,

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Beispiel 4

Trennung von Ribonucleinsäure (ENS) und Proteasen (mit Casein als Substrat gemessen) sowie Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase durch einen negativen Polyathylenimin-Schritt'

100 ml abzentrifugierter Hefe-Gärsaft gemäß Beispiel 2 werden stufenweise mit PEI (Molgewicht ca. 50000 (1O$ige lösung), pH = 7,0 versetzt. Die Molarität an Phosphat-Puffer und anderen Salzen war insgesamt 0,08 M (gemessener leitfähigkeitswert, bezogen auf Phosphat-Puffer). !Tabelle 4 zeigt die bei-zunehmendem PEI-Gehalt erzielte Fraktionierung.

	t> PEI	(100 ml Gärsaft)	sowie HK	und G-6-PDH
		y mg RNS E m£ Proteasen
Tabelle 4		185 0,350	Γ ü HK	ru G-6-PDH
Fraktionierung von RNS und Proteasen		45 0,147	4,3.10³	7,8.1O²
		6 0,035	4,2.1O³	7,8.1O²
VoI. -^c/	15' 0,020	4,2.10?	7,6.1O²
O		4,2.1O³	7,6.10²
4
8
12

RNS und Proteasen werden also bei 8 bis 12 Vol.-# PEI fast vollständig ausgefällt, während HK und G-6-PDH praktisch verlustlos im Überstand verbleiben.

Beispiel 5

Glucose-Oxydase aus Aspergillus niger

1kg abgepreßtes Mycel von A. niger werden mit 2 1 vollentsalztem Wasser angerührt und bei 300 - 400 atü durch die Hochdruckdispersion homogenisiert. , .

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2Ü0I902

- ίο -

Das Homogenisat wird mit 0,2 Vol.-$ einer 10bigen PEI-Lösung (MG 1800) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt und nach ca. 30 Minuten Rühren abfiltriert. Das blanke IPiltrat enthält die Glucose-Oxydase, die Ballaststoffe befinden sich im Niederschlag, der abgetrennt und verworfen wird.

Der salzarme Überstand (Leitfähigkeit bei 2O⁰C, ca. 2 χ 10³ μείβΐηβηΒ) wird mit 0,1 Vol.-^ einer 10$igen PEI-Lösung (MG 30000-60000) bei pH 7,0 - 7,5 versetzt. Nach ca. 30 Minuten Rühren verbleiben im blank zentrifugierten Überstand <8 $ der Aktivität der Glucose-Oxydase.

Der Niederschlag wird mit 0,03 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,6 homogenisiert, 10 Minuten gerührt und blank zentrifugiert. Der inaktive Niederschlag wird verworfen, der Überstand eingefroren und lyophilisiert. Tabelle 5 zeigt die in den einzelnen Verfahrensstufen erhaltene Reinigung und die Ausbeute.

Tabelle 5

Aufarbeitung Volumen TJ

in ml

mg Trockengewicht ⁺

1. Aufschluß

und Extraktion 2000 1,78.10⁴ 2.900

2. Abtrennung von Ballaststoffen durch

PEI (Oberst.) 1950 1,6 .1O⁴ 2.240

3. Fällung der Glucose-Oxydase mit PEI

(Überstand) 1870

4. Extraktion der Glucose-Oxydase

5. Glucose-Oxydase nach Lyophilisation

1,3 .1O³ 140 1.15.1Ο⁴

1,22.10*

U/mg Ausbeute Trockengew. %

5,35

11,5

100 $

90 ύ

250

65 t 48,5 68 i

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2ÜÜ-19Q2

⁺ Die TrockengewichtsbeStimmungen erfolgten nach erschöpfender "■» Dialyse gegen vollentsalztes Wasser und anschließender Lyophilisation. ·

Beispiel 6

Glycerokinase aus Candida mycoderma

Vergleich der Enzymisolierungen nach bekannten Verfahren und unter Verwendung von Polyäthyleniniin

■"■-'. * A. Isolierung nach dem Stand der Technik

Extraktion des Mycels:

60 g des getrockneten Mycels werden in 600 ml 0,05 M Dikalium-

—2 —3 ■ .. ■ .

hydrogenphosphat, 10 M Glycerin und 10 -M Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) 3 Stunden bei 37⁰C extrahiert. Dann wird mit 600 ml 10 M Glycerin und 10"'.M EDTA verdünnt und vom Mycel abzentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen.

Der erhaltene Extrakt wird 60 Minuten auf 60⁰C erhitzt, auf 1O⁰C abgekühlt und vom denaturierten Protein abzentrifugiert.

Der Überstand der Erhitzung wird mit Ammoniumsulfat bis 3_f2 M * gesättigt und die ausgefällte Glycerokinase abzentrifugiert. Der inaktive Überstand wird verworfen. Im Niederschlag wird die Glycerokinase mit 0,0/5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 10 M Glycerin und 10"' M EDTA aufgenommen und bei O⁰C insgesamt 14 Stunden gegen denselben Puffer dialysiert.

B. Erfindungsgemäße Isolierung der Glycerokinase unter Verwendung von Polyäthylehimin

60 g des getrockneten Mycels werden wie unter A, beschrieben extrahiert, verdünnt und.zentrifugiert.

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Der blanke Extrakt wird mit 0,3 V0I.-9S einer 1Oxigen PEI-Lösung (MG 30000 - 60000) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt. Nach ca. 30 Minuten Rühren verbleibt im blank zentrifugieren Überstand die Aktivität der Glycerokinase.

1 Teil Überstand wird nun mit 1 Teil kalter 10 M Glycerin und 1O~* M EDTA-Lösung verdünnt. Dann werden 2,75 Vol.-% der obigen 10bigen PEI-Lösung bei pH 7,0 bis 7,5 zugesetzt. Der Überstand wird abzentrifugiert und verworfen.

Der Niederschlag wird mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 extrahiert und zentrifugiert. Der abzentrifugierte Niederschlag wird verworfen. Im Überstand wird die Glycerokinase mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M ausgefällt. Der Niederschlag wird konzentriert in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0, 10 M Glycerin und 10 EDTA aufgenommen und 14 Stunden bei O⁰C gegen denselben Puffer dialysiert.

Die nachstehende Tabelle 6 zeigt die nach dem bekannten und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse und läßt die überlegene Ausbeute und Reinigung bei ler^indungsgemäßem Arbeiten klar erkennen. So wird nach der Erfindung bei 57 $> Ausbeute eine mehr als 12fache Anreicherung erzielt, während das bekannte Verfahren bei 22 # Ausbeute nur 4,5fache Anreicherung ergibt.

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Tabelle 6
T, Isolierung der Glyeerokinas.e nach dem bekannten Verfahren (DAS 1 238 422)

g Volumen Summe Summe mg spez. Aktivität. Ausbeute in ml Einheiten Protein in Einheiten/mg in $>

1,1 Extraktion des ■ '- .■ , , ' '■ ' ' . ■■ '. ■ ' ■ ' .. :,^:

■ tercels 1085 7,7 » '10^ 3.720 1,98 : 100

,«■* 1.2 Erhitzung des ~

m '■ Extraktes . 1030 4,1 ,' 10^ 246 16,6" 53,3

m' 1*3 Ammoniumsulfate .

t*5 ' fällung und *

üt , Malyse 50 2,1 . 10·³ 236 8,9 ^; 22,3

H 2. Isolierung der G-lyqerokinase unter Verwendung von Polyäthylenimin

"m ' ',' ■ ' ■■' ' ■ . ■ ■ ■ ■ ■

%*\ Extraktion des ,

fiyceis 1035 7,7 · 10^ 3.720 1,98 100

2«Z Abtrennung von ,

Ballaststoffen

dureji Polyäthy- '■ ,

leniBiin 1000 8,0 . 10⁵ 2.130 3,74 104

2.3 Fällung der
eerOkinase mit ·

Polyäthylenimin. ·

Gelöster liieder- , <*

schlag . 42 6,36. 10⁵ 328 19,4

2.4 Ammoniumsulfat-

fällung und «

!Dialyse 28 4,39. 10⁵ 180 24,2

	ο
	' —^
81,5
	ο
	NO
57,5

2Ü019Ü2

-H-

Beispiel 7

Diaphorase aus Schweineherz

Nach Zerkleinerung von 1 kg gefrorenen Schweineherzen, Auspressen des Fleischbreies, Extraktion des festen Rückstandes, Hitzebehandlung des so erhaltenen Extraktes, Ammonsulfat-Fraktionierung bis 3,2 M und Dialyse erhält man eine, bezogen auf das Protein, weitestgehend angereicherte Diaphorase, die jedoch noch erhebliche Mengen Ballaststoffe enthält, die nicht, als Protein nachweisbar sind. Zur Entfernung dieser Ballaststoffe erfolgt der Polyäthylenimin-Schritt.

Das Dialysat wird 1:1 mit 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 verdünnt. Dann werden 0,5 Vol.-56 einer 10bigen PEI-Lösung (MG 1800j pH mit 2 N Natronlauge auf 7,0 eingestellt) zugesetzt, wobei die Ballaststoffe ausfallen. Der inaktive Niederschlag wird absentrifugiert und die Diaphorase im Oberstand eingefroren und lyophilisiert.

Tabelle 7 zeigt die erhaltenen Werte bezüglich Ausbeute und Anreicherung.

Tabelle 7

Aufarbeitung spez. Aktivität Aktivität in Ausbeute

in Einheiten/ Einheiten/mg % mg Protein Lyophilisat

t. niederschlag
3,2 M Ammoniumsulfat 0,70 - 100

2. Dialyse 0,86 0,384 97

3· Überstand nach

PEI-Pällung 0,9 " 0,657 91 .

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Claims

/. \y Verfahren zur Anreicherung von gelösten, insbesondere von enzymatisch aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß wasserlösliches,Polyäthylenimin verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenimin in Form einer verdünnten wässrigen Lösung zugesetzt wird.

'■'■"■ ^v ■■ ' '^: · i
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein ™ Polyäthylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen

600 und 100 000 verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-Wert zwischen 5,0 und 9,0 gearbeitet wird. .

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